專(zhuān)利名稱(chēng)：基于nasba的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
我國(guó)是食品消費(fèi)和生產(chǎn)的世界第一大國(guó)，食品安全是重大的民生問(wèn)題，是國(guó)家和人民密切關(guān)注的話題。然而近些年我國(guó)的食品安全事故頻繁發(fā)生，食品安全問(wèn)題已然成為國(guó)人心中揮之不去的夢(mèng)魘。據(jù)調(diào)查，讓人不安的食品安全是導(dǎo)致民眾幸福指數(shù)較低的主要原因。食源性疾病是食品安全的最大問(wèn)題，給消費(fèi)者健康和安全帶來(lái)嚴(yán)重威脅。食源致病菌是引起食源性疾病的主要致病因子。2011年10月，上海家樂(lè)福超市的思念牌三鮮水餃被檢出含有金黃色葡萄球菌，該細(xì)菌很可能會(huì)導(dǎo)致肺炎。2012年4月，廣東有兩批次嬰兒配方奶粉被檢出含有阪崎腸桿菌，該病菌能引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和敗血癥，死亡率高達(dá)50%以上。2012年11月，國(guó)家質(zhì)檢總局組織了產(chǎn)品質(zhì)量國(guó)家監(jiān)督抽查，福建省的扭扭蝦味條大腸菌群實(shí)測(cè)值是標(biāo)準(zhǔn)值的100倍以上。食源致病菌一直難以得到及時(shí)有效的監(jiān)控，不僅對(duì)食品衛(wèi)生和人民健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，也對(duì)食品工業(yè)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成很大的影響。因此，發(fā)展一種快速、靈敏、特異、安全的檢測(cè)食源致病菌的方法對(duì)食品安全體系的完善、預(yù)防人類(lèi)食源性疾病的發(fā)生具有重要意義。傳統(tǒng)的食源致病菌的檢測(cè)方法主要有培養(yǎng)鑒定法、電子顯微鏡觀察法、免疫學(xué)檢測(cè)方法等。培養(yǎng)鑒定法的操作煩瑣，需時(shí)較長(zhǎng)，而其他方法具有靈敏度低、特異性不高、耗時(shí)長(zhǎng)、需要昂貴儀器 等缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的方法在相當(dāng)程度上限制了對(duì)食源致病菌的快速檢測(cè)能力，而近年來(lái)發(fā)展的分子生物學(xué)新技術(shù)就能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，其中核酸擴(kuò)增技術(shù)使得分子檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性大大提高。為了使擴(kuò)增技術(shù)更適應(yīng)現(xiàn)代分子診斷的需求，許多研究都集中在新的檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)。試紙條檢測(cè)技術(shù)無(wú)疑為分子檢測(cè)提供了便捷的途徑。近期，基于與核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的核酸試紙條發(fā)展迅速，其與免疫試紙條相比，具有成本低、應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)。依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增(Nucleicacid sequence-based amplification, NASBA)是一種特別適合擴(kuò)增RNA的技術(shù)，是由I對(duì)帶有T7啟動(dòng)子序列的引物引導(dǎo)的靈敏的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其產(chǎn)生的大量單鏈RNA易于在試紙條上實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高靈敏度檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種基于NASBA與試紙條檢測(cè)結(jié)合的快速、靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)食源致病菌的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用上述方法檢測(cè)單增李斯特菌的試劑盒。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，具體包括以下步驟:( I)模板的準(zhǔn)備:提取食源致病菌的RNA。
(2)設(shè)計(jì)合成兩條用于擴(kuò)增食源致病菌保守序列的引物:T7引物和引物2，T7引物中含有能被T7RNA聚合酶識(shí)別的Τ7啟動(dòng)子序列。(3) NASBA反應(yīng):將步驟(I)制備的模板、步驟(2)設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行NASBA擴(kuò)增反應(yīng)，得到單鏈RNA產(chǎn)物。(4)探針的設(shè)計(jì):根據(jù)單鏈RNA產(chǎn)物的序列設(shè)計(jì)三條捕捉探針，探針I(yè)和探針2分別和單鏈RNA廣物的兩端互補(bǔ),探針3與探針I(yè)完全互補(bǔ)；二條探針的一端都修飾有功能基團(tuán)。(5)納米金探針的制備:將步驟(4)中所設(shè)計(jì)合成的探針I(yè)與納米金連接制備納米金探針，并用包埋緩沖液重懸納米金探針得到用于包埋的納米金探針。(6)膠體金核酸試紙條的制備膠體金核酸試紙條由底板、樣品板、金墊、硝酸纖維素膜(NC膜)和吸水板構(gòu)成，將樣品板、金墊、硝酸纖維素膜(NC膜)和吸水板依次搭接固定于底板上(如圖5所示結(jié)構(gòu))組裝得到膠體金核酸試紙條。所述的金墊包埋有步驟(5)制備的納米金探針；所述的硝酸纖維素膜上有含鏈霉親和素和探針3的控制線(C線)和含鏈霉親和素和探針2的檢測(cè)線(Τ線)，檢測(cè)線靠近金墊，控制線靠近吸水板。(7)檢測(cè):將由步驟(3)得到的RNA產(chǎn)物與含甲酰胺(甲酰胺能夠破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而提高其與探針的雜交效率)的SSC緩沖液(檸檬酸鈉緩沖液)混合，混合液滴加到膠體金核酸試紙條的樣品板上，再滴加SSC緩沖液，讀取結(jié)果，檢測(cè)線和控制線都變成紅色表明有靶序列存在，即有待測(cè)食源致病菌，僅有控制線變成紅色表明沒(méi)有待測(cè)食源致病菌。步驟(I)中所述的食品致病菌包括單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica)、大腸桿菌 0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)>志賀氏菌(Shigella.Spp)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)和臘狀芽抱桿菌(Yersiniaenterocolitica)等。步驟(2)中所述的食源致病菌保守序列優(yōu)選為食源致病菌16S rRNA基因的可變區(qū)序列或毒力基因片段，如單增李斯特菌16S核糖體RNA基因(16S rRNA基因)、沙門(mén)氏菌的侵襲基因A (invA)等。步驟(2)中所述的T7啟動(dòng)子序列為T(mén)AATACGACTCACTATAGGGAGA。步驟(3)中所述的NASBA反應(yīng)的體系包含:模板RNA、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、T7RNA聚合酶、T7RNA聚合酶緩沖液、RNaseH、RNA酶抑制劑、T7弓丨物、引物2,dNTPs,NTPs、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基 亞砜(DMSO)和DEPC (焦碳酸二乙酯)處理水；所述的T7引物的終濃度為300 500nM ;所述的引物2的終濃度為300 500nM。步驟(3)中所述的NASBA反應(yīng)的條件優(yōu)選為每25 μ L反應(yīng)體系的組成如下:模板RNAlng/μ L、Τ7引物400ηΜ、引物2400nM、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶8U、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、T7RNA聚合酶36U、RNA酶抑制劑10U、RNaseH5U、NTPs2mM (每種核糖核苷三磷酸的濃度為2mM)、dNTPsImM (每種脫氧核糖核苷三磷酸的濃度為lmM)、DMS0的體積百分比為10%、BSA終濃度為0.1 μ g/μ L ;擴(kuò)增過(guò)程優(yōu)選為:配制混合液A于65°C加熱5分鐘，再于41°C冷卻5min，加入酶混合液，于41°C孵育90min，4°C終止反應(yīng)；所述的混合液A包括:模板RNA、T7引物、引物2、dNTPs、NTPs、5XT7RNA聚合酶緩沖液、5XAMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、DMSO和DEPC處理水；所述的酶混合液包括:5 X T7RNA聚合酶緩沖液、5 XAMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶、RNaseH, RNA酶抑制劑、BSA和DEPC處理水。步驟(3)中所述的單鏈RNA產(chǎn)物的長(zhǎng)度優(yōu)選為120 270nt。步驟(4)中所述的探針I(yè)和探針2的長(zhǎng)度優(yōu)選為20 30nt。步驟(4)中所述的探針I(yè)的功能基團(tuán)優(yōu)選為巰基，探針2和探針3的功能基團(tuán)優(yōu)選為生物素。步驟(5)中所述的納米金的粒徑優(yōu)選為13nm。步驟(5)中所述的包埋緩沖液為:Na3P0420mM，BSA (牛血清白蛋白)質(zhì)量百分比5%，Tween X-100體積百分比0.25%,鹿糖質(zhì)量百分比8%。步驟(6)中所述的底板的材料優(yōu)選為PVC塑料(聚氯乙烯塑料)。步驟(6)中所述的樣品板的材料優(yōu)選為玻璃纖維，其處理方法為:用樣品板處理緩沖液浸潤(rùn)，置于干燥器中室溫保存；所述的樣品板處理緩沖液為ΦΗ8.0，體積百分比0.25% 的 Triton X-100,0.05Μ Tris_HCl，0.15M NaCl。步驟(6)中所述的金墊的材料優(yōu)選為玻璃纖維，其處理方法為:用50yL步驟(4)中所述的用于包埋的納米金探針噴在其上，室溫下干燥，干燥器中4°C保存。步驟(6)中所述的硝酸纖維素膜的處理方法優(yōu)選為:用噴膜儀將6 μ L鏈霉親和素溶液和探針2混合液噴到檢測(cè)線(Τ線)的位置，將6 μ L鏈霉親和素溶液和探針3混合液噴到控制線(C線)的位置，置于室溫下干`燥lh，并于4°C干燥保存；所述的鏈霉親和素溶液濃度為1.67mg/mL，所述的探針2和探針3的濃度為ImM ;所述的檢測(cè)線寬2mm與金墊相隔6mm,所述的控制線寬2mm與金墊相隔12mm。步驟(6)中所述的吸水板的材料優(yōu)選為吸水纖維。步驟(6)中所述的組裝優(yōu)選為:底板在最下層，NC膜粘貼在底板上的中間部位，金墊位于NC膜的上部的一側(cè)并與之重疊2mm，樣品板位于金墊的上部與之重疊2mm，吸水板位于NC膜的上部相對(duì)與金墊和樣品板的另一側(cè)并與NC膜重疊2mm,最后用切條機(jī)切成4mm寬的條。步驟(7)中所述的樣品的檢測(cè)的過(guò)程優(yōu)選為:將25 μ L由步驟(3)得到的RNA產(chǎn)物與125 μ L含體積濃度6%甲酰胺的4XSSC緩沖液組成的溶液滴加到膠體金核酸試紙條的樣品板上，IOmin后，再滴加50μ L4XSSC緩沖液，15min之內(nèi)讀取結(jié)果。所述的食源致病菌為單增李斯特菌時(shí)，其保守序列為16S rRNA基因；擴(kuò)增保守序列的引物為:T7 引物:5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAG CGATAGCC-3，；引物2:5，-AGCTTGCTCTTCCAA-3’ ；單鏈RNA 產(chǎn)物的序列為:5 ’ -CAUC腳AAGCGAUAGCCGAAACCAUC UUUCAAAAGCGUGGCAUGCGCCACACUUUAUCAUUCGGUAUUAGCUCCGGUUUCCCGGAGUUAUCCCCAACUUACAGGCAGGUUGCCCACGUGUUA CUCACCCGUCCGCCACUAACUUUGGAAGAGCAAGCU-3，:單下劃線部分為與探針I(yè)互補(bǔ)配對(duì)的，雙下劃線表示的是探針2結(jié)合的區(qū)域；探針3與探針I(yè)完全互補(bǔ)；探針I(yè) 為:5’ -SH-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3’(SH 表示巰基)；探針2 為:5’ -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-Bi0-3’ (Bio 表示生物素)；
探針3 為:5’ -Bio-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3’ (Bio 表示生物素)。使用上述方法檢測(cè)單增李斯特菌的試劑盒，包含A、B兩個(gè)分試劑盒；A分試劑盒包含引物、酶、酶緩沖液、RNaseH, RNA酶抑制劑、牛血清白蛋白(BSA)、dNTPs、NTPs、DMSO、DEPC 處理水，其中:所述的弓丨物包括T7引物和引物2:T7 引物:5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAG CGATAGCC-3，；引物2:5，-AGCTTGCTCTTCCAA-3’ ；所述的酶包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶；所述的酶緩沖液包括:AMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、T7RNA酶緩沖液；B分試劑盒包含探針、緩沖液、膠體金核酸試劑條；所述的探針包括探針1、2和3:探針I(yè) 為:5’ -SH-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3’(SH 表示巰基)；探針2 為:5’ -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-Bi0-3’ (Bio 表示生物素)；探針3 為:5’ -Bio-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3’ (Bio 表示生物素)；所述的緩沖液包 括4X SSC緩沖液、含體積濃度6%甲酰胺的4X SSC緩沖液。所述的膠體金核酸試劑條包含附著于底板(材料為PVC塑料)上且依次搭接的樣品板(材料為玻璃纖維)、金墊(材料為玻璃纖維)、硝酸纖維素膜和吸水板(材料為吸水纖維);金墊包埋有連接探針I(yè)的納米金探針；硝酸纖維素膜上有含鏈霉親和素和探針3的控制線(C線)和含鏈霉親和素和探針2的檢測(cè)線(T線)，檢測(cè)線靠近金墊，控制線靠近吸水板。本發(fā)明的基本原理(如圖1所示):當(dāng)檢測(cè)體系存在目的基因片段時(shí)，T7引物與其結(jié)合進(jìn)行退火，同時(shí)體系中還存在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7RNA聚合酶。在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，形成DNA-RNA雜合體，接著體系里的RNase H將雜合體中的RNA鏈特異降解。引物2隨后與此單鏈DNA結(jié)合退火，由于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶具有DNA依賴(lài)的DNA聚合酶活性，因此在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，催化合成雙鏈DNA。因T7引物的5’端帶有能被T7RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列，所以此雙鏈DNA就可作為T(mén)7RNA聚合酶的催化底物轉(zhuǎn)錄合成反義RNA。反義RNA可與引物2結(jié)合退火，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，催化合成RNA-DNA雜合體，然后RNaseH特異降解RNA鏈，形成的單鏈DNA與T7引物結(jié)合退火，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成帶有T7RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)的雙鏈DNA，又轉(zhuǎn)錄合成反義RNA。反義RNA重復(fù)循環(huán)進(jìn)行DNA合成、RNA降解、T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，使得RNA不斷得以擴(kuò)增。擴(kuò)增所得的RNA產(chǎn)物滴加到樣品板上時(shí)，通過(guò)層析作用，先與金墊處已經(jīng)包埋的納米金探針雜交，當(dāng)其到達(dá)已包埋有與RNA產(chǎn)物互補(bǔ)的探針2的檢測(cè)線(T線)處時(shí)，RNA、納米金探針和探針2形成“三明治結(jié)構(gòu)”，就會(huì)形成一條紅色的線，過(guò)量的納米金探針繼續(xù)層析，到達(dá)已包埋有探針3的控制線(C線)處時(shí)形成第二條紅色的線。而不含目的基因片段時(shí)，檢測(cè)線(T線)處因不能形成“三明治”結(jié)構(gòu)的雜交產(chǎn)物，而沒(méi)有紅色的線出現(xiàn)，只有過(guò)量的納米金探針繼續(xù)層析，到達(dá)已包埋有探針3的控制線(C線)處時(shí)形成一條紅色的線。若檢測(cè)線(T線)和控制線(C線)處都無(wú)紅色的線出現(xiàn)，則表明試紙條已經(jīng)失效，檢測(cè)失敗，樣品需要重新檢測(cè)。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
(I)依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增(NASBA)可在此內(nèi)將模板RNA擴(kuò)增IO9倍，比常規(guī)PCR法高1000倍。NASBA技術(shù)由于它的引物上帶有T7啟動(dòng)子序列，而外來(lái)雙鏈DNA無(wú)T7啟動(dòng)子序列，不可能被擴(kuò)增，因此在有DNA污染的條件下，NASBA技術(shù)同樣具有較高的特異性和靈敏度。NASBA將反轉(zhuǎn)錄過(guò)程直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中，縮短了反應(yīng)時(shí)間。(2)將NASBA與試紙條檢測(cè)結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)定性或者定量檢測(cè)，結(jié)果穩(wěn)定。(3)檢測(cè)速度快，特異性好，靈敏度高。(4)設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低，無(wú)需昂貴的儀器。(5)探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作步驟簡(jiǎn)短，易于推廣。(6)本發(fā)明沒(méi)有溴化已錠、同位素等有害物質(zhì)的使用，沒(méi)有安全隱患，使用安全。


圖1是基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源性致病菌的原理圖。圖2是單增李斯特菌總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3是NASBA反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖4是13nm膠體金的吸收光譜圖，在520mm處有最大吸收峰。圖5是試紙條的組裝結(jié)構(gòu)以及各部分包埋情況圖。圖6是基于NASBA的試紙條檢測(cè)單增李斯特菌結(jié)果圖，陰性結(jié)果(I號(hào)試紙條)和陽(yáng)性結(jié)果(2號(hào)試紙 條)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。將本發(fā)明的方法應(yīng)用于單增李斯特菌的檢測(cè)。如圖1所示為基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源性致病菌的原理圖。實(shí)施例中所用試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司，試紙條材料及設(shè)備均購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司。實(shí)施例1(I)單增李斯特菌(菌株CMCC54007，購(gòu)買(mǎi)于廣州微生物研究所)總RNA的提取:①液氮研磨，取大約5mL菌液于研缽內(nèi)，加入少量液氮，迅速研磨，研磨過(guò)程中不斷加入液氮，直到研磨充分為止。研磨后將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入1.5mL EP管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8mL Trizol，吹打研缽上的殘余裂解物，倒入EP管中。②蓋好蓋子，顛倒混勻10次，室溫靜置5分鐘。③往EP管中加入0.2mL氯仿，蓋好蓋子，用力搖晃15秒鐘，使液體充分混勻，室溫靜置5分鐘后，12000轉(zhuǎn)離心15分鐘。④將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管中(大約為0.5mL)，加入0.5mL異丙醇，用力搖晃15秒鐘，使液體充分混勻，放置于_20°C冰箱中I小時(shí)。⑤12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，小心棄去上清，加入I毫升預(yù)冷的75%酒精的DEPC溶液，
震蕩洗滌。⑥7500轉(zhuǎn)離心5分鐘，小心棄去上清，開(kāi)蓋于超凈臺(tái)內(nèi)30分鐘吹干沉淀，此時(shí)RNA沉淀變?yōu)橥该鳌?br> ⑦EP管中加入20 μ L DEPC溶液溶解沉淀，如沉淀溶解困難，可在55 60°C水浴中最多10分鐘助溶。提取后的RNA可放置于-80°C冰箱中保存或立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。提取結(jié)果如圖2所示，M為DL2000，I為單增李斯特菌總RNA，細(xì)菌的核糖體亞基中包含3種沉降系數(shù)不同的rRNA，分別是16S rRNA, 5S rRNA和23S rRNA。其余RNA的豐度低，在瓊脂糖電泳中看不出條帶。(2)引物及探針設(shè)計(jì):根據(jù)單增李斯特菌的16S rRNA基因可變區(qū)序列設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增出159nt的RNA片段(如圖3所示，M為DL2000，1、2分別為lng/yL、0.1ng/μ L模板濃度下的擴(kuò)增條帶)的引物(Τ7引物和引物2)。探針I(yè)和探針2分別和RNA產(chǎn)物的兩端互補(bǔ)，探針3與探針I(yè)完全互補(bǔ)。所用到的引物和探針如表I所示:表I引物列表
權(quán)利要求
1.一種基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，其特征在于包括如以下步驟: (1)模板的準(zhǔn)備:提取食源致病菌的RNA； (2)設(shè)計(jì)合成兩條用于擴(kuò)增食源致病菌保守序列的引物:T7引物和引物2，T7引物中含有能被T7RNA聚合酶識(shí)別的Τ7啟動(dòng)子序列； (3)NASBA反應(yīng):將步驟(I)制備的模板、步驟(2)設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行NASBA擴(kuò)增反應(yīng)，得到單鏈RNA產(chǎn)物； (4)探針的設(shè)計(jì):根據(jù)單鏈RNA產(chǎn)物的序列設(shè)計(jì)三條捕捉探針，探針I(yè)和探針2分別和單鏈RNA產(chǎn)物的兩端互補(bǔ)，探針3與探針I(yè)完全互補(bǔ)；三條探針的一端都修飾有功能基團(tuán)； (5)納米金探針的制備:將步驟(4)中所設(shè)計(jì)合成的探針I(yè)與納米金連接制備納米金探針，并用包埋緩沖液重懸納米金探針得到用于包埋的納米金探針； (6)膠體金核酸試紙條的制備 膠體金核酸試紙條由底板、樣品板、金墊、硝酸纖維素膜和吸水板構(gòu)成，將樣品板、金墊、硝酸纖維素膜和吸水板依次搭接固定于底板上組裝得到膠體金核酸試紙條； 所述的金墊包埋有步驟(5)制備的納米金探針；所述的硝酸纖維素膜上有含鏈霉親和素和探針3的控制線和含鏈霉親和素和探針2的檢測(cè)線； (7)檢測(cè):將由步驟(3)得到的RNA產(chǎn)物與含甲酰胺的檸檬酸鈉緩沖液混合，混合液滴加到膠體金核酸試紙條的樣品板上，再滴加檸檬酸鈉緩沖液，讀取結(jié)果，檢測(cè)線和控制線都變成紅色表明有靶序 列存在，即有待測(cè)食源致病菌，僅有控制線變成紅色表明沒(méi)有待測(cè)食源致病菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的食品致病菌包括單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌0157:Η7、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和蠟狀芽孢桿菌； 步驟(2)中所述的食源致病菌保守序列為食源致病菌16S rRNA基因的可變區(qū)序列或毒力基因片段； 步驟(2)中所述的T7啟動(dòng)子序列為T(mén)AATACGACTCACTATAGGGAGA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的NASBA反應(yīng)的體系包含:模板RNA、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、T7RNA聚合酶、T7RNA聚合酶緩沖液、RNaseH, RNA酶抑制劑、T7引物、引物2、dNTPs、NTPs、牛血清白蛋白、DMSO和DEPC處理水；所述的T7引物的終濃度為300 500nM ;所述的引物2的終濃度為300 500nM ； 步驟(3)中所述的單鏈RNA產(chǎn)物的長(zhǎng)度為120 270nt。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，其特征在于: 步驟(3)所述的NASBA反應(yīng)的條件為每25 μ L反應(yīng)體系的組成如下:模板RNAlng/ μ L、Τ7引物400ηΜ、引物2400nM、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶8U、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、T7RNA聚合酶36U、RNA酶抑制劑10U、RNaseH5U、NTPs2mM、dNTPslmM、DMS0的體積百分比為10%、牛血清白蛋白終濃度為0.1 μ g/ μ L ;擴(kuò)增過(guò)程為:配制混合液A于65°C加熱5分鐘，再于41°C冷卻5min，加入酶混合液，于41°C孵育90min，4°C終止反應(yīng)；所述的混合液A包括:模板RNA、T7引物、引物,2、dNTPs、NTPs、5XT7RNA聚合酶緩沖液、5XAMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、DMSO和DEPC處理水；所述的酶混合液包括:5 X T7RNA聚合酶緩沖液、5 X AMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶、RNaseH, RNA酶抑制劑、牛血清白蛋白和DEPC處理水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，其特征在于: 步驟(4)中所述的探針I(yè)和探針2的長(zhǎng)度為20 30nt ；步驟(4)中所述的探針I(yè)的功能基團(tuán)為巰基，探針2和探針3的功能基團(tuán)為生物素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，其特征在于: 步驟(5)中所述的納米金的粒徑為13nm ; 步驟(5)中所述的包埋緩沖液為:Na3P0420mM，BSA質(zhì)量百分比5%，Tween X-100體積百分比0.25%,鹿糖質(zhì)量百分比8%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，其特征在于: 步驟(6)中所述的底板的材料為聚氯乙烯塑料； 步驟(6)中所述的樣品板的材料為玻璃纖維，其處理方法為:用樣品板處理緩沖液浸潤(rùn)，置于干燥器中室溫保存；所述的樣品板處理緩沖液為:PH8.0，體積百分比0.25%的Triton X-100,0.05M Tris-HCl,0.15M NaCl ； 步驟(6)中所述的金墊的材料為玻璃纖維，其處理方法為:用50yL步驟(4)中所述的用于包埋的納米金探針噴在其上，室溫下干燥，干燥器中4°C保存； 步驟(6)中所述的硝酸纖維素膜的處理方法為:用噴膜儀將6μ L鏈霉親和素溶液和探針2混合液噴到檢測(cè)線的位置，將6 μ L鏈霉親和素溶液和探針3混合液噴到控制線的位置，置于室溫下干燥lh，并于4°C干燥保存；所述的鏈霉親和素溶液濃度為1.67mg/mL，所述的探針2和探針3的濃度為ImM ； 步驟(6)中所述的吸水板的材料為吸水纖維； 步驟(6)中所述的組裝為:底板在最下層，硝酸纖維素膜粘貼在底板上的中間部位，金墊位于硝酸纖維素膜的上部的一側(cè)并與之重疊，樣品板位于金墊的上部與之重疊，吸水板位于硝酸纖維素膜的上部相對(duì)與金墊和樣品板的另一側(cè)并與硝酸纖維素膜重疊。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，其特征在于: 步驟(7)中所述的樣品的檢測(cè)的過(guò)程為:將25 μ L由步驟(3)得到的RNA產(chǎn)物與125 μ L含體積濃度6%甲酰胺的4Χ檸檬酸鈉緩沖液組成的溶液滴加到膠體金核酸試紙條的樣品板上，IOmin后，再滴加50 μ L4X檸檬酸鈉緩沖液，15min之內(nèi)讀取結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法，其特征在于: 所述的食源致病菌為單增李斯特菌時(shí)，其保守序列為16S rRNA基因；擴(kuò)增保守序列的引物為:T7 引物:5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAG CGATAGCC-3，；引物 2:5’ -AGCTTGCTCTTCCAA-3’ ；探針 I 為:5’ -巰基-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3’ ；探針 2 為:5’ -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-生物素 _3’ ；探針 3 為:5’ -生物素-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3’。
10.使用權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述的方法檢測(cè)單增李斯特菌的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包含A、B兩個(gè)分試劑盒； A分試劑盒包含引物、酶、酶緩沖液、RNaseH, RNA酶抑制劑、牛血清白蛋白、dNTPs、NTPs、DMSO、DEPC 處理水，其中:所述的引物包括T7引物和引物2:T7 引物:5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAGC GATAGCC-3’ ；引物 2:5’ -AGCTTGCTCTTCCAA-3’ ； 所述的酶包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶； 所述的酶緩沖液包括逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、T7RNA酶緩沖液； B分試劑盒包含探針、緩沖液、膠體金核酸試劑條； 所述的探針包括探針1、2和3: 探針 1 為:5’ -巰基-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3’ ； 探針 2 為:5’ -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-生物素 _3’ ； 探針 3 為:5’ -生物素-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3’ ； 所述的緩沖液包括4X檸檬酸鈉緩沖液、含體積濃度6%甲酰胺的4X檸檬酸鈉緩沖液； 所述的膠體金核酸試劑條包含附著于底板上且依次搭接的樣品板、金墊、硝酸纖維素膜和吸水板；金墊包埋有連接探針I(yè)的納米金探針；硝酸纖維素膜上有含鏈霉親和素和探針3的控制線和含鏈霉親和素和探針2的檢測(cè)線，檢測(cè)線靠近金墊，控制線靠近吸水板。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于NASBA的試紙條檢測(cè)食源致病菌的方法及試劑盒，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括如下步驟(1)提取食源致病菌的RNA；(2)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；(3)進(jìn)行NASBA反應(yīng)；(4)設(shè)計(jì)捕捉探針；(5)制備納米金探針；(6)制備膠體金核酸試紙條；(7)樣品的檢測(cè)。使用該方法檢測(cè)單增李斯特菌的試劑盒包括引物(如SEQ ID NO.1和2所示)、酶、緩沖液、RNaseH、RNA酶抑制劑、dNTPs、NTPs、探針(如SEQ ID NO.4、5和6所示)和膠體金核酸試劑條等。本方法將NASBA與試紙條檢測(cè)結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)定性或者定量檢測(cè)，成本低，檢測(cè)速度快，特異性好，靈敏度高，使用安全。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103146835SQ201310098339
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者邢達(dá), 詹芳芳, 周小明 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)