果蔬中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測質(zhì)控試劑盒和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種果蔬中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測質(zhì)控試劑盒和檢測方法，屬 于食品安全、環(huán)境監(jiān)測和食源性病毒檢測的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 果蔬生產(chǎn)在我國進出口貿(mào)易中占有重要地位。以草莓為例，我國草莓種植面積約 90100公頃，總產(chǎn)達220. 6萬噸，占世界總產(chǎn)的35. 7%，為世界上最大的草莓生產(chǎn)國。國內(nèi)草 莓產(chǎn)地主要分布在山東、安徽、遼寧、河北、江蘇等東部沿海地區(qū)。冷凍草莓是一個重要的出 口農(nóng)產(chǎn)品，2012年全國共出口冷凍草莓5893批次、數(shù)重量155104. 97噸、貨值20379. 16萬 美元。主要輸往荷蘭、德國、俄羅斯、日本、英國、韓國、澳大利亞、泰國等70個國家及地區(qū)。
[0003] 2012年9月，德國爆發(fā)了歷史上最大的一次腸胃炎爆發(fā)事件，約11000名患者出 現(xiàn)嘔吐、腹瀉癥狀，德國懷疑是由中國出口的草莓?dāng)y帶諾如病毒（Norovirus, NoV)所致，并 在歐洲食品和飼料安全快速預(yù)警系統(tǒng)（RASFF)發(fā)布預(yù)警（預(yù)警號2012. 1409)。同期，比利 時在我國出口的冷凍草莓中檢測到甲型肝炎病毒（HAV)，在RASFF發(fā)布預(yù)警信息（預(yù)警號 2012. 1534)。果蔬生產(chǎn)的整個從"生產(chǎn)到餐桌"多個相關(guān)環(huán)節(jié)都有可能威脅果蔬產(chǎn)品，有必 要對產(chǎn)品質(zhì)量進行有效的控制。
[0004] 甲型肝炎病毒、諾如病毒等病毒是多起重大的水源性非細菌性疾病的流行病學(xué)事 件暴發(fā)的元兇。其中，甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus, HAV)是一種正鏈RNA病毒，它屬 于小RNA病毒科肝病毒屬。雖然現(xiàn)在已成功地研制出甲型肝炎疫苗，有效地控制了甲型肝 炎的傳播和流行，但在人群免疫水平低的地方，人群普遍易感，HAV主要通過糞-口途徑污 染水或食物，導(dǎo)致甲型肝炎暴發(fā)流行。HAV基因組雖然只有一個血清型，但有7基因型，在同 一地區(qū)可能存在多種HAV基因型的流行。
[0005] 諾如病毒是杯狀病毒科呈二十面體對稱球形單股正鏈RNA病毒，又稱為諾羅 病毒、諾沃克病毒或膿融病毒，是一種引起非細菌性急性胃腸炎的主要病毒，以腸道傳 播為主，可通過污染的水源、食物、物品、空氣等傳播。諾如病毒基因組全長約7. 7kb，包 含3個開放閱讀框（ORFs)，ORFl編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA聚合酶（RNA-cbpendent RNA polymerase，RdRp) ;0RF2和0RF3分別編碼主要（VPl)和次要（VP2)衣殼蛋白；根據(jù)VPl序 列的同源性，諾如病毒可分為GI~GV五個基因群（Genogroup)，其中引起人類感染的主要 是G I和G II群
[0006] 在我國及世界上大多數(shù)國家，對于食品類產(chǎn)品中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測缺 乏標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制體系，原因主要在于缺乏有效，簡單、快速、可靠的技術(shù)用于濃縮和檢測這 些病原。實時熒光RT-PCR等分子檢測方法由于其高度靈敏、特異的特點，是目前用于檢測 樣本中食源性病毒的最有效方法，但由于果蔬產(chǎn)品中存在的致病病毒量極低，將極其微量 但卻足以使人致病的病毒粒子進行有效的濃縮，成為將這些分子方法成功應(yīng)用的關(guān)鍵點。 現(xiàn)行的檢測方法中，缺乏對整個的檢測過程進行良好質(zhì)量控制的步驟和方法，本發(fā)明利用 大腸桿菌噬菌體MS2與甲型肝炎病毒和諾如病毒在形態(tài)、大小、對環(huán)境的耐受力與病毒粒 子相似以及對人體無危害等特性，構(gòu)建了 "果蔬中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測質(zhì)控試劑 盒和檢測方法"，準(zhǔn)確監(jiān)控病毒顆粒裂解效率和核酸提取等整個檢測過程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn) 體系，對食品樣品和食源性病毒的監(jiān)測具有重要意義，彌補了現(xiàn)行檢測標(biāo)準(zhǔn)和方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種果蔬中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測質(zhì) 控試劑盒和檢測方法"能夠監(jiān)控整個檢測過程并保證檢測結(jié)果的有效性。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 本發(fā)明提供的果蔬中甲型肝炎病毒和諾如病毒檢測質(zhì)控試劑盒包括HAV 2XRT-PCR mix、NV G I +G II分型 2XRT-PCR mix、MS22XRT-PCR mix、無 RNase 水、HAV 陽 性對照、NV G I +G II陽性對照、大腸桿菌噬菌體MS2(2. SXIO'fu/mL)各一管。
[0010] HAV 2XRT-PCR mix、NV G I +G II 分型 2XRT-PCR mix、大腸桿菌噬菌體 MS22XRT-PCR mix中涉及的檢測引物和探針如下：
[0011] (1)甲型肝炎病毒檢測引物和探針：
[0012] 正向引物 HAV-F :5' -TCACCGCCGTTYGCCTAG-3'
[0013] 反向引物 HAV-R : 5 ' -GGGGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3，
[0014] 探針 HAV-P : 5 ' -FAM-CCTGAACYYGCAGGAATYAA-MGB-BHQ-3，
[0015] (2)
[0016] 諾如病毒檢測引物和探針
[0017] 諾如病毒G I :
[0018] 正向引物 NVGl-F :5' -CGYTGGATGCGNTTYCAT-3'
[0019] 反向引物 NVGl-R :5' -CCTTAGACGCCATCATCATTYAC-3'
[0020] 探針 NVGl-P :5' -Cy5-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-3'
[0021] (3)
[0022] 諾如病毒檢測引物和探針
[0023] 諾如病毒G II :
[0024] 正向引物 NVG2-F :5 ' -ATGTTCYGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3 '
[0025] 反向引物 NVG2-R : 5 ' -TCGACGCCATCTTCATTCACA-3 '
[0026] 探針 NVG2-P : 5 ' -FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-BHQ-3 '
[0027] (4)
[0028] 大腸桿菌噬菌體MS2檢測引物和探針
[0029] MS2-TM3-F :5' -GGCTGCTCGCGGATACCC-3
[0030] MS2-TM3-R :5' -TGAGGGAATGTGGGAACCG-3
[0031] MS2-TM2J0E :5' -J0E-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-NFQ-3'。
[0032] 除了引物，HAV 2XRT - PCR mix、NV G I +G II分型 2XRT - PCR mix、大腸桿菌噬 菌體MS22 X RT - PCR mix中其他的試劑，例如酶、dNTP等均為現(xiàn)有的公知試劑。
[0033] 本發(fā)明還提供一種利用本發(fā)明的試劑盒來檢測果蔬中甲型肝炎病毒和諾如病毒 的方法，包括以下步驟：
[0034] ①果蔬樣品中病毒的富集
[0035] a、取5 - 10個草莓或25g檢測樣品，加入bagpage中；加入35mL TGBE緩沖液及 30U的果膠酶黑曲霉，同時加入大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品100 μ L。在室溫下60rpm恒 定搖晃孵育20min。
[0036] 備注：對于酸性軟水果，在孵育過程中，應(yīng)以IOmin的間隔監(jiān)測洗脫液的pH值。如 果pH值低于9. 0,則用NaOH溶液調(diào)節(jié)至9. 5。若調(diào)節(jié)了 pH值，則應(yīng)該延長IOmin的孵育時 間。
[0037] b、收集洗脫液于50mL無菌離心管中，10000 X g離心30min，在4°C下離心澄清。將 上清液轉(zhuǎn)入50mL無菌離心管中，并用lmol/L鹽酸溶液將pH調(diào)節(jié)至7. 0。
[0038] c、加入0· 25體積的5XPEG/NaCl溶液（最終濃度為10% PEG，0. 3M NaCl)，振蕩 60s以混勾，之后在5°C 60rpm孵育60min或者過夜。
[0039] (1、在5°〇 10000\8離心30111；[11，棄去上清液，然后在5°0 10000\8離心5111；[11，以壓 實沉淀物，用槍頭吸取剩余液體棄掉。
[0040] 6、加入50(^1^83蝸旋震蕩，重懸沉淀，靜置511^11;于5°(： 10000\8離心51^11。
[0041] f、吸取離心管的上清液體置于2mL的無菌離心管中，加入500 μ L或等體積（如樣 品上清大于500 μ L)的氯仿-正丁醇，渦旋混合，然后在室溫下孵育5min。
[0042] g、于5°C 1000 OXg下離心15min，將上層水相小心地轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，保 留用于提取RNA。
[0043] ②病毒RNA提取
[0044] ③大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0045] 取制備好的大腸桿菌噬菌體MS2質(zhì)控樣品，稀釋至2. SXK^pfu/mL，取IOOyL進 行提取病毒RNA，最終稀釋于100 μ L無 RNA酶H2O中；取20 μ L稀釋于180 μ L無 RNA酶 H2O,梯度稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，則病毒濃度分別代表2. 5 X 109、 2. 5X10S、2. 5Χ107、2· 5Χ106、2· 5Χ105、2· 5X104pfu/mL，分別進行熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)， 應(yīng)用Ct值和噬菌體濃度建立回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0046] ④甲型肝炎病毒、諾如病毒G I型和G II型、大腸桿菌噬菌體MS2檢測
[0047] 甲型肝炎病毒、諾如病毒G I型和G II型、大腸桿菌噬菌體MS2三種目標(biāo)分別檢 測，每個檢測目標(biāo)反應(yīng)體系包括：2XRT-PCR mix 12. 5yL、樣品5yL、水補齊至25yL，每 個樣品做原倍提取液和IOX稀釋提取液，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照。
[0048] ⑤病毒RNA回收率確定