專利名稱：小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是病毒抗體檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)對綿羊和山羊的發(fā)病率和死亡率分別高達100%和90%，在發(fā)展中國家引起嚴(yán)重的社會經(jīng)濟問題，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為重要動物疾病。該病首次報道在科特迪瓦，現(xiàn)發(fā)生在撒哈拉以南和赤道以北的多數(shù)非洲國家，中東到土耳其的幾乎全部國家，在印度、南亞、西亞也廣泛傳播。2007 年7月，該疫病首次傳入我國西藏地區(qū)。小反芻獸疫病毒抗體檢測方法，世界動物衛(wèi)生組織推薦使用的方法為病毒中和試驗(VN)和競爭ELISA (c-ELISA)，一般條件下能區(qū)分小反芻獸疫和牛瘟病毒血清抗體，且由于c-ELISA特異性和敏感性更高，且適合于檢測大量的樣品，時間周期相對較短，因此廣泛應(yīng)用于小反芻獸疫病毒抗體檢測。小反芻獸疫c-ELISA診斷試劑盒，國內(nèi)尚未見商品化的相關(guān)產(chǎn)品，在國際上通用的為法國BIRAD實驗室研制的小反芻獸疫c-ELISA試劑盒(Libeau. et al.，1995)，該診斷試劑盒也是我國小反芻獸疫疫病的主要診斷試劑。參考文獻Libeau G, Prehaud C, Lancelot R, et al. Development of a competitive ELISA for detecting antibodies to the peste des petits ruminants virus using a recombinant nucleoprotein[J]. Res Vet Sci， 1995，58，50-55。在應(yīng)用法國BIRAD實驗室研制的小反芻獸疫c-ELISA診斷試劑盒在國內(nèi)相應(yīng)疫病的調(diào)查中，我們發(fā)現(xiàn)此試劑盒的購買每次均需要大批量的從國外訂購，無小包裝，經(jīng)濟成本較高，其試劑盒中的底物液等均需要現(xiàn)配置，操作較繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種針對核蛋白的特異性單抗而研制的抗體檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供這種抗體檢測試劑盒的制備方法。本發(fā)明所述的小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒主要包括分別放置的小反芻獸疫核蛋白抗原和小反芻獸疫單克隆抗體；所述的小反芻獸疫核蛋白抗原是由昆蟲細(xì)胞表達的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI登錄號為 X74443. 2，表達蛋白分子量約61. 3 kDa,由1578bp核酸組成，編碼5 個氨基酸；所述的小反芻獸疫單克隆抗體是針對小反芻獸疫Mgeria75/1株核蛋白的特異性單克隆抗體，抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈分子量約^ku和^ku,染色體數(shù)目約99-104條，相對親和力指數(shù)為 1. 0 mol/L0本發(fā)明所述的小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒包括分別放置的小反芻獸疫核蛋白抗原、小反芻獸疫單克隆抗體、稀釋液、強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清、HRP 羊抗鼠二抗、20倍濃縮洗滌液、底物液、終止液和酶鏈免疫吸附板；所述的小反芻獸疫核蛋
4白抗原是由昆蟲細(xì)胞表達的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI 登錄號為X74443. 2，表達蛋白分子量約61. 3 kDa,由1578bp核酸組成，編碼5 個氨基酸；所述的小反芻獸疫單克隆抗體是針對小反芻獸疫Mgeria75/1株核蛋白的特異性單克隆抗體，抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈分子量約^ku和^ku,染色體數(shù)目約99-104條，相對親和力指數(shù)為1. 0 mol/ ；所述的稀釋液配方為=NaCl 8g，KH2PO4 0. 24g, Na2HPO4 1. 44g， KCl 0. 2g，牛血清白蛋白BSA 30 g，山羊PPRV陰性、Vero細(xì)胞抗體陽性血清10 mL，加蒸餾水至1000mL。 本發(fā)明所述的小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒各組成部分的體積或數(shù)量如下
權(quán)利要求
1.一種小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于主要包括分別放置的小反芻獸疫核蛋白抗原和小反芻獸疫單克隆抗體；所述的小反芻獸疫核蛋白抗原是由昆蟲細(xì)胞表達的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI登錄號為 父74443.2，表達蛋白分子量約61.3 kDa，由1578bp核酸組成，編碼5 個氨基酸；所述的小反芻獸疫單克隆抗體是針對小反芻獸疫Mgeria75/1株核蛋白的特異性單克隆抗體，抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈分子量約^ku和^ku,染色體數(shù)目約99-104條，相對親和力指數(shù)為 1. 0 mol/L0
2.一種小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于包括分別放置的小反芻獸疫核蛋白抗原、小反芻獸疫單克隆抗體、稀釋液、強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清、HRP 羊抗鼠二抗、20倍濃縮洗滌液、底物液、終止液和酶鏈免疫吸附板；所述的小反芻獸疫核蛋白抗原是由昆蟲細(xì)胞表達的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI 登錄號為X74443. 2，表達蛋白分子量約61. 3 kDa,由1578bp核酸組成，編碼5 個氨基酸；所述的小反芻獸疫單克隆抗體是針對小反芻獸疫Mgeria75/1株核蛋白的特異性單克隆抗體，抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈分子量約^ku和^ku,染色體數(shù)目約99-104條，相對親和力指數(shù)為1. 0 mol/ ；所述的稀釋液配方為=NaCl 8g，KH2PO4 0. 24g, Na2HPO4 1. 44g， KCl 0. 2g，牛血清白蛋白BSA 30 g，山羊PPRV陰性、Vero細(xì)胞抗體陽性血清10 mL，加蒸餾水至1000mL。
3.如權(quán)利要求2所述的小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的檢測試劑盒各組成部分的體積或數(shù)量如下
4.權(quán)利要求1所述的小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒的制備方法由以下步驟制備一、小反芻獸疫核蛋白抗原的制備利用昆蟲桿狀病毒表達載體pFastBacHTA表達小反芻獸疫疫苗株Ni ger ia75/1的 N基因，在獲得表達的桿狀病毒后，大量感染sf9細(xì)胞，反復(fù)凍融，SOOOrpm離心，取上清， 35000rpm離心，按離心前后體積300 :1，用PBS溶解沉淀蛋白，用0. 05mol/L PH為9. 6碳酸鹽緩沖液 NaHCO3 1. 465g,Na2CO3 0. 795g 或 Na2CO3. IOH2O 1. 2g、水 500mL 稀釋成 2. 9 μ g/ mL，分裝即得；二、小反芻獸疫單克隆抗體的制備使用純化的小反芻獸疫病毒免疫小鼠并取免疫小鼠的脾細(xì)胞，將所述脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在融合劑下融合后篩選獲得雜交瘤細(xì)胞，收集雜交瘤細(xì)胞上清液制備抗小反芻獸疫單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是病毒抗體檢測領(lǐng)域。本發(fā)明所述的小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒包括分別放置的小反芻獸疫核蛋白抗原、小反芻獸疫單克隆抗體、稀釋液、強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清、HRP羊抗鼠二抗、20倍濃縮洗滌液、底物液、終止液和酶鏈免疫吸附板。本發(fā)明通過實驗優(yōu)化，確定了試劑盒中各組分的最佳配比條件。其試劑盒可用于動物小反芻獸疫病毒抗體的快速診斷、檢測，尤其適合于小反芻獸疫流行病學(xué)調(diào)查時大量樣本的抗體檢測。本發(fā)明的小反芻獸疫b-ELISA檢測方法，檢測原理、實驗操作程序等均不同于BIRAD實驗室的c-ELISA檢測方法，試劑盒包含的小反芻獸疫核蛋白抗原、小反芻獸疫單克隆抗體均為自行研制。組裝試劑盒的檢測敏感性、特異性等指標(biāo)均與國際認(rèn)可的BIRAD實驗室的c-ELISA檢測方法相同。
文檔編號G01N33/535GK102419369SQ20111023694
公開日2012年4月18日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者葉玲玲, 呂建強, 周曉黎, 孫潔, 尹尚蓮, 徐維加, 徐自忠, 楊俊興, 楊建民, 祝賀, 艾軍, 花群義, 董俊 申請人:云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心