專利名稱：同時檢測多種致病菌的檢測用引物及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農(nóng)副產(chǎn)品安全檢測技術，具體涉及同時檢測多種致病菌的引物及檢測方法。
背景技術：
食品安全是公共衛(wèi)生問題中最應重視的環(huán)節(jié)，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道全球每年發(fā)生食源性疾病的病例高達一億例，全球每年約有170萬兒童死于由食源性微生物污染引起的腹瀉病，成年人的感染病例達到數(shù)十億。研究發(fā)現(xiàn)，目前我國食品安全領域存在如下問題(1)微生物污染是影響我國食品安全的最主要因素。(2)在投入品供給，農(nóng)業(yè)產(chǎn)地環(huán)境，防疫體系，農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)、加工以及銷售等環(huán)節(jié)仍然存在安全隱患。(3)食品安全科技成果和技術儲備不足。(4)食品安全標準體系、檢驗檢測體系、認證認可體系等方面還存在明顯的不適應性，食品安全管理體制和法律法規(guī)體系有待完善。(5)食物中毒和食源性疾病仍然對中國的食品安全構成了明顯的威脅，重大食品安全事故屢有發(fā)生。為確保我國食品安全與食品貿(mào)易，必須大力加強食品檢驗的力度，在我國建立、健全食品安全法規(guī)，加強食品安全監(jiān)控，提高檢測技術，使我國相應的法規(guī)、標準與國際接軌，特別是食品快速檢測技術達到國際先進水平。世界衛(wèi)生組織將食源性疾病定義為，通過攝食進入人體的，使人體患感染性或中毒性的疾病。人類有60%的疾病都與動物疾病有關，近些年出現(xiàn)的新型疾病中，這一比例更是高達75%，在養(yǎng)殖業(yè)高度發(fā)達、人與動物多層面接觸的今后，這一比例恐怕還會升高。常見的食源性致病菌包括沙門氏菌屬、致病性大腸桿菌、葡萄球菌及毒素、變形桿菌屬、副溶血性弧菌、李斯特菌、肉毒梭菌毒素、蠟樣芽抱桿菌、韋氏梭菌、彎曲桿菌、酵米面椰毒假單胞桿菌、結腸炎耶爾森氏菌、鏈球菌及志賀氏菌屬等。以上所述的致病菌目前還沒有一套可以同時檢測其是否存在的檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一套可同時檢測多種致病菌的檢測用引物。本發(fā)明的另一目的是提供根據(jù)上述檢測引物設計的一種檢測方法。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的
在各種食物中毒中，細菌性食物中毒是食物中毒的主要因素。本發(fā)明針對在我國食物中毒中最常見的致病菌，研究出一種食物中毒診斷及食品檢測的有效方法。根據(jù)GB4789.1食品衛(wèi)生微生物學檢驗總則和GB4789. 17肉與肉制品檢驗中的相關要求以及結合我國目前食源性致病菌的發(fā)生發(fā)展情況，選取以下六種細菌作為檢測對象鼠傷寒沙門氏菌，甲型副傷寒沙門氏菌，單核細胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志賀氏菌，非01群霍亂弧菌，首先篩選出檢測上述各致病菌的PCR引物。同時檢測多種致病菌的檢測用引物，核苷酸序列如下、invA 引物對SEQ ID NO: 1^2 (JnvA-up，down)；
力7ァ引物對SEQ ID NO:3^4 ihly-up, down)；iiorT 引物對SEQ ID NO:5 6 (toxR-up, down);
引物對SEQ ID NO:7^8 iipaH-up, down)；vcc 引物對SEQ ID NO:9 10 (vcc~up, down);
以上任何兩對以上引物組合,可以檢測該弓I物對所對應的致病菌；
其中i/ W引物對用于檢測鼠傷寒沙門氏菌{Salmonella typhimurium)和甲 型副傷寒沙門氏菌{Salmonella para typhi ), hly引物對用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌iListeria monocytogenes), toxR引物對用于檢測副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus ), 引物對用于檢測福氏志賀氏菌flexneri ), rcc 引物對用于檢測非ft/群霍亂弧菌(Cholerae non- 01、。以上引物是通過Blast、MegAlign和DNAStar程序篩選出的沙門氏菌inv基因簇保守序列(GenBank: FR775234. 2)，單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因Aか保守序列(GenBank: NC_012488. 2)，副溶血性弧菌toxR基因保守序列(GenBank: L11929. 2)，福氏志賀氏菌侵襲性質?？乖璈基因ipaH7保守序列(GenBank: NC_004337. I),非01群霍亂弧菌Fee基因保守序列(GenBank:7)作為模板,用Primer Explorer V5軟件設計所得。本發(fā)明靶基因的選擇原則有ニ 選擇毒力基因，選擇位于細菌基因組的基因。因為各種致病菌與其同屬的非致病型在生化反應上沒有區(qū)別，屬間基因組的同源性也很高，但與致病性相關的毒力基因特異性高。而在食品檢測上只有檢測出毒力才能認定為致病菌，所以選擇毒力基因為靶基因。細菌屬于原核生物，其遺傳物物質有基因組和質粒兩類，很多毒力基因位于質粒上。但質粒不穩(wěn)定，可能在細菌間轉移，也容易在傳代培養(yǎng)中丟失。質粒DNA與基因組DNA的大小相差很大，不能用同樣方法提取。所以選擇位于細菌基因組上的毒力基因為靶基因。由于要在同一個PCR管體系中同時進行至少兩個目的基因的擴增，引物設計比較復雜，且對引物擴增區(qū)的特異性要求較高。所以引物設計沒有普通引物設計簡單，要設計出優(yōu)良的引物，需要在各種生物信息軟件評估的基礎上進行費時的篩選。由于所設計的引物具有高度的選擇特異性，在進行病原檢測時，要求引物所針對的靶序列位點應該相當保守，這樣所建立的方法才具有適用性。研究中也可以設計一些簡并引物以增強其應用的廣泛性，但簡并度高的引物會對擴增反應造成負面影響。對于ー些具有GC含量高、變異性強、弓丨物ニ聚體等特點的目的序列，沒有辦法設計出非常適用的引物，使多重檢測技術的應用受到限制。由于所設計的引物要在下一步進行多重PCR反應，因此在設計引物時要將各基因對應的序列一同進行比對分析。除了遵循引物設計的一般原則，引物對內部和引物對之間也要盡量使Tm值相近，確保能在同一條件下均獲得較好的擴增；各對引物內部和引物對之間不能互補，尤其避免3’端的互補，以減少引物ニ聚體的形成；各引物與其他擴增片段和模板有較好的特異性；擴增產(chǎn)物片段的大小要有差異，確保能夠用瓊脂糖凝膠電泳方法區(qū)分開。設計好的引物序列提交到NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，用以驗證引物的理論特異性。
本發(fā)明要保護的另一技術方案是一種同時檢測多種致病菌的檢測方法，該方法使用上面任意兩對以上檢測用引物對，以待檢樣品中提取的DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物電泳結果出現(xiàn)以下條帶，表明待檢樣品中存在相應的致病菌 214bp :副溶血性弧菌；
394bp :福氏志賀氏菌；
490bp :非01群霍亂弧菌；
568bp :鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌；
797bp :單核細胞增生李斯特氏菌。本發(fā)明還保護一種同時檢測兩種致病菌的雙重PCR反應體系，該反應體系為25ML，其中2XPCRmix 12. 5uL, 10umol/L的上、下游引物各0. 4ML，待檢測樣品DNA模板I. Oii L，超純水補足25ML ;所述上、下游引物為SEQ ID NO: TlO中任意兩種檢測用引物對中的上、下游引物，如果選擇引物對和/或引物對，其上、下游引物需各加IML ;所述致病菌為所選用引物對所對應能檢測的致病菌。上述的雙重PCR反應體系的擴增方法，擴增條件為56°C退火30s，72°C延伸45s，共28個循環(huán)。當檢測的致病菌種類增加時，上述PCR反應體系的總體積及組分也有相應變動，作為一種能檢測三種以上致病菌的PCR體系優(yōu)選方案，這種同時檢測多種致病菌的多重PCR反應體系為50ML，其中2XPCRmix 12. 5 u L, 10 u mol/L的上、下游引物各0. 4ML，待檢測樣品DNA模板I. 0 ii L，超純水補足50ML ;所述上、下游引物為SEQ ID NO: TlO中任意三種以上檢測用引物對中的上、下游引物，如果選擇引物對和/或引物對，其上、下游引物需各加IML ;所述致病菌為所選引物對所對應能檢測的致病菌。上述的多重PCR反應體系的擴增方法，擴增條件為56°C退火30s，72°C延伸45s，共28個循環(huán)。多重PCR體系中增加了引物和模板，影響反應的因素增多，互相之間增加了干擾。因此增加了設計引物的難度。除此之外體系中各成分的量和循環(huán)參數(shù)也需在實驗中做適當調整，以減少非特異性擴增的影響，平衡各產(chǎn)物的量，獲得清晰的各段電泳條帶。實際檢測中模板的量是不能確定的，因此引物的濃度和其他成分要保證充分供給，也不能過量，這對檢測結果有直接影響。因此在體系中重點調整的是引物的濃度。本發(fā)明的同時檢測多種致病菌的檢測用引物特異性強，可用于制備農(nóng)副產(chǎn)品尤其是水產(chǎn)品致病菌的檢測試劑。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(I)本發(fā)明篩選出了多種特異性強的致病菌PCR擴增引物，建立了一種同時檢測多種致病菌的多重PCR方法，為快速、高效檢測農(nóng)副產(chǎn)品中多種致病菌提供了一種簡便快速的方法。(2)本發(fā)明的 5 對弓丨物 invA-up，down, hly~up, down, toxR-up，down,ipaH-up, down，vcc-up，down只引起相應祀基因的特異性擴增,無任何非特異性擴增，顯示了良好的特異性，在實踐中能夠避免假陽性結果的出現(xiàn)。(3)本發(fā)明的檢測方法擴增反應快速、高效、簡便，整個擴增在不到2小時即可完成。
(4)本發(fā)明的5對引物在六種細菌單重PCR檢測中靈敏度都在103cfu/mL 104cfu/mL,顯示了高靈敏度。(5)能夠同時檢測多種致病性細菌通過對六種致病菌的特異基因片段的選擇，通過ー個多重PCR體系的建立和調試，成功同時擴增出了六種菌，并且六種菌隨機組合的擴增也成功，未出現(xiàn)相互間強抑制現(xiàn)象。


圖I.鼠傷寒沙門氏菌DNA為模板的引物i/o#/ 退火溫度梯度 實驗結果電泳結果圖，注=Tio道從左起分別為退火溫度(°C): 50，50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55.8，56. 9，58. 1，59. I。圖2.甲型副傷寒沙門氏菌DNA為模板的引物invA-即，down退火溫度梯度實驗結果電泳結果圖，注10道從左起分別為退火溫度(°C): 50，50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. 1，59. I。圖3.引物Aか-or i/o#/ 退火溫度梯度實驗結果電泳結果圖，注f 10道從左起分別為退火溫度(°C) 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I, 59. 7。圖4. 3\嫩toxR-up, down退火溫度梯度實驗結果電泳結果圖，注f 10道從左起分別為退火溫度(°C) 50, 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I。圖5.引物退火溫度梯度實驗結果電泳結果圖,注]Λ10道從左起分別為退火溫度(°C) 50, 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I。圖6.引物退火溫度梯度實驗結果電泳結果圖，注]Λ10道從左起分別為退火溫度(°C) 50, 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I。圖7.引物invA-up，down對幾種菌的擴增電泳結果圖,注1為陰性對照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.鼠傷寒沙門氏菌，3.甲型副傷寒沙門氏菌，4.單核細胞增生李斯特氏菌，5.副溶血性弧菌，6.福氏志賀氏菌，7.非Ol群霍亂弧菌。圖8.引物i/o#/ 對六種菌的擴增電泳結果圖，注I為陰性對照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.甲型副傷寒沙門氏菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.單核細胞增生李斯特氏菌，5.副溶血性弧菌，6.福氏志賀氏菌，7.非Ol群霍亂弧菌。圖9.引嫩hly-up, down對六種菌的擴增電泳結果圖，注I為陰性對照，cT 道分別為不同菌株基因組模板2.單核細胞增生李斯特氏菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.甲型副傷寒沙門氏菌，5.副溶血性弧菌，6.福氏志賀氏菌，7.非Ol群霍亂弧菌。圖10.引物ioi-UR i/o#/ 對六種菌的擴增電泳圖，注I為陰性對照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.副溶血性弧菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.甲型副傷寒沙門氏菌，5.單核細胞增生李斯特氏菌，6.福氏志賀氏菌，7.非02群霍亂弧菌。圖11.引物ipaH-up’ down對六種菌的擴增電泳圖，注I為陰性對照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.福氏志賀氏菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.甲型副傷寒沙門氏菌，5.單核細胞增生李斯特氏菌，6.副溶血性弧菌，7.非02群霍亂弧菌。圖12.引物ゐ_對六種菌的擴增，注I為陰性對照，2 7道分別為不同菌株基因組模板2.非01群霍亂弧菌，3.鼠傷寒沙門氏菌，4.甲型副傷寒沙門氏菌，5.單核細胞增生李斯特氏菌，6.副溶血性弧菌，7.福氏志賀氏菌。
圖13.鼠傷寒沙門氏菌靈敏度檢測結果，f 8道分別為108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^圖14.甲型副傷寒沙門氏菌靈敏度檢測結果，f 8道分別為108、107、106、105、104、IO3UO2UO1CfuM^圖15.單核細胞增生李斯特氏菌靈敏度檢測結果，廣8道分別為108、107、106、105、IO4UO3UO2UO1Cfu/!!!!^圖16.副溶血性弧菌靈敏度檢測結果，1 8道分別為108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^圖17.福氏志賀氏菌靈敏度檢測結果，f 8道分別為108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^圖18.非01群霍亂弧菌靈敏度檢測結果，廣8道分別為108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^圖19. 二重PCR電泳檢測結果，1,2擴增和基因，3,4擴增和基因，5，6擴增invA和基因，7，8擴增invA和rcc基因。圖20. 二重PCR電泳檢測結果，I，2擴增in W和基因，3，4擴增invA和toxR基因，5，6擴增invA和基因，7，8擴增invA和rcc基因。圖21. 二重PCR電泳檢測結果，I，2擴增hly和toxR基因，3，4擴增hly和ipaH基因，5，6擴增hly和Mc基因。圖22. 二重PCR電泳檢測結果，I, 2擴增toxR和基因，3，4擴增toxR和wc基因，5，6擴增ipaHM MC基因。圖23. 二重PCR電泳檢測結果，I擴增in vA和toxR基因，2擴增in vA和ipaH基因，3擴增invA和MC基因，4擴增hly和toxR基因，5擴增hly和toxR基因，6擴增hly和toxR基因。圖24. 二重PCR電泳檢測結果，I擴增in vA和toxR基因，2擴增in vA和ipaH基因，3擴增invA和MC基因，4擴增hly和toxR基因，5擴增hly和toxR基因，6擴增hly和toxR基因。圖25.三重PCR電泳檢測結果，I，2擴增in vA、ipaH和wc基因，3，4擴增in vA、vcc 和 toxR 基因，5，6 擴增 invA、toxR 和基因，7, 8 擴增 invA、hly 和 vcc 基因，9，10擴增 invA、ipaHM 基因，11，12 擴增 invA、hly 和 toxR 基因。圖26.三重PCR電泳檢測結果，I, 2擴增invA、hly和toxR基因，3，4擴增invA、 和 hly 基因，5，6 擴增 invA、hly 和 vcc 基因，7，8 擴增 invA、toxR 和基因，9, 10
擴增 invA、vcc 和 tiorT 基因，11，12 擴增 invA、和 vcc 基因。圖27.三重PCR電泳檢測結果，I, 2擴增A7_f、ipaHM 基因，3，4擴增從F、toxR 和 vcc 基因，5，6 擴增 hly.、和 vcc 基因，7，8 擴增 fcc、toxR 和基因。圖28.四重PCR電泳檢測結果，I，2擴增in vA、hly、ipaH和toxR基因，3，4擴增hly、toxR.、和 vcc 基因。圖29.四重PCR電泳檢測結果，1,2,3擴增hly、toxR、ipaHM vcc基因。圖30.五重PCR電泳檢測結果，I, 2, 3, 4擴增invA、hly、toxR、ipaH和vcc基因。圖31.五重PCR電泳檢測結果，I, 2, 3,擴增invA、hly、toxR、ipaH取vcc基因。、
圖32.五重 PCR 電泳檢測結果，I, 2, 3, 4, 5, 6 擴增 invA.、hly.、toxR、ipaH和 rcc基因，1，2擴增invA、hly基因引物量為toxR、か成和基因2倍，3，4擴增invA、hly基因引物量為toxR、ipaim vcc基因3倍，5，6擴增invA、hly基因引物和模板量均為toxR、
和vcc基因2倍。
具體實施例方式以下實施例中如無特殊說明，均為本領域常規(guī)實驗試劑和常規(guī)操作步驟。實施例I五種致病菌檢測引物的設計與篩選
I.I實驗材料
主要工具酶類、生化試劑及試劑盒
LB肉湯、各種生化管、李氏增菌液等試劑購自廣州環(huán)凱生物試劑有限公司。Taq DNA聚合酶(Fermentas)，溶菌酶，細菌基因組DNA提取試劑盒(天根)，普通瓊脂糖凝膠，DNA回收試劑盒(天根)，PGM-T19連接含試劑盒(含載體，連接酶)購自廣州市寶泰克生物科技有限公司，質粒DNA小量提取試劑盒(天根)，EB替代染料(北京普利菜)；Tip和Tip盒、離心管、玻璃試管、平皿、三角瓶等耗材購自廣州市韻薈試驗儀器公司；其他試劑均為分析純常規(guī)試劑。LB固體培養(yǎng)基在LB肉湯基礎上加入比例為15g L_1的瓊脂粉，混勻煮沸熔化滅菌。營養(yǎng)肉湯NB培養(yǎng)基(IL):牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，ρΗ7· 4。實驗菌株來源及編號見表I 表I實驗菌株及來源
菌種名稱菌種編號來源
,SHSf —黃埔出入境檢驗撿顧
CMCC_15黃埔出入境檢驗檢顧
!SI=S 置哪湖翻出入境檢驗檢顧
歷mm龍出入境麵檢顧
(01)■卿廁黃埔出入境檢驗纖
——畫禪皿_黃埔出入境檢驗薩_
感受態(tài)細蟲 菌E-COH華獻業(yè)大學動物糇學院家禽·究室
1.2引物設計
PCR擴增菌特異靶基因的選用沙門氏菌inv基因簇-編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白基因W，單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因Aか，副溶血性弧菌ioi基因，福氏志賀氏菌侵襲性質?？乖璈基因iPaH7,非01群霍亂弧菌基因。
于NCBI網(wǎng)站檢索相應基因序列,用Primer premier 5.0軟件設計多重引物，詳見表2。引物由北京奧科生物工程技術有限公司合成，合成后的引物用超純水稀釋成10mmol/mL溶液，-20 °C保存。引物序列如下
表2引物及相關信息
權利要求
1.同時檢測多種水產(chǎn)品致病菌的引物，其特征在于核苷酸序列如下 invA 引物對SEQ ID NO: I 2 ； hly 引物對SEQ ID NO:3 4 ； ioi 引物對SEQ ID NO: 5^6 ； 引物對SEQ ID NO :7 8 ； vcc 引物對SEQ ID NO :9 10 ； 以上任何兩對以上引物組合,可以檢測該弓I物對所對應的致病菌； 其中invA引物對用于檢測鼠傷寒沙門氏菌和/或甲型副傷寒沙門氏菌引物對用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌，引物對用于檢測副溶血性弧菌，引物對用于檢測福氏志賀氏菌，KCC引物對用于檢測非見群霍亂弧菌。
2.一種同時檢測多種水產(chǎn)品致病菌的檢測方法，其特征在于使用權利要求I所述的任何兩對以上檢測用引物對，以待檢樣品中提取的DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物電泳結果出現(xiàn)以下條帶，表明待檢樣品中存在相應的致病菌 . 214bp :副溶血性弧菌； .394bp :福氏志賀氏菌； .490bp :非01群霍亂弧菌； .568bp :鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌； .797bp :單核細胞增生李斯特氏菌。
3.一種同時檢測兩種致病菌的雙重PCR反應體系，其特征在于反應體系為25μ ，其中.2 XPCRmix 12. 5μ L，10 μ mol/L的上、下游引物各O. 4μ ，待檢測樣品DNA模板I. O μ L，超純水補足25μ ； 所述上、下游引物為權利要求I所述的任意兩種檢測用引物對中的上、下游引物，如果選擇引物對和/ WLhly引物對，其上、下游引物需各加WL ； 所述致病菌為選擇的權利要求I所述引物對所對應能檢測的致病菌。
4.權利要求3所述同時檢測兩種致病菌的雙重PCR反應體系的擴增方法，其特征在于擴增條件為56°C退火30s，72°C延伸45s，共28個循環(huán)。
5.一種同時檢測多種致病菌的多重PCR反應體系，其特征在于反應體系為50μ ，其中.2 XPCRmix 12. 5μ L，10 μ mol/L的上、下游引物各O. 4μ ，待檢測樣品DNA模板I. O μ L，超純水補足50μ ； 所述上、下游引物為權利要求I所述的任意三種以上檢測用引物對中的上、下游引物，如果選擇引物對和/或hly引物對，其上、下游引物需各加WL ;所述致病菌為選擇的權利要求I所述引物對所對應能檢測的致病菌。
6.權利要求5所述同時檢測多種致病菌的多重PCR反應體系的擴增方法，其特征在于擴增條件為56°C退火30s，72°C延伸45s，共28個循環(huán)。
7.權利要求I所述同時檢測多種致病菌的引物在制備農(nóng)副產(chǎn)品致病菌檢測試劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了同時檢測多種致病菌的檢測用引物及檢測方法。所述引物的核苷酸序列為invA引物對，用于檢測鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌；hly引物對，用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌；toxR引物對，用于檢測副溶血性弧菌；ipaH引物對，用于檢測福氏志賀氏菌；以及vcc引物對，用于檢測非O1群霍亂弧菌。本發(fā)明同時公開了一種利用上述各引物對建立的多重PCR擴增體系，使用這一體系可快速準確地檢測出待檢樣品中是否有相應致病菌，整個檢測過程用時不到2小時，簡單方便，且每對引物特異性都很高，不會出現(xiàn)假陽性結果，可以做成試劑盒等，在農(nóng)副產(chǎn)品致病菌檢測中非常適用。
文檔編號C12N15/11GK102634580SQ20121009654
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月5日 優(yōu)先權日2012年4月5日
發(fā)明者呂英姿, 孫寶麗, 張凌俊, 畢英佐, 謝青梅 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學