一種應(yīng)用rpa技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸醫(yī)病原微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種檢測(cè)小反芻獸疫 病毒的引物組和探針。即應(yīng)用重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術(shù)快速檢測(cè)小反芻獸疫病毒的引物、探針和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小反會(huì)獸疫（Peste des petits ruminants，PPR)是由小反會(huì)獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的一種感染山羊和綿羊的烈性傳染病，該病主要 感染綿羊、山羊和野生小反芻動(dòng)物。小反芻獸疫主要在中非、西非、東非、中東和南亞等地區(qū) 流行。我國(guó)于2007年首先發(fā)現(xiàn)該病，隨后又有幾次小規(guī)模暴發(fā)，但只局限在西藏阿里地區(qū)。 自2013年重新傳入我國(guó)以來(lái)，迅速傳播到我國(guó)的大部分省區(qū)，給我國(guó)的養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng) 濟(jì)損失。雖然該病的臨床癥狀很明顯，但是仍有可能與其他疫病如羊支原體肺炎、羊口蹄疫 和羊口瘡等相混淆。因此，急需快速確診該病的檢測(cè)技術(shù)。
[0003]目前病毒核酸檢測(cè)的主要方法為PCR法，常規(guī)的PCR檢測(cè)需要特殊的熱循環(huán)儀以 及繁瑣的試驗(yàn)程序，難以滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)或田間條件下的檢測(cè)需要。近年來(lái)，一些核酸等溫?cái)U(kuò)增技 術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)，這些技術(shù)不需要昂貴的PCR儀，并且可以在短時(shí)間內(nèi)快速大量擴(kuò)增出目 的片段，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。其中的RPA技術(shù)更是被稱(chēng)為可以替代PCR的核 酸檢測(cè)技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴(lài)于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單 鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳 反應(yīng)溫度在37°C左右。RPA技術(shù)是模擬了生物體內(nèi)DNA復(fù)制、基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò) 增原理發(fā)展而來(lái)。它可以在非常短的時(shí)間內(nèi)使目的基因以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，若配合熒光標(biāo)記的 探針和熒光信號(hào)檢測(cè)儀便可實(shí)現(xiàn)對(duì)模板擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。RPA技術(shù)大大減少了檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn) 化了反應(yīng)程序，結(jié)合快速核酸提取技術(shù)和便攜式的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)設(shè)備后非常適于現(xiàn)場(chǎng)或田 間檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。利用RPA技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒具有重大的臨床應(yīng)用價(jià) 值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用RPA技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的引物及探針，從而 彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明提供的引物和探針，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如 SEQ ID No. 2所示，探針序列如SEQ ID No. 3所示。
[0006] 探針PPRV-RPAp中的第30個(gè)堿基標(biāo)記BHQl淬滅基團(tuán)，第32位堿基標(biāo)記FAM發(fā)光 基團(tuán)，3 ^末端進(jìn)行磷酸化修飾。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種通過(guò)重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的方 法：提取待檢樣品中的RNA作為模板，利用引物和探針進(jìn)行熒光快速檢測(cè)，如果有明顯的熒 光曲線(xiàn)擴(kuò)增，則說(shuō)明所檢測(cè)樣品中含有小反芻獸疫病毒核酸。實(shí)施步驟為：在I. 5ml離心 管中加入再水化緩沖液29. 5 μ 1，Transcriptor反轉(zhuǎn)錄酶（Roche)O. 5 μ 1，10 μΜ的引物各 2. 1 μ 1，10 μ M的TwistAmp exo探針0· 6 μ 1，模板RNA和dH20 12. 7 μ 1，渦旋混勻短暫離心 后，將前述混合液加入到RPA凍干酶球的反應(yīng)管中，加入280mM的醋酸鎂溶液2. 5 μ 1，混勻， 將反應(yīng)管置于RPA擴(kuò)增檢測(cè)儀或熒光定量PCR儀中，37°C反應(yīng)15分鐘。
[0008] 本發(fā)明方法根據(jù)小反芻獸疫病毒基因組序列設(shè)計(jì)了大量RPA引物和探針，從中篩 選出一對(duì)可快速有效檢測(cè)小反芻獸疫病毒核酸的引物及探針組合。利用該套引物和探針進(jìn) 行快速檢測(cè)，以國(guó)內(nèi)分離的西藏株（Tibet 2007)和新疆株（XJ 2013)小反芻獸疫病毒核酸 RNA為模板均可以得到明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊傳染性膿皰病毒、 山羊支原體和藍(lán)舌病病毒為模板進(jìn)行反應(yīng)均沒(méi)有擴(kuò)增曲線(xiàn)。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為小反芻獸疫病毒特異性檢測(cè)，其中1為新疆株P(guān)PRV，2為西藏株P(guān)PRV，3-7 分別為口蹄疫病毒、羊傳染性膿皰病毒、山羊支原體、藍(lán)舌病病毒和健康羊淋巴結(jié)。
[0010] 圖2為檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)圖，使用新疆株小反芻獸疫病毒為模板，拷貝數(shù)依次從IO5 到10°個(gè)拷貝時(shí)的檢測(cè)陽(yáng)性率。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】的詳細(xì)描述進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限 制，僅作為示例。
[0012] 實(shí)施例1 :檢測(cè)方法的建立
[0013] 根據(jù)GenBank中小反芻獸疫病毒基因組序列，設(shè)計(jì)引物和探針。引物長(zhǎng)度約為 30-35nt，由于目前沒(méi)有針對(duì)RPA的引物設(shè)計(jì)軟件，本發(fā)明前期工作過(guò)程中設(shè)計(jì)合成了大量 引物，從中篩選出一對(duì)靈敏度高且特異性好的引物，引物和探針序列SEQ ID No :1、SEQ ID No :2、和 SEQ ID No :3(表 1)。
[0014] 表1 :用于RPA檢測(cè)PPRV的引物和探針
[0016] 注：R代表G或A，Y代表T或C，PPRV-RPAp中的第30個(gè)堿基標(biāo)記BHQl淬滅基團(tuán)， 第31位堿基替換為四氫咲喃（tetrahydrofuran)，第32位堿基標(biāo)記FAM發(fā)光基團(tuán)，3'末端 進(jìn)行磷酸化修飾。
[0017] L材料與方法
[0018] (1)材料小反芻獸疫西藏株和新疆株病毒，口蹄疫病毒，藍(lán)舌病病毒，羊支原體和 羊傳染性膿皰病毒。健康羊淋巴結(jié)樣品。引物和探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成， 其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。
[0019] (2)病原核酸提取取200 μ 1病原培養(yǎng)物或經(jīng)2000g離心后的組織勻漿液，使用 Roche公司的High Pure PCR Template Preparation kit按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提取各種材料中 的總核酸。
[0020] (4)體外轉(zhuǎn)錄制備小反芻獸疫病毒模板提取小反芻獸疫病毒新疆株RNA，以引物 GACCATCRGCCCAATCAATTAAAAAGGG 和 CTGAGTCR GTGATGCTATGGTACC 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化后連接到PGEM-T載體上，重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定方向后，提取質(zhì)粒使用限制性酶酶 切成線(xiàn)性，然后按照Riboprobe In vitro Transcription systems的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外轉(zhuǎn) 錄，產(chǎn)物經(jīng)DNase I消化、3M的醋酸鈉乙醇沉淀后，溶解于無(wú) RNase的水中，測(cè)定濃度后計(jì)算 出對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)，依次從IO5拷貝/ μ 1以10倍倍比稀釋至10 °個(gè)拷貝/ μ 1，-70°C保存。
[0021] (3) RPA 擴(kuò)增使用 TwistAmp exo (TwistDx，Cambridge，UK)試劑盒在 50 μ 1 反應(yīng)體 系進(jìn)行RPA試驗(yàn)，首先在I. 5ml離心管中加入再水化緩沖液29. 5 μ 1，Transcriptor反轉(zhuǎn)錄 酶（Roche)O. 5 μ 1，10 μΜ 的引物各 2. 1 μ 1，10 μΜ 的 TwistAmp exo 探針 0· 6 μ 1，模板 RNA 和dH20 12. 7 μ 1，渦旋混勻短暫離心后，將前述混合液加入到RPA凍干酶球的反應(yīng)管中，加 入280mM的醋酸鎂溶液2. 5 μ 1，混勾，將反應(yīng)管置于RPA擴(kuò)增檢測(cè)儀或熒光定量PCR儀中， 37°C反應(yīng)15分鐘。以不同種類(lèi)的病原核酸和健康羊總核酸為模板進(jìn)行特異性檢測(cè)，以不同 稀釋度的RNA標(biāo)準(zhǔn)為模板進(jìn)行反應(yīng)的靈敏性檢測(cè)。
[0022] 2.結(jié)果
[0023] 2. 1特異性
[0024] 用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行快速檢測(cè)，以國(guó)內(nèi)分離的西藏株（Tibet 2007) 和新疆株（XJ 2013)小反芻獸疫病毒核酸RNA為模板均可以得到明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，其他病 原核酸如口蹄疫病毒、羊傳染性膿皰病毒、山羊支原體、藍(lán)舌病病毒和健康羊淋巴結(jié)總核酸 為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)均沒(méi)有擴(kuò)增曲線(xiàn)（圖1)。
[0025] 2. 2檢測(cè)靈敏度
[0026] 將病毒核酸10倍稀釋至多個(gè)梯度，每個(gè)梯度重復(fù)檢測(cè)10次，使用統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算出 結(jié)果在模板低至約300個(gè)拷貝時(shí)有95%的檢出可能性，具有較高的靈敏度（圖2)。
[0027] 實(shí)施例2在臨床樣品中的應(yīng)用
[0028] 使用實(shí)施例1中建立的RPA方法對(duì)國(guó)內(nèi)12份臨床疑似病例的羊口鼻拭子和組織 病料樣品進(jìn)行檢測(cè)。使用Roche公司的High Pure PCR Template Preparation kit提取 待檢樣品中的總核酸模板，然后用RPA方法檢測(cè)這些樣品中是否含有PPRV。同時(shí)參照世界 動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE)推薦的普通RT-PCR方法對(duì)12份樣品進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果兩種檢測(cè)方 法的檢測(cè)結(jié)果一致，12份樣品均為PPRV核酸陽(yáng)性。上述結(jié)果表明本發(fā)明的引物組和探針及 其檢測(cè)方法所獲得的結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果一致，證明本發(fā)明的可靠性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種引物和探針，其特征在于，引物的正向引物序列為SEQ ID N0:1，反向引物序列 為 SEQ ID N0:2,探針序列為 SEQ ID N0:3。2. 如權(quán)利要求1所述的引物和探針，其特征在于，所述的探針的第30位堿基標(biāo)記BHQl 淬滅基團(tuán)。3. 如權(quán)利要求1或2所述的引物和探針，其特征在于，所述的探針的第32位堿基標(biāo)記 FAM發(fā)光基團(tuán)。4. 如權(quán)利要求3所述的引物和探針，其特征在于，所述的探針的3'末端進(jìn)行磷酸化修 飾。5. 權(quán)利要求1所述的引物和探針在檢測(cè)小反芻獸疫病毒中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述的引物和探針在制備檢測(cè)小反芻獸疫病毒制品中的應(yīng)用。7. -種通過(guò)重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的方法，提取待檢樣品中 的RNA作為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物和探針進(jìn)行熒光快速檢測(cè)，如果有明顯的熒光 曲線(xiàn)擴(kuò)增，則說(shuō)明所檢測(cè)樣品中含有小反芻獸疫病毒核酸。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用RPA技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的引物及探針，其中正向引物序列如SEQ？ID？No.1所示，反向引物序列如SEQ？ID？No.2所示，探針序列如SEQ？ID？No.3所示。本發(fā)明方法根據(jù)小反芻獸疫病毒基因組序列設(shè)計(jì)了大量RPA引物和探針，從中篩選出一對(duì)可快速有效檢測(cè)小反芻獸疫病毒核酸的引物及探針組合。利用該套引物和探針進(jìn)行快速檢測(cè)，以國(guó)內(nèi)分離的西藏株和新疆株小反芻獸疫病毒核酸RNA為模板均可以得到明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊傳染性膿皰病毒、山羊支原體和藍(lán)舌病病毒為模板進(jìn)行反應(yīng)均沒(méi)有擴(kuò)增曲線(xiàn)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12N15/11, C12Q1/70
【公開(kāi)號(hào)】CN105018485
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510468111
【發(fā)明人】李林, 吳曉東, 鄒艷麗, 劉春菊, 李金明, 包靜月, 王志亮
【申請(qǐng)人】中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月31日