專利名稱：一種污染土壤遺傳毒性的原位檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于污染土壤遺傳毒性檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種污染土壤遺傳毒性的原位檢測方法。
背景技術(shù)：
遺傳毒性指化學物對生物體遺傳物質(zhì)損傷造成的毒性，并可能由此引起腫瘤、突變或畸形(參考文獻I、印木泉.遺傳毒理學.北京科學出版社，2002.)。與普通的化學毒性相比，遺傳毒性作用緩慢，因此其危害可能在短時間內(nèi)被忽視而引起更嚴重的問題，而遺傳毒性檢測的難度也相應更大。當待測樣品以土壤為介質(zhì)時，通常有原位和異位兩種檢測方法。原位檢測指直接檢測土壤介質(zhì)中的污染物的毒性；異位檢測指將土壤介質(zhì)中的污染物提取至液相，通過間接檢測液相中的毒性以表征土壤樣品毒性(參考文獻2、Plaza G, Nalecz-Jawecki G，Ulfig K，et al. Assessment of genotoxic activity of petroleum hydrocarbon-bioremediated soil. Ecotoxicology and Environmental Safety,2005， 62(3) :415-420.)。在科學研究和工程應用中較常見的土壤遺傳毒性原位檢測方法，包括蚯蚓的彗星試驗(參考文獻3、Xiao R YiWang Z JiWang C X, et al. Genotoxic risk identification of soil contamination at a major industrialized city in northeast China by a combination of in vitro and in vivo bioassays. Environmental Science &Technology, 2006,40 (19) :6170-6175. ;4、Zhu J，Zhao Z Y，Lu Y T. Evaluation of genotoxicity of combined soil pollution by cadmium and phenanthrene on earthworm. Journal of Environmental Sciences-China，2006，18 (6) : 1210-1215.)、 植物種子發(fā)芽試驗(參考文獻5、李彬，李培軍，王晶，等.污染土壤毒性研究方法進展.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2003，4 (5) :42-46. ;6、Baek K H，Kim H S，Oh H M，et al.Effects of crude oil， oil components， and bioremediation on plant growth. Journal of Environmental Science and Health Part a-Toxic/Hazardous Substances &Environmental Engineering，2004，39 (9) :2465-2472.)、土壤微型動物繁殖情況(參考 文獻7、Patterson C J，Semple K T，Paton G I. Non-exhaustive extraction techniques (NEETs) for the prediction of naphthalene mineralisation in soil. Fems Microbiology Letters，2004，241 (2) :215-220.)等，但上述方法存在試驗周期長、操作復雜、靈敏度低、成本較高等缺陷，不適用于大量樣品快速靈敏的檢測。常見的土壤異位檢測方法，包括動物的生理生態(tài)監(jiān)測、動物細胞彗星試驗、AMES 細菌回復突變試驗、生物傳感細胞檢測等。然而土壤樣品異位毒性檢測方法具有以下嚴重不足在毒性檢測過程中引入了污染物萃取和固液分離的環(huán)節(jié)，增加了測試的不確定性以及測試的所需的時間和經(jīng)濟成本；經(jīng)過萃取的樣品不能代表污染物在土壤中的真實賦存狀態(tài)，從而導致高估或低估樣品的毒性；忽視了污染物在土壤介質(zhì)中的生物有效性等對遺傳毒性的重要影響(參考文獻8、Frische T. Ecotoxicological evaluation of in situ bioremediation of soils contaminated by the explosive 2，4， 6-trinitrotoluene(TNT) · Environmental Pollution，2003，121 (I) :103-113.)。上述遺傳毒性檢測方法中，生物傳感細胞在幾小時內(nèi)即對遺傳毒物作出靈敏響應，是一種快速靈敏的遺傳毒性檢測方法。生物傳感細胞對遺傳毒性檢測的原理是在細菌中構(gòu)建一個啟動基因和報道基因的融合體系，報告基因處于一個啟動基因的下游，受啟動基因的啟動子控制。啟動基因為誘導型表達基因，并且只在造成DNA損傷的毒性物質(zhì)或輻射等外界壓力存在下誘導表達。當啟動基因受遺傳毒物誘導表達，繼而使報道基因表達產(chǎn)生由其編碼的報告蛋白后，報告蛋白便可以通過分析手段進行檢測(參考文獻9、Tecon R， van der Meer J R.Information from single-cell bacterial biosensors what is it good for Current Opinion in Biotechnology，2006，17 (I) :4-10 ;10、Sorensen S J，Burmolle M，Hansen L H. Making bio-sense of toxicity new developments in whole-cell biosensors. Current Opinion in Biotechnology，2006，17 (I) :11-16 ;11、 Hansen L H，Sorensen S J. The use of whole-cell biosensors to detect and quantify compounds or conditions affecting biological systems. Microbial Ecology,2001， 42(4) :483-494 ;12、Rusling JF, Hvastkovs E G，Schenkman J B. Toxicity screening using biosensors that measure DNA damage. Current Opinion in Drug Discovery & Development，2007，10 (I) :67-73)。編碼蛋白的報告基因是生物傳感細胞的重要部分，既存在于某些天然微生物中， 也可以通過基因工程手段人為構(gòu)建。生物傳感細胞中常見的報道產(chǎn)物包括IacZ基因編譯的β -半乳糖苷酶，IuxAB和luxCDABE編譯的細菌熒光素酶，Iuc編譯的螢火蟲熒光素酶， gfp編譯的綠色熒光蛋白等。研究者目前已開發(fā)了多種遺傳毒性的生物傳感細胞檢測技術(shù)， 如 umu/SOS 顯色實驗、Vitotox (參考文獻13、Westerink W M K, Stevenson J C R, Lauwers A，et al. Evaluation of the Vitotox(TM)and RadarScreen assays for the rapid assessment of genotoxicity in the early research phase of drug development. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2009， 676(1-2) :113-130)和 sulA-test (參考文獻14、ElMzibri M，DeMeo M P，Laget M，et al. The Salmonella sulA—test :A new in vitro system to detect genotoxins. Mutation Research-Genetic Toxicology，1996，369 (3-4) :195-208)等。目前生物傳感細胞已被廣泛應用于土壤遺傳毒性的異位檢測。例如禹果等研究者，釆用umu方法評價受PAHs污染的北京郊區(qū)污灌土壤的遺傳毒性(參考文獻15、禹果， 肖睿洋，王春霞，等.利用mnu/SOS實驗評價污灌土壤的遺傳毒性.環(huán)境科學，2006，27 (6) 1162-1165) ；Xiao等研究者釆用umu方法研究天津地區(qū)41個土樣，發(fā)現(xiàn)主要污染物為 PAHs (PAHs含量5mg/kg)的污染土壤會誘導細胞，誘導值為對照的2倍(參考文獻16、Xiao R YiWang Z JiWang CX,et al. Genotoxic risk identification of soil contamination at a major industrialized city in northeast China by a combination of in vitro and in vivo bioassays. Environmental Science & Technology，2006，40 (19) 6170-6175)。然而如前所述，以生物傳感細胞原位檢測土壤遺傳毒性在國內(nèi)外尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種污染土壤遺傳毒性的原位檢測方法，能夠降低土壤樣品遺傳毒性評價的不確定性、減少時間和經(jīng)濟成本、更準確的評價土壤介質(zhì)的真實毒性、并且可以將污染物的暴露途徑與其毒性相關(guān)聯(lián)，具有很大的科學和應用價值。為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種污染土壤遺傳毒性的原位檢測方法，土壤樣品不需固液萃取和分離，而直接利用檢測遺傳毒性的生物傳感細胞進行檢測，包括如下步驟步驟I :生物傳感細胞的培養(yǎng)與準備將生物傳感細胞接種至新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其達到對數(shù)增長期，得到細胞懸濁液；步驟2 :土壤樣品的準備將土壤樣品風干、研磨過10目篩后，稱取預設(shè)質(zhì)量的樣品，與預設(shè)體積的去離子水混合，制備土壤樣品懸濁液；步驟3 :樣品遺傳毒性測試將步驟I中制備的細胞懸浮液與步驟2制備的土壤樣品懸濁液混合，使用能夠讀取化學發(fā)光的發(fā)光檢測儀或多功能酶標儀，每隔5-30min讀取并記錄混合液的化學發(fā)光值Ium ；步驟4 :數(shù)據(jù)處理對于待測土壤樣品，定義誘導倍數(shù)(IR)=某一時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻陰性對照土樣的發(fā)光強度；若顯著性檢驗IR > 1，則認為該土壤樣品具有遺傳毒性；在相同劑量下，IR越高，土壤樣品的遺傳毒性越強；在相同IR下，稱取的土壤劑量越小，土壤樣品的遺傳毒性越強。步驟I所述的生物傳感細胞為重組發(fā)光菌，在暴露于遺傳毒性物質(zhì)時，產(chǎn)生相應的發(fā)光增強現(xiàn)象。所述重組發(fā)光菌為Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux。所述重組發(fā)光菌為Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux 已于 2009 年 2 月 26 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 2925，該保藏中心簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。步驟2所述的土壤樣品的準備，對土壤樣品懸濁液進行超聲處理，使土壤顆粒進一步分散在懸池液中。所述超聲處理時間為200-300S，超聲波的頻率為38_40kHz。步驟2所述稱取的土壤樣品質(zhì)量在5mg至500mg之間，按照土水重量比I : 20最
終定容。本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點I、本發(fā)明利用暴露于遺傳毒物后發(fā)光增強的生物傳感細胞實現(xiàn)，該類生物傳感細胞攜帶發(fā)光基因片段，其發(fā)光基因片段與細胞內(nèi)的某種DNA損傷修復基因具有相同的啟動子，因此當該細胞暴露于遺傳毒物時，遺傳毒物誘導DNA損傷修復基因表達的同時，誘導發(fā)光基因表達，產(chǎn)生發(fā)光增強現(xiàn)象。發(fā)光基因表達的報道產(chǎn)物產(chǎn)生化學發(fā)光現(xiàn)象，與需要光激發(fā)才能發(fā)光的熒光基因報道產(chǎn)物不同，是一種生物的自發(fā)光效應。因此即使在土壤的混合介質(zhì)中，也可以被檢測到發(fā)光，從而實現(xiàn)對污染土壤樣品的直接檢測。2、本發(fā)明檢測土壤樣品遺傳毒性快速、靈敏，并且在檢測環(huán)節(jié)中不存在萃取和固液分離環(huán)節(jié)，從而降低了檢測結(jié)果的不確定性，更客觀反映污染物的真實賦存情況，更準確評價土壤介質(zhì)中污染物的真實毒性。


圖I為絲裂霉素C污染土壤遺傳毒性原位檢測與異位檢測誘導倍數(shù)的對比。圖2為利用生物傳感細胞ADP_recA_km_lux對石油污染土壤中多環(huán)芳烴污染物的遺傳毒性的表征結(jié)果。圖3為利用生物傳感細胞ADP_recA_km_lux對重金屬Cr污染土樣遺傳毒性的表征結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。除非特殊說明，本試驗所采用的方法均為常規(guī)方法，采用的材料或試劑均可以從商業(yè)途徑獲得。實施例I :絲裂霉素C污染土壤遺傳毒性的原位檢測與異位檢測對比步驟I :生物傳感細胞的培養(yǎng)與準備采用一株人工構(gòu)建的生物傳感細胞Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux,該細胞在暴露于遺傳毒性物質(zhì)時發(fā)光增強，該菌株已于2009年2月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 2925，該保藏中心簡稱CGMCCJi 址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。從含有10mg/L卡那霉素的LB平板中(LBAKM10)挑取一個重組發(fā)光菌 Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux單菌落，接種于含有10mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中 (LBKMlO)，30°C于150rpm搖床中過夜培養(yǎng)16h，離心后重懸，用新鮮LBKMlO培養(yǎng)基將細菌稀釋10倍以獲得細胞懸濁液，待用；步驟2 土壤樣品的準備配制濃度為20mg/L、2mg/L、0. 2mg/L、0. 02mg/L的絲裂霉素C(MMC)溶液，各濃度梯度分別取Iml與5g無污染土壤混合，自然風干，得到MMC最終濃度為4mg/kg、0. 4mg/ kg、0. 04mg/kg、0. 004mg/kg的污染土壤；分別稱取250mg污染土壤樣品，按照土水重量比 I 20定容，得到土壤樣品懸濁液。步驟3 :樣品遺傳毒性測試I)原位檢測將步驟2得到的不同MMC濃度的土壤樣品懸濁液置于頻率為38_40kHz的超聲清洗儀中，施加超聲300s，得到不同MMC濃度的土壤樣品待測液；取198μ L步驟I中稀釋的細胞懸濁液，加入黑色底透的96孔酶標板孔內(nèi)，再向每個孔中加入2 μ L不同MMC濃度的土壤樣品待測液，每種土壤樣品待測液做3組平行樣，使用能夠讀取96孔酶標板化學發(fā)光和吸光度的多功能酶標儀(SpectraMax M2Molecular Device Corporation),每隔30min讀取并記錄37°C溫度條件下96孔板中每一個孔的化學發(fā)光 (Ium)及600nm的吸光度(0D600)，兩次測量間隔96孔板在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。計算誘導倍數(shù)(IR)=暴露3小時時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻空白土樣的發(fā)光強度；
2)異位檢測將步驟2得到的不同MMC濃度的土壤樣品懸濁液置于頻率為38_40kHz的超聲清洗儀中，施加超聲5-10min, 1500rpm進行離心分離，得到不同MMC濃度的上清液進行遺傳毒性測試，取198 μ L步驟I中稀釋的細胞懸濁液，加入黑色底透的96孔酶標板孔內(nèi)，再向每個孔中加入2 μ L不同MMC濃度的土壤樣品待測液，每種土壤樣品待測液做3組平行樣， 使用能夠讀取96孔酶標板化學發(fā)光和吸光度的多功能酶標儀(SpectraMax M2Molecular Device Corporation),每隔30min讀取并記錄37°C溫度條件下96孔板中每一個孔的化學發(fā)光(Ium)及600nm的吸光度(0D600)，兩次測量間隔96孔板在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。計算誘導倍數(shù)(IR)=暴露3小時時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻空白土樣的發(fā)光強度；污染土壤中MMC濃度與誘導倍數(shù)的關(guān)系曲線如圖I所示，由圖可見，通過應用原位檢測法，發(fā)光重組菌可以直接被土壤中的MMC誘導而產(chǎn)生發(fā)光增強現(xiàn)象，并且細胞發(fā)光與污染土壤中MMC含量呈現(xiàn)劑量效應關(guān)系。顯著性檢驗表明，細胞可以檢出MMC含量為O. 4mg/ kg的污染土壤所具有的遺傳毒性；應用異位檢測法，發(fā)光重組菌可以檢出4mg/kg污染土壤所具有的遺傳毒性，其檢測靈敏度遠低于原位檢測法。該結(jié)果同時表明，由于土壤介質(zhì)對污染物具有吸附作用，導致異位毒性檢測過程中，部分MMC不能被超聲萃取至液相。然而殘留在土壤中的MMC盡管不可萃取，但對微生物依然體現(xiàn)遺傳毒性。因此采用異位檢測法將不能準確評價污染土壤的遺傳毒性，而原位檢測法能較好的反映MMC在介質(zhì)中的遺傳毒性。實施例2 :重組發(fā)光菌對石油污染土壤遺傳毒性的原位檢測步驟I :生物傳感細胞的培養(yǎng)與準備從含有10mg/L卡那霉素的LB平板中(LBAKM10)挑取一個重組發(fā)光菌 Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux單菌落，接種于含有10mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中 (LBKM10)，30°C于150rpm搖床中過夜培養(yǎng)16h，離心后重懸，用新鮮LBKM10培養(yǎng)基將細菌稀釋10倍以獲得細胞懸濁液，待用；步驟2 土壤樣品的準備污染土壤樣品1、2、3采集于勝利油田油井附近的表層土壤，通過常規(guī)的GC-MS方法對污染土壤成分進行分析表明樣品中苯并芘等多環(huán)芳烴污染物污染嚴重；將風干的污染土壤樣品1、2、3與去離子水以重量比I : 20的比例混合，制備土壤樣品懸濁液，并置于頻率為38-40kHz的超聲清洗儀中，施加超聲300s，得到土壤樣品待測液 1、2、3 ；步驟3 :樣品遺傳毒性測試取198 μ L步驟I中稀釋的細胞懸濁液，加入黑色底透的96孔酶標板孔內(nèi)，再向每個孔中加入2 μ L步驟2得到的土壤待測液樣品的一種，每種土壤樣品待測液樣品做 3組平行樣，使用能夠讀取96孔酶標板化學發(fā)光和吸光度的多功能酶標儀(SpectraMax M2Molecular Device Corporation),每隔30min讀取并記錄37°C溫度條件下96孔板中每一個孔的化學發(fā)光(Ium)及600nm的吸光度(0D600)，兩次測量間隔96孔板在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；步驟4 :數(shù)據(jù)處理
誘導倍數(shù)(IR)=暴露3小時時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻空白土樣的發(fā)光強度；三個污染土壤樣品中的苯并[a]芘、多環(huán)芳烴總量以及發(fā)光誘導倍數(shù)如圖2所示。三個土壤樣品中，有兩個檢測到遺傳毒性(t檢驗，P < O. 05)，發(fā)光誘導系數(shù)與BaP 和PAHs的濃度的線性相關(guān)系數(shù)分別為O. 94和O. 86，對高環(huán)PAHs表現(xiàn)出突出的靈敏度，檢出遺傳毒性的土壤樣品中PAHs最低含量為4. 17mg/kg，其中BaP含量O. 05mg/kg。有研究者利用土壤中線蚓或跳蟲考察PAHs污染土壤遺傳毒性，在21 329d的實驗周期內(nèi)，對PAHs 檢測限為100 931mg/kg。與該方法相比，本發(fā)明所提供的方法可以迅速且高靈敏度表征油田污染土壤的遺傳毒性。實施例3 :重組發(fā)光菌對重金屬污染土壤遺傳毒性的原位檢測步驟I :生物傳感細胞的培養(yǎng)與準備從含有10mg/L卡那霉素的LB平板中(LBAKM10)挑取一個重組發(fā)光菌 Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux單菌落，接種于含有10mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中 (LBKMlO)，30°C于150rpm搖床中過夜培養(yǎng)16h，離心后重懸，用新鮮LBKMlO培養(yǎng)基將細菌稀釋10倍以獲得細胞懸液，待用； 步驟2 :土壤樣品的準備配制摩爾濃度為2. 5X10_1mol/L,2. 5 X l(T2mol/L、2. 5 X l(T3mol/L、2. 5X ΙΟΛιοΙ/ L的重鉻酸鉀溶液，取Iml上述不同濃度的溶液加入5g無污染土壤中，自然風干，得到六價 Cr最終濃度為5. 2mg/g、0. 52mg/g、0. 052mg/g、0. 0052mg/g的污染土壤樣品；取風干土壤樣品250mg，按照土水重量比I : 20定容。土壤樣品置于超聲清洗儀中超聲300s，得到不同六價Cr濃度的土壤樣品待測液；步驟3 :樣品遺傳毒性測試取198yL步驟I中稀釋的細胞懸濁液，加入黑色底透的96孔酶標板孔內(nèi)，再向每個孔中加入2 μ L不同Cr濃度的土壤樣品待測液，每種土壤樣品待測液做3組平行樣，去離子水做陰性對照，使用能夠讀取96孔酶標板化學發(fā)光和吸光度的多功能酶標儀 (SpectraMax M2Molecular Device Corporation),每隔 30min 讀取并記錄37°C溫度條件下 96孔板中每一個孔的化學發(fā)光(Ium)及600nm的吸光度(0D600)，兩次測量間隔96孔板在 37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；步驟4 :數(shù)據(jù)處理誘導倍數(shù)(IR)=暴露3小時時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻空白土樣的發(fā)光強度；污染土壤中鉻含量與相對誘導倍數(shù)的關(guān)系曲線如圖3所示，由圖可見，原位檢測法對重鉻酸鉀污染土壤具有較高的靈敏度，檢測限可低至0. 01mg/g以下，以對數(shù)坐標表示的土壤中Cr的含量與相對誘導倍數(shù)存在典型的劑量-效應關(guān)系，即在一定的濃度范圍內(nèi)， 隨著土壤中Cr含量的增加，相對誘導倍數(shù)顯著升高；當Cr含量達到5mg/g時，由于遺傳毒性超出生物傳感細胞的耐受限度，相對誘導倍數(shù)反而有所下降。
權(quán)利要求
1.一種污染土壤遺傳毒性的原位檢測方法，其特征在于土壤樣品不需固液萃取和分離，而直接利用檢測遺傳毒性的生物傳感細胞進行檢測，包括如下步驟步驟I:生物傳感細胞的培養(yǎng)與準備將生物傳感細胞接種至新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其達到對數(shù)增長期，得到細胞懸濁液；步驟2 :土壤樣品的準備將土壤樣品風干、研磨過10目篩后，稱取預設(shè)質(zhì)量的樣品，與預設(shè)體積的去離子水混合，制備土壤樣品懸濁液；步驟3 :樣品遺傳毒性測試將步驟I中制備的細胞懸浮液與步驟2制備的土壤樣品懸濁液混合，使用能夠讀取化學發(fā)光的發(fā)光檢測儀或多功能酶標儀，每隔5-30min讀取并記錄混合液的化學發(fā)光值Ium ；步驟4 :數(shù)據(jù)處理對于待測土壤樣品，定義誘導倍數(shù)(IR)=某一時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻陰性對照土樣的發(fā)光強度；若顯著性檢驗IR > 1，則認為該土壤樣品具有遺傳毒性；在相同劑量下，IR越高，土壤樣品的遺傳毒性越強；在相同IR下，稱取的土壤劑量越小，土壤樣品的遺傳毒性越強。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的原位檢測方法，其特征在于步驟I所述的生物傳感細胞為重組發(fā)光菌，在暴露于遺傳毒性物質(zhì)時，產(chǎn)生相應的發(fā)光增強現(xiàn)象。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的原位檢測方法，其特征在于所述重組發(fā)光菌為 Acinetobacter sp. ADP—recA—km—lux。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的原位檢測方法，其特征在于所述重組發(fā)光菌為 Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux已于2009年2月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 2925，該保藏中心簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的原位檢測方法，其特征在于步驟2所述的土壤樣品的準備， 對土壤樣品懸濁液進行超聲處理，使土壤顆粒進一步分散在懸濁液中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的原位檢測方法，其特征在于所述超聲處理時間為200-300S， 超聲波的頻率為38-40kHz。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的原位檢測方法，其特征在于步驟2所述的土壤樣品質(zhì)量在 5mg至500mg之間，按照土水重量比I : 20最終定容。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的原位檢測方法，其特征在于包括如下步驟步驟I :生物傳感細胞的培養(yǎng)與準備從含有10mg/L卡那霉素的LB平板LBAKM10中挑取一個重組發(fā)光菌Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux單菌落，接種于含有10mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基LBKMlO中，30°C于 150rpm搖床中過夜培養(yǎng)16h，離心后重懸，用新鮮LBKMlO培養(yǎng)基將細菌稀釋10倍以獲得細胞懸池液，待用；步驟2:土壤樣品的準備配制濃度為20mg/L、2mg/L、0. 2mg/L、0. 02mg/L的絲裂霉素C溶液，各濃度梯度分別取Iml與5g無污染土壤混合，自然風干，得到絲裂霉素C最終濃度為4mg/kg、0. 4mg/ kg、O. 04mg/kg、0. 004mg/kg的污染土壤；分別稱取250mg污染土壤樣品，按照土水重量比 I 20混合，得到土壤樣品懸濁液。步驟3 :樣品遺傳毒性測試將步驟2得到的不同MMC濃度的土壤樣品懸濁液置于頻率為38-40kHz的超聲清洗儀中，施加超聲300s，得到不同MMC濃度的土壤樣品待測液；取198 μ L步驟I中稀釋的細胞懸濁液，加入黑色底透的96孔酶標板孔內(nèi)，再向每個孔中加入2μ L不同MMC濃度的土壤樣品待測液，每種土壤樣品待測液做3組平行樣，使用能夠讀取96孔酶標板化學發(fā)光和吸光度的多功能酶標儀，每隔30min讀取并記錄37°C溫度條件下96孔板中每一個孔的化學發(fā)光及600nm的吸光度，兩次測量間隔96孔板在37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。步驟4 :數(shù)據(jù)處理誘導倍數(shù)IR =暴露3小時時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻空白土樣的發(fā)光強度。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的原位檢測方法，其特征在于包括如下步驟步驟I :生物傳感細胞的培養(yǎng)與準備從含有10mg/L卡那霉素的LB平板LBAKM10中挑取一個重組發(fā)光菌Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux單菌落,接種于含有10mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基LBKMlO中，30°C于 150rpm搖床中過夜培養(yǎng)16h，離心后重懸，用新鮮LBKMlO培養(yǎng)基將細菌稀釋10倍以獲得細胞懸池液，待用；步驟2:土壤樣品的準備污染土壤樣品1、2、3采集于勝利油田油井附近的表層土壤，通過常規(guī)的GC-MS方法對污染土壤成分進行分析表明樣品中苯并芘等多環(huán)芳烴污染物污染嚴重；將風干的污染土壤樣品1、2、3與去離子水以重量比I : 20的比例混合，制備土壤樣品懸濁液，并置于頻率為38-40kHz的超聲清洗儀中，施加超聲300s，得到土壤樣品待測液I、2、3 ；步驟3 :樣品遺傳毒性測試取198 μ L步驟I中稀釋的細胞懸濁液，加入黑色底透的96孔酶標板孔內(nèi)，再向每個孔中加入2 μ L步驟2得到的土壤待測液樣品的一種，每種土壤樣品待測液樣品做3組平行樣，使用能夠讀取96孔酶標板化學發(fā)光和吸光度的多功能酶標儀，每隔30min讀取并記錄 37°C溫度條件下96孔板中每一個孔的化學發(fā)光及600nm的吸光度，兩次測量間隔96孔板在37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；步驟4 :數(shù)據(jù)處理誘導倍數(shù)IR =暴露3小時時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻空白土樣的發(fā)光強度。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的原位檢測方法，其特征在于包括如下步驟步驟I:生物傳感細胞的培養(yǎng)與準備從含有10mg/L卡那霉素的LB平板LBAKM10中挑取一個重組發(fā)光菌Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux單菌落,接種于含有10mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基LBKMlO中，30°C于 150rpm搖床中過夜培養(yǎng)16h，離心后重懸，用新鮮LBKMlO培養(yǎng)基將細菌稀釋10倍以獲得細胞懸液，待用；步驟2:土壤樣品的準備配制摩爾濃度為 2. 5X10^1101/1、2. 5Xl(T2mol/L、2. 5 X l(T3mol/L、2. 5Xl(T4mol/L 的重鉻酸鉀溶液，取Iml上述不同濃度的溶液加入5g無污染土壤中，自然風干，得到六價Cr 最終濃度為5. 2mg/g、0. 52mg/g、0. 052mg/g、0. 0052mg/g的污染土壤樣品；取風干土壤樣品 250mg，按照土水重量比I : 20定容。土壤樣品置于超聲清洗儀中超聲300s，得到不同六價Cr濃度的土壤樣品待測液；步驟3 :樣品遺傳毒性測試取198 μ L步驟I中稀釋的細胞懸濁液，加入黑色底透的96孔酶標板孔內(nèi)，再向每個孔中加入2 μ L不同Cr濃度的土壤樣品待測液，每種土壤樣品待測液做3組平行樣，去離子水做陰性對照，使用能夠讀取96孔酶標板化學發(fā)光和吸光度的多功能酶標儀，每隔30min讀取并記錄37°C溫度條件下96孔板中每一個孔的化學發(fā)光及600nm的吸光度，兩次測量間隔96孔板在37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；步驟4 :數(shù)據(jù)處理誘導倍數(shù)IR=暴露3小時時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻空白土樣的發(fā)光強度。
全文摘要
一種污染土壤遺傳毒性的原位檢測方法，土壤樣品不需固液萃取和分離，而直接利用檢測遺傳毒性的生物傳感細胞進行檢測，首先將生物傳感細胞接種至新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其達到對數(shù)增長期，得到細胞懸濁液；然后稱取預設(shè)質(zhì)量的土樣風干、研磨后，與預設(shè)體積的去離子水混合，制備土壤樣品懸濁液；隨后將細胞懸浮液與土壤樣品懸濁液混合，讀取并記錄混合液的化學發(fā)光值；最后定義誘導倍數(shù)(IR)＝某一時刻污染土樣的發(fā)光強度/相同時刻陰性對照土樣的發(fā)光強度；若IR＞1，則該土壤樣品具有遺傳毒性；本方法能降低土壤樣品遺傳毒性評價的不確定性、減少成本，更準確的評價土壤介質(zhì)的真實毒性、并且可以將污染物的暴露途徑與其毒性相關(guān)聯(lián)，具有很大的科學和應用價值。
文檔編號C12Q1/02GK102605036SQ201210096428
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月1日
發(fā)明者姜博, 宋一之, 張旭, 李廣賀, 田思聰, 黃巍 申請人:清華大學