一種小反芻獸疫病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr診斷試劑盒及制備、使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種小反芻獸疫一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR診斷試劑盒及制備、使 用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小反會獸疫（Peste des petits ruminants，PPR)是由小反會獸疫病毒引起的一 種急性、烈性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE)將其列為A類疫病，我國規(guī)定其為一類疫病。 臨床上主要以高熱、口炎、腹瀉和肺炎為主要特征。本病傳播快，發(fā)病率、死亡率均高，是嚴(yán) 重危害養(yǎng)羊業(yè)的重大疾病之一。
[0003] 目前國內(nèi)外可用于檢測小反芻獸疫病毒的方法包括瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGIA)、對 流免疫電泳（CIEP)、病毒中和試驗(yàn)（VNT)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、RT-PCR等，其中AGIA、 VNT等傳統(tǒng)方法要么操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)較長，要么靈敏度或特異性不高，存在各種各樣的問題， 不適合應(yīng)用于PPR疫情的大規(guī)模檢測。ELISA方法相對于傳統(tǒng)的VNT等方法更加方便快捷， 但也存在一定的缺點(diǎn)，例如不能區(qū)分PPR與牛瘟的感染。而RT-PCR方法具有快速、準(zhǔn)確、靈 敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法比普通RT-PCR特異性更強(qiáng)，敏感度更高， 同時(shí)一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR更是有效的解決了兩步法RT-PCR容易污染的問題。因 此，本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對小反芻獸疫病毒全基因的特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種 快速、特異、高度敏感的PPRV診斷方法，為PPR防控提供了一定的技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，提供一種比普通RT-PCR更快速、更有效、更特異、 更敏感的小反芻獸疫病原檢測診斷試劑盒及制備、使用方法，以提高特異性，縮短檢測時(shí) 間，提高檢出率，為PPR防治提供更好的技術(shù)支持，同時(shí)克服現(xiàn)在技術(shù)存在的診斷成本高且 難度大、耗時(shí)長，容易出現(xiàn)假陽性等不足。
[0005] 本發(fā)明的小反芻獸疫病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR診斷試劑，其原料配方為： 1000~2000 μ L 反應(yīng)液，100~200 μ L 酶混合液，100~200 μ L 熒光探針、100~200 μ L 陽性 對照、100~200 μ L陰性對照和2~3mL超純水。反應(yīng)液包括一步法RT-PCR緩沖液、Oligo dT Primer、引物混合液、Mg2+及dNTP,五種液體于反應(yīng)液中體積比為12:1:1:2:18 ;酶混合液 包括TaKaRa Ex Taq HS和反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript RTase、RNases抑制劑，三種溶液于酶混 合液中體積比為1:40:8 ;引物混合液為針對小反芻獸疫病毒全基因特異性引物Pa與Pb，濃 度為lOMmol/ L ;焚光探針為針對小反芻獸疫病毒全基因特異性Ps，探針5'端標(biāo)記FAM基 團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA基團(tuán)，濃度為IOMmol/ L，引物序列見表1 : 表1引物（Pa與Pb、Ps)序列_
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所述一步法RT-PCR緩沖液為2X0ne St印 RT-PCR Buffer，它包括20mmol/L Tris-HCl (PH8.3)、100mmol/L KCL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1% 明膠。
[0006] 所述 Oligo dT Primer，其濃度為 50 μ mol/μ L0
[0007] 所述Mg2+為MgCl 2溶液，其濃度為25mmol/L。
[0008] 所述dNTP為dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在內(nèi)等量混合游離核苷酸，其濃度為 1Ommol/ L0
[0009] 所述 TaKaRa Ex Taq HS，其濃度為 5. OU/ μ L。
[0010] 所述 PrimeScript RTase，其濃度為 200U/ μ L〇
[0011] 所述RNases抑制劑，其濃度為40U/ μ L。
[0012] 所述陽性對照為小反芻獸疫病毒全基因中部分序列克隆質(zhì)?；旌衔?，其濃度為 I. 7Χ 107copies/KL。
[0013] 所述陰性對照為不含小反芻獸疫全基因序列的pMD19-T空載體質(zhì)粒。
[0014] 所述超純水為無 RNase雙蒸水。
[0015] 本發(fā)明有益效果：本發(fā)明將改變小反芻獸疫病毒感染羊無一步法實(shí)時(shí)熒光定量快 速檢測試劑盒使用的局面；發(fā)明所建立試劑盒適用于檢測臨床疑似小反芻獸疫病毒感染羊 病例病料，能夠?qū)εR床疑似病例進(jìn)行病原快速檢測，靈敏度與特異性大大高于傳統(tǒng)方法及 普通RT-PCR檢測方法，為羊養(yǎng)殖場及時(shí)采取預(yù)防措施預(yù)防控制該病爆發(fā)提供技術(shù)支持與 理論依據(jù)。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下技術(shù)效果和特點(diǎn)： (1)耗時(shí)少：本發(fā)明以實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)基礎(chǔ)，相比傳統(tǒng)檢測方法及普通RT-PCR檢測 方法，能快速對疑似病例進(jìn)行病原檢測，大大縮短了檢測時(shí)間。
[0017] (2)特異性好：本發(fā)明設(shè)計(jì)合成針對于小反芻獸疫全基因的特異性引物及探針，保 證了特異性擴(kuò)增小反芻獸疫部分保守片段并進(jìn)行定量檢測，準(zhǔn)確度極高，極大程度的降低 了假陽性的可能。
[0018] (3)靈敏性高：本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，可檢測病原核酸量最低至 I. 7X 102copies/KL。
[0019] (4)污染少：本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，將反轉(zhuǎn)錄過程與PCR擴(kuò)增過程于一管 中進(jìn)行，減少了中間環(huán)節(jié)污染的可能，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明小反芻獸疫病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR診斷試劑盒的制備流 程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明的實(shí)施例：本發(fā)明的小反芻獸疫病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR診斷 試劑盒，其原料配方為：1〇〇〇~2000 μ L反應(yīng)液，100~200 μ L酶混合液，100~200 μ L熒光 探針、100~200 μ L陽性對照、100~200 μ L陰性對照和2~3mL超純水。反應(yīng)液包括一步法 RT-PCR緩沖液、Oligo dT Primer、引物混合液、Mg2+及dNTP，五種液體于反應(yīng)液中體積比為 12:1:1:2:18;酶混合液包括TaKaRa Ex Taq HS和反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript RTase、RNases抑 制劑，三種溶液于酶混合液中體積比為1:40:8 ;引物混合液為針對小反芻獸疫病毒全基因 特異性引物Pa與Pb，濃度為lOMmol/ L ;熒光探針為針對小反芻獸疫病毒全基因特異性Ps， 探針5'端標(biāo)記FAM基團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA基團(tuán)，濃度為lOMmol/ L，引物序列見表1 : 表1引物（Pa與Pb、Ps)序列
所述一步法RT-PCR緩沖液為2X0ne St印 RT-PCR Buffer，它包括20mmol/L Tris-HCl (PH8.3)、100mmol/L KCL、0.1% 明膠。
[0022] 所述 Oligo dT Primer，其濃度為 50 μ mol/μ L0
[0023] 所述Mg2+為MgCl 2溶液，其濃度為25mmol/L。
[0024] 所述dNTP為dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在內(nèi)等量混合游離核苷酸，其濃度為 1Ommol/ L0
[0025] 所述 TaKaRa Ex Taq HS，其濃度為 5. OU/ μ L。
[0026] 所述 PrimeScript RTase，其濃度為 2〇OU/μ L0
[0027] 所述RNa