專利名稱：一種檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的方法及其專用dna芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的方法及其專用DNA芯片。
背景技術(shù)：
自從美國(guó)經(jīng)歷“炭疽郵件”襲擊事件以后，反生物恐怖已經(jīng)成為國(guó)際反恐斗爭(zhēng)中一個(gè)重要組成部分。應(yīng)對(duì)生物恐怖威脅的先決條件之一就是要對(duì)于生物恐怖相關(guān)病原進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。
目前，利用基因芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的通用檢測(cè)鑒定一直是國(guó)內(nèi)外微生物學(xué)家研究的重要領(lǐng)域。目前，細(xì)菌通用檢測(cè)芯片最常用的策略是利用細(xì)菌中保守的16S rRNA基因或23SrRNA基因，設(shè)計(jì)通用的擴(kuò)增引物和各細(xì)菌特異的寡核苷酸探針固定在芯片上，用通用引物擴(kuò)增待檢測(cè)標(biāo)本并進(jìn)行標(biāo)記，與芯片雜交，根據(jù)雜交信號(hào)進(jìn)行判斷。但是由于種種原因，所設(shè)計(jì)的一些寡核苷酸探針特異性并不理想，有比較嚴(yán)重的交叉反應(yīng)現(xiàn)象，檢測(cè)特異性不強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的方法及其專用DNA芯片。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的DNA芯片，包括下述1)至16)中的至少一種探針1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)序列表中SEQ ID №3的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)序列表中SEQ ID №4的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；5)序列表中SEQ ID №5的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；6)序列表中SEQ ID №6的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；7)序列表中SEQ ID №7的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；8)序列表中SEQ ID №8的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；9)序列表中SEQ ID №9的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №9限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；10)序列表中SEQ ID №10的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №10限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；11)序列表中SEQ ID №11的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №11限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；12)序列表中SEQ ID №12的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；13)序列表中SEQ ID №13的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №13限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；14)序列表中SEQ ID NQ14的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №14限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；15)序列表中SEQ ID №15的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №15限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；16)序列表中SEQ ID №16的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在2×雜交液(10×SSC，0.04％SDS，200μg/μl鮭魚精DNA，10％硫酸葡聚糖)中，在65℃下雜交，之后進(jìn)行洗芯片。
序列表中的SEQ ID №1由334個(gè)脫氧核苷酸組成，是炭疽芽孢桿菌致死因子基因(Balf)，可用于檢測(cè)炭疽芽孢桿菌；序列表中的SEQ ID №2由249個(gè)脫氧核苷酸組成，是炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原基因(Bapa)，可用于檢測(cè)炭疽芽孢桿菌；序列表中的SEQ ID №3由268個(gè)脫氧核苷酸組成，是類鼻疽伯克霍爾德氏菌fur基因(Bpfur)，可用于檢測(cè)類鼻疽伯克霍爾德氏菌；序列表中的SEQ ID №4由319個(gè)脫氧核苷酸組成，是類鼻疽伯克霍爾德氏菌膜蛋白基因(Bpsl)，可用于檢測(cè)類鼻疽伯克霍爾德氏菌；序列表中的SEQ ID №5由416個(gè)脫氧核苷酸組成，是布魯氏菌31kd蛋白基因(Bra31kd)，可用于檢測(cè)布魯氏菌；序列表中的SEQ ID №6由413個(gè)脫氧核苷酸組成，是布魯氏菌外膜蛋白基因omp2(Bromp)，可用于檢測(cè)布魯氏菌；序列表中的SEQ ID №7由421個(gè)脫氧核苷酸組成，是伯氏考克斯體27kd抗原基因(Coxb27kd)，可用于檢測(cè)伯氏考克斯體；序列表中的SEQ ID №8由296個(gè)脫氧核苷酸組成，是伯氏考克斯體34kd抗原基因(Coxb34kd)，可用于檢測(cè)伯氏考克斯體；序列表中的SEQ ID №9由457個(gè)脫氧核苷酸組成，是土拉弗朗西斯氏菌fop基因(Ftfop)，可用于檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌；序列表中的SEQ ID №10由330個(gè)脫氧核苷酸組成，是土拉弗朗西斯氏菌23kD抗原基因(Ft23kd)，可用于檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌；序列表中的SEQ ID №11由474個(gè)脫氧核苷酸組成，是普氏立克次體rpa基因(Rickpor)，可用于檢測(cè)普氏立克次體；序列表中的SEQ ID №12由214個(gè)脫氧核苷酸組成，是普氏立克次體glta基因(Rpglta)，可用于檢測(cè)普氏立克次體；序列表中的SEQ ID №13由371個(gè)脫氧核苷酸組成，是立氏立克次體190KD抗原基因(Rricl90kd)，可用于檢測(cè)立氏立克次體；序列表中的SEQ ID №14由385個(gè)脫氧核苷酸組成，是立氏立克次體外膜蛋白基因(Rricompb)，可用于檢測(cè)立氏立克次體；序列表中的SEQ ID №15由235個(gè)脫氧核苷酸組成，是鼠疫耶爾森氏菌莢膜抗原基因(Ypcalf)，可用于檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌；序列表中的SEQ ID №16由317個(gè)脫氧核苷酸組成，是鼠疫耶爾森氏菌pla基因(Yppla)，可用于檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌。
為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，所述DNA芯片包括下述8對(duì)探針中的至少一對(duì)探針上述1)和2)、3)和4)、5)和6)、7)和8)、9)和10)、11)和12)、13)和14)、15)和16)。
所述生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌包括下述八種細(xì)菌中的至少一種炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)、布魯氏菌(Brucella)、伯氏考克斯體(Coxiella burnetii)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsiarickettsii)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)。
所述DNA芯片優(yōu)選為包括序列表中SEQ ID №1至16的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1至16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明提供的檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的方法，是分別以待測(cè)樣品的DNA為模板，用下述1)至8)的8對(duì)引物對(duì)或由從所述8對(duì)引物對(duì)的每對(duì)引物對(duì)中選出的一個(gè)引物對(duì)組成的8個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物和上述任意一種檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的DNA芯片進(jìn)行雜交，如果雜交信號(hào)為陽(yáng)性，則待測(cè)樣品為或含有雜交信號(hào)陽(yáng)性的探針對(duì)應(yīng)的生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌；所述8對(duì)引物對(duì)如下1)由Balf-1和Balf-B組成的引物對(duì)，和由Bapa-1和Bapa-A組成的引物對(duì)；2)由Bpfur-2和Bpfur-A組成的引物對(duì)，和由Bpsl1705-F和Bpsl1705-R組成的引物對(duì)；3)由Bra31kd-3和Bra31kd-C組成的引物對(duì)，和由Bromp2b-4和Bromp2b-D組成的引物對(duì)；4)由Coxb27kd-5和Coxb27kd-C組成的引物對(duì)，和由Coxb34kd-3和Coxb34kd-D組成的引物對(duì)；5)由Ftfop-1和Ftfop-D組成的引物對(duì)，和由Ft23kd-3和Ft23kd-B組成的引物對(duì)；6)由Rickpor-Rpa-3和Rickpor-Rpa-C組成的引物對(duì)，和由Rpglta-1和Rpglta-A組成的引物對(duì)；7)由Rric190kd-1和Rric190kd-A組成的引物對(duì)，和由Rricompb-3和Rricompb-C組成的引物對(duì)；8)由Ypcalf-2和Ypcalf-B組成的引物對(duì)，和由Yppla-2和Yppla-C組成的引物對(duì)。
上述8對(duì)引物對(duì)的序列如表1所示。
上述方法中，優(yōu)選用所述1)至8)的8對(duì)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
所述生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌包括炭疽芽孢桿菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、伯氏考克斯體、土拉弗朗西斯氏菌、普氏立克次體、立氏立克次體和鼠疫耶爾森氏菌。
為了提高檢測(cè)效率，所述PCR優(yōu)選為多重PCR。
本發(fā)明選擇特異基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行普通PCR或多重PCR擴(kuò)增并標(biāo)記，利用單個(gè)的PCR產(chǎn)物作為探針，制備為DNA芯片，再進(jìn)行芯片檢測(cè)分析。本發(fā)明采用特異基因多重PCR結(jié)合DNA芯片的通用檢測(cè)技術(shù)，可以克服傳統(tǒng)多重PCR凝膠電泳檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分的出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象；而當(dāng)多重PCR體系中擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相差不大的情況下，通過(guò)傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測(cè)不能區(qū)分出來(lái)，而本發(fā)明的方法可以很有效地鑒別開(kāi)來(lái)。本發(fā)明不僅提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，并且實(shí)現(xiàn)“一對(duì)多”的檢測(cè)目的，即一次實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)出一個(gè)樣品中多個(gè)目標(biāo)細(xì)菌，滿足反生物恐怖的需要。
本發(fā)明選擇8種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的16個(gè)特異基因片段(每種目標(biāo)細(xì)菌兩個(gè)片段)，進(jìn)行普通PCR或多重PCR，完成擴(kuò)增和熒光標(biāo)記，從而進(jìn)行DNA芯片雜交分析，給出檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明在檢測(cè)過(guò)程中具有較高的靈敏度和特異性，既可以避免以往多重PCR檢測(cè)中可能出現(xiàn)的非特異性結(jié)果，又可以避免基于保守基因的基因芯片檢測(cè)技術(shù)中經(jīng)常出現(xiàn)的交叉反應(yīng)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)8種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌(炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、普氏立克次體、立氏立克次體和伯氏考克斯氏體)；而且每個(gè)靶細(xì)菌選擇兩個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，避免了因?yàn)榛蛲蛔兊仍蛟斐傻穆z，也提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本發(fā)明最低可以檢測(cè)11-14CFU/ml的目標(biāo)細(xì)菌菌液標(biāo)本，最低可以檢測(cè)出6-10ng/μl的目標(biāo)細(xì)菌DNA，比傳統(tǒng)的PCR-電泳方法要靈敏10倍。本發(fā)明可以有效檢測(cè)出血液和動(dòng)物感染組織中的目標(biāo)細(xì)菌；本發(fā)明可以穩(wěn)定而特異地實(shí)現(xiàn)多種細(xì)菌的通用檢測(cè)，而且即使樣品存在過(guò)量的無(wú)關(guān)細(xì)菌干擾，仍可以給出正確結(jié)果。本發(fā)明在反生物恐怖領(lǐng)域以及臨床微生物檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為芯片基本技術(shù)流程2為芯片點(diǎn)樣排列示意3為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果4為鼠疫耶爾森氏菌特異性試驗(yàn)結(jié)果5為鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株10-8稀釋度菌液芯片雜交結(jié)果圖6為鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株10-7稀釋度菌液制備模擬血標(biāo)本芯片雜交結(jié)果圖7為鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株染色體DNA系列稀釋度檢測(cè)結(jié)果圖8為鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株感染BALB/C小鼠48小時(shí)后各組織檢測(cè)結(jié)果圖9為炭疽芽孢桿菌特異性試驗(yàn)結(jié)果圖10為炭疽芽孢桿菌A16R菌株10-8稀釋度菌液芯片雜交結(jié)果圖11為炭疽芽孢桿菌10-7稀釋度菌液制備模擬血標(biāo)本芯片雜交結(jié)果圖12為布魯氏菌特異性試驗(yàn)結(jié)果圖13為6pg/μl布魯氏菌染色體DNA芯片雜交結(jié)果圖14為土拉弗朗西斯氏菌特異性試驗(yàn)結(jié)果圖15為類鼻疽伯克霍爾德氏菌特異性試驗(yàn)結(jié)果圖16為普氏立克次體特異性試驗(yàn)結(jié)果圖17為立氏立克次體特異性試驗(yàn)結(jié)果圖18為伯氏考克斯氏體特異性試驗(yàn)結(jié)果圖19為多種目標(biāo)細(xì)菌同時(shí)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖20為雜菌干擾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果圖21為混合樣品盲測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
一、本發(fā)明的特異基因多重PCR結(jié)合DNA芯片檢測(cè)技術(shù)的原理1、DNA芯片檢測(cè)技術(shù)原理DNA微點(diǎn)陣芯片是指同時(shí)將大量的探針?lè)肿佑行虻毓袒谥С治锕潭ǖ焦滔嘀С治?玻片)表面上，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，借助核酸分子雜交配對(duì)的特異性通過(guò)特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)(CCD)對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析(圖1)。
2、多重PCR原理一般PCR僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過(guò)DNA聚合酶擴(kuò)增模板，復(fù)制出大量的目的片段，它主要用于單一片段的檢測(cè)，PCR是常用的微生物檢測(cè)方法。多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi)加上二對(duì)以上引物，可以同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。一般而言，多重PCR體系中每對(duì)引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不同，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，區(qū)分不同大小的擴(kuò)增片段，可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶基因的同時(shí)檢測(cè)。設(shè)計(jì)多重PCR引物時(shí)，既要保證擴(kuò)增的特異性，又要確保不同擴(kuò)增片段之間的大小差異可以由瓊脂糖凝膠電泳加以區(qū)分。但是在實(shí)際工作中，尤其是設(shè)計(jì)擴(kuò)增多個(gè)靶基因(五個(gè)以上)的多重PCR引物時(shí)，這一目標(biāo)較難實(shí)現(xiàn)。同時(shí)由于多重PCR只是通過(guò)擴(kuò)增片段的大小進(jìn)行結(jié)果判斷，對(duì)于可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性擴(kuò)增無(wú)法區(qū)分。
3、特異基因多重PCR結(jié)合DNA芯片檢測(cè)技術(shù)的原理現(xiàn)有的利用DNA芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌的方法一般都是基于16S rRNA或23S rRNA，設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，利用通用引物擴(kuò)增標(biāo)記靶序列，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)雜交實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。由于細(xì)菌的rRNA基因序列十分保守，往往不同細(xì)菌的探針僅相差一個(gè)核苷酸，在雜交過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，造成結(jié)果判讀的困難。
本發(fā)明將多重PCR擴(kuò)增與DNA芯片結(jié)合起來(lái)，如果待測(cè)樣品中含有一種或多種目標(biāo)細(xì)菌的核酸，多重PCR反應(yīng)將擴(kuò)增并標(biāo)記上特異的片段，與DNA芯片進(jìn)行雜交后，通過(guò)生物芯片檢測(cè)裝置檢測(cè)熒光信號(hào)，結(jié)合探針點(diǎn)樣模式即可以判斷待測(cè)樣品中是否含有目標(biāo)細(xì)菌的核酸。
在本發(fā)明中，使用目標(biāo)細(xì)菌的特異基因片段產(chǎn)物作為探針，制備芯片，這樣可以避免rRNA芯片中可能出現(xiàn)的交叉反應(yīng)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；同時(shí)每個(gè)目標(biāo)細(xì)菌選擇兩個(gè)特異片段用于檢測(cè)，在單一基因突變的情況下仍能給出結(jié)果，不會(huì)出現(xiàn)漏檢。此外，傳統(tǒng)的多重PCR僅僅通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物大小判斷結(jié)果，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，而使用DNA芯片雜交判斷結(jié)果，這種基于序列信息進(jìn)行檢測(cè)的方法大大提高了結(jié)果的可靠性。
4、芯片點(diǎn)樣排列在本發(fā)明中，共使用16個(gè)探針檢測(cè)8種目標(biāo)細(xì)菌；在每張片基上點(diǎn)32個(gè)亞矩陣(4×8排列)，每亞矩陣按4×4點(diǎn)陣設(shè)計(jì)，代表一種探針(見(jiàn)圖2)；這樣每張玻片容量為4×4×32＝512個(gè)點(diǎn)，每個(gè)探針點(diǎn)重復(fù)32次，可以避免由于雜交液分布不均等情況造成的假陰性結(jié)果。
二、本發(fā)明的檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的方法及其專用DNA芯片的特性實(shí)驗(yàn)1、特異性實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)主要是選擇與目的菌相近緣的或無(wú)關(guān)的菌株一些菌株，進(jìn)行多重PCR的擴(kuò)增同時(shí)熒光標(biāo)記，進(jìn)行芯片的雜交檢測(cè)，觀察是否能夠特異地檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào)，并考察其在檢測(cè)過(guò)程中是否能夠避免一些無(wú)關(guān)的干擾，考察該項(xiàng)技術(shù)的特異性。
2、靈敏度評(píng)價(jià)本發(fā)明的靈敏度評(píng)價(jià)是主要確定不同樣品中，以不同形式存在的目標(biāo)細(xì)菌模板的最低檢出率。
(1)染色體檢測(cè)靈敏度的評(píng)價(jià)提取目標(biāo)細(xì)菌的染色體DNA，測(cè)定濃度后，將其進(jìn)行10倍系列稀釋，對(duì)各個(gè)稀釋度取一定的量作為模板，進(jìn)行熒光標(biāo)記多重PCR擴(kuò)增后，與芯片雜交，考察此技術(shù)檢測(cè)純?nèi)旧w標(biāo)本的靈敏度。
(2)細(xì)菌菌液檢測(cè)靈敏度的評(píng)價(jià)培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)菌，將培養(yǎng)物進(jìn)行10倍系列稀釋，利用平板涂抹法對(duì)各稀釋度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；同時(shí)取各個(gè)稀釋度菌液，提取DNA模板，進(jìn)行熒光標(biāo)記多重PCR擴(kuò)增后，與芯片雜交，評(píng)價(jià)本技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌菌液的靈敏度。
(3)模擬血標(biāo)本靈敏度檢測(cè)培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)菌，將培養(yǎng)物進(jìn)行10倍系列稀釋，然后將各個(gè)稀釋度菌液取一定的量加入動(dòng)物或人的血中，形成系列濃度的模擬血標(biāo)本。提取DNA模板，進(jìn)行熒光標(biāo)記多重PCR擴(kuò)增后，與芯片雜交，評(píng)價(jià)本技術(shù)檢測(cè)血液標(biāo)本的靈敏度。
3、動(dòng)物感染標(biāo)本的檢測(cè)以一種目標(biāo)細(xì)菌感染動(dòng)物，解剖后分別取出肝、脾、肺等器官并將其研磨，提取組織總DNA后，進(jìn)行熒光標(biāo)記多重PCR擴(kuò)增后，與芯片雜交，評(píng)價(jià)本技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物感染標(biāo)本的能力。
4、多種靶細(xì)菌的同時(shí)檢測(cè)人工制備含有多種靶細(xì)菌DNA的標(biāo)本，進(jìn)行熒光標(biāo)記多重PCR擴(kuò)增后，與芯片雜交?？疾毂炯夹g(shù)同時(shí)檢測(cè)多種靶細(xì)菌的效果，以及以多重PCR為基礎(chǔ)的DNA芯片檢測(cè)方法的可行性。
5、雜菌干擾實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)任意選擇一種與目標(biāo)細(xì)菌不相關(guān)的菌株與目的菌進(jìn)行不同比例的混合，提取DNA模板?？疾煸谶^(guò)量無(wú)關(guān)細(xì)菌的干擾狀態(tài)下，本技術(shù)檢出目標(biāo)細(xì)菌的能力。
6、樣品的盲測(cè)取幾個(gè)目標(biāo)細(xì)菌的染色體DNA，進(jìn)行隨機(jī)組合并編號(hào)，本操作由一人完成；然后由另一人進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增標(biāo)記，芯片雜交，給出檢測(cè)結(jié)果，然后與原始組合情況進(jìn)行對(duì)照，考察本技術(shù)進(jìn)行多樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
除非有其它說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施使用本領(lǐng)域中的傳統(tǒng)分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)，和克隆技術(shù)。
實(shí)施例1、含有序列表中序列1至16的探針的DNA芯片的制備及八種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的檢測(cè)1、含有序列表中序列1至16的探針的DNA芯片的制備細(xì)菌菌株八種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、布魯氏菌(Brucella)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)和伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)；以及假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotubercolusis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)，均購(gòu)自病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。細(xì)菌模板DNA提取按照NaI裂解-玻璃粉吸附法進(jìn)行(楊瑞馥，郭兆彪，張敏麗，等。核酸診斷技術(shù)規(guī)范化的研究[J].生物技術(shù)通訊，1999，8(2)81-88)。
針對(duì)以上八種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌，每種細(xì)菌選擇兩條特異基因作為靶基因，設(shè)計(jì)引物，詳見(jiàn)表1。所有引物均由上海生工生物有限公司合成。
表1 8種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌特異性探針引物及其序列


探針的制備根據(jù)表1的引物，分別以上述制備的八種細(xì)菌的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增八種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的十六條特異基因片段，反應(yīng)體系在30μl擴(kuò)增體系中，10×PCR Master Mix(上下游引物濃度為10μmol/L，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的濃度為均為0.8mmol/L，100mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.1％BSA)3μl，Taq DNA聚合酶(Promega公司)1.5U/μl，細(xì)菌模板DNA溶液5μl(10ng/μl)，滅菌去離子水補(bǔ)足反應(yīng)體系；采用PE2400 DNA熱循環(huán)儀(PE)。反應(yīng)程序如下先94℃預(yù)變性3min；再94℃變性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后終延伸5min；反應(yīng)結(jié)束后利用酚氯仿抽提法純化PCR產(chǎn)物，用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。
芯片的制備與處理純化的PCR產(chǎn)物99℃熱變性10min后，用50％的DMSO(二甲基亞礬)溶解成2.0μg/μl的濃度，轉(zhuǎn)移至384孔板；點(diǎn)樣用玻片為CSS-1000醛基化玻片(美國(guó)CEL公司)。將待點(diǎn)樣的玻片置于Flexys生物芯片點(diǎn)樣儀(Genomic Solutions Inc.)上，設(shè)置點(diǎn)樣程序，每張片基上點(diǎn)32個(gè)亞矩陣(4×8排列)，每亞矩陣按4×4點(diǎn)陣設(shè)計(jì)(見(jiàn)圖2)，這樣每張玻片容量為4×4×32＝512個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)32次。圖2中1～16號(hào)探針依次為1Bpfur；2Bpsl；3Rric190kd；4Rricompb；5Bapa；6Balf；7Ft23kd；8Ftfop；9Coxb27kd；10Coxb34kd；11Yppla；12Ypcalf；13Bra31kd；14Bromp；15Rpglta；16Rickpor。以上探針名稱對(duì)應(yīng)于表1，即1號(hào)、2號(hào)探針檢測(cè)類鼻疽伯克霍爾德氏菌，3號(hào)、4號(hào)探針檢測(cè)立氏立克次體，5號(hào)、6號(hào)探針檢測(cè)炭疽芽孢桿菌，7號(hào)、8號(hào)探針檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌，9號(hào)、10號(hào)檢測(cè)伯氏考克斯氏體，11號(hào)、12號(hào)檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌，13號(hào)、14號(hào)檢測(cè)布魯氏菌，15號(hào)、16號(hào)檢測(cè)普氏立克次體。點(diǎn)制完畢的芯片在使用前于室溫放置至少24h。用UV交聯(lián)儀(Heofer)在60Milli Joule下交聯(lián)。芯片表面游離醛基的封閉處理芯片浸于封閉液(1.5g NaBH4充分溶解于450ml的1×PBS中，加入133ml的無(wú)水乙醇，混勻)中10min，緩慢搖動(dòng)芯片使其充分封閉。用0.1％的十二烷基磺酸鈉SDS(購(gòu)自Sigma)漂洗芯片2min，水中洗滌2min，95％乙醇洗滌2min，晾干后即可用于雜交。
2、利用步驟1制備的芯片檢測(cè)八種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌(1)芯片靶序列多重PCR體系的建立將表1中十六對(duì)引物組合為三個(gè)組合，以對(duì)應(yīng)的細(xì)菌DNA為模板組成混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，即每組檢測(cè)六個(gè)片段(見(jiàn)表2)，從而利用這3個(gè)PCR反應(yīng)即檢測(cè)所有八種生物恐怖劑的十六條特異基因片段。另外，在每一個(gè)組合中分別對(duì)組合中的細(xì)菌DNA模板進(jìn)行單一模板的PCR擴(kuò)增。在30μl擴(kuò)增體系中，10×PCR Master Mix(上下游引物濃度為10μmol/L，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的濃度為均為0.8mmol/L，100mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.1％BSA)3μl，Taq DNA聚合酶(Promega公司)1.5U/μl，細(xì)菌模板DNA溶液5μl(10ng/μl)，滅菌去離子水補(bǔ)足反應(yīng)體系；采用PE2400DNA熱循環(huán)儀(PE)。反應(yīng)程序如下先94℃預(yù)變性3min；再94℃變性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后終延伸5min；利用瓊脂糖凝膠電泳觀察，考核其用于多重PCR組合的可行性。結(jié)果如圖3所示，電泳結(jié)果表明三個(gè)組合擴(kuò)增單一模板時(shí)，擴(kuò)增條帶明亮清晰，表明這三個(gè)組合均可以用于多重PCR檢測(cè)。但是在圖3中，用“第一組”來(lái)擴(kuò)增布魯氏菌和土拉弗朗西斯氏菌的混合模板時(shí)，由于Bromp(413bp)與Ftfop(457bp)(表1)兩個(gè)基因片段的大小比較接近，在電泳結(jié)果只能觀察到一條清晰明亮的帶，表明，通過(guò)普通的電泳檢測(cè)方法難以準(zhǔn)確區(qū)分片段大小相近的基因。圖3中A第一組多重PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道Marker(泳道中條帶大小為100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp)，泳道1為布魯氏菌和土拉弗朗西斯氏菌的混合模的板擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道2為土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌、伯氏考克斯氏體和立氏立克次體的混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3為布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌和立氏立克次體的混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4-9分別為布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌、伯氏考克斯氏體和立氏立克次體的單一模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。B第二組多重PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道Marker同上；泳道1為鼠疫耶爾森氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌的混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2為土拉弗朗西斯氏菌、伯氏考克斯氏體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和普氏立克次體的混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3為布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、伯氏考克斯氏體和普氏立克次體的混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4-9分別為布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、伯氏考克斯氏體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和普氏立克次體的單一模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。C第三組多重PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道Marker同上；泳道1為炭疽芽孢桿菌和立氏立克次體的混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2為立氏立克次體、普氏立克次體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和鼠疫耶爾森氏菌的混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3為布魯氏菌、炭疽芽孢桿菌、立氏立克次體、普氏立克次體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和鼠疫耶爾森氏菌的混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4-9分別為布魯氏菌、炭疽芽孢桿菌、立氏立克次體、普氏立克次體、類鼻疽伯克霍爾德氏菌和鼠疫耶爾森氏菌的單一模板擴(kuò)增產(chǎn)物。
表2三個(gè)組合的多重PCR反應(yīng)體系中的引物組合

(2)待檢序列的芯片檢測(cè)對(duì)于待檢菌株的DNA(上述提取的八種細(xì)菌DNA)模板，均使用三組多重PCR體系(見(jiàn)表2)進(jìn)行擴(kuò)增。每組多重PCR體系為，在30μl擴(kuò)增體系中，10×PCR Master Mix(六對(duì)上下游引物濃度分別為10μmol/L，dATP、dTTP、dGTP濃度為0.8mmol/L，dCTP的濃度為0.6mmol/L，Cy5-dCTP濃度為0.2mmol/L，100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.1％BSA，pH 8.3)3μl，Taq DNA聚合酶(Promega公司)1.5U/μl，待檢模板DNA溶液5μl(都為10ng/μl)，滅菌去離子水補(bǔ)足反應(yīng)體系；采用PE2400DNA熱循環(huán)儀(PE)。設(shè)置程序如下先94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后終延伸5min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將三組擴(kuò)增產(chǎn)物混合，利用Amicon Microcon-PCR純化試劑盒(購(gòu)自Millipore公司)進(jìn)行純化，最終洗脫體積為30μl，取15μl純化產(chǎn)物99℃變性10min，冰浴驟冷2min；再與15μl2×雜交液(10×SSC，0.04％SDS，200μg/μl鮭魚精DNA，10％硫酸葡聚糖)混勻，放置于內(nèi)置芯片的雜交盒內(nèi)，置于雜交爐中65℃雜交45min。雜交后的芯片依次用洗液A(20×SSC，10％SDS)，洗液B(20×SSC)，洗液C(95％乙醇)中各洗3min、3min、1min。將洗滌完畢的芯片置于GenePix Pro 4.1掃描儀(Axon Instruments)內(nèi)，設(shè)置掃描通道和掃描時(shí)間，進(jìn)行結(jié)果掃描。當(dāng)信號(hào)點(diǎn)的熒光讀數(shù)高于背景讀數(shù)8000以上時(shí)，結(jié)果中可以看到清晰、明亮的雜交點(diǎn)，以此作為判斷陰性和陽(yáng)性信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)，熒光讀數(shù)值越高，則雜交點(diǎn)的亮度越大，表示信號(hào)越強(qiáng)。
實(shí)施例2、利用實(shí)施例制備的芯片對(duì)八種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證一、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)的檢測(cè)1、特異性實(shí)驗(yàn)分別以提取的鼠疫耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌或傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)菌分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)菌的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，結(jié)果如圖4所示，表明鼠疫耶爾森氏菌的模板可以在正確的探針位置(預(yù)期兩個(gè)探針有雜交信號(hào))產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，而假結(jié)核耶爾森氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無(wú)特異雜交信號(hào)產(chǎn)生，可見(jiàn)實(shí)施例1制備的DNA芯片對(duì)于鼠疫耶爾森氏菌檢測(cè)具有良好的特異性。
2、細(xì)菌菌液檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)用LB斜面轉(zhuǎn)接鼠疫耶爾森氏菌(EV76)(購(gòu)自病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，26℃培養(yǎng)48h，懸浮菌體，制備10倍系列稀釋(原菌液稀釋10倍為10-1稀釋度，稀釋100倍為10-2稀釋度，依此類推……稀釋109倍為10-9稀釋度)直至10-9稀釋度。利用平板涂抹法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取各個(gè)稀釋度菌液1ml，收集菌體，提取DNA。分別以各個(gè)稀釋度的菌液的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)稀釋度的菌液分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)稀釋度的菌液的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，考察細(xì)菌系列稀釋菌液雜交靈敏度。結(jié)果表明，DNA芯片可以檢測(cè)到10-8稀釋度的菌液(圖5)，經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)，計(jì)算出鼠疫耶爾森氏菌菌液的原始濃度為1.1×109CFU/ml，因此對(duì)于鼠疫耶爾森氏菌而言，檢測(cè)靈敏度為1.1×109CFU/ml×10-8(稀釋度)＝11 CFU/ml。
3、模擬血標(biāo)本靈敏度實(shí)驗(yàn)用LB斜面轉(zhuǎn)接鼠疫耶爾森氏菌(EV76)，26℃培養(yǎng)48h，懸浮菌體，制備10倍系列稀釋(原菌液稀釋10倍為10-1稀釋度，稀釋100倍為10-2稀釋度，依此類推……稀釋109倍為10-9稀釋度)直至10-9稀釋度。利用平板涂抹法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)取各個(gè)稀釋度，各個(gè)稀釋度中各取20μl加入180μl兔血，制備成系列濃度(1-10-9稀釋度)的模擬血標(biāo)本。分別取各個(gè)稀釋度菌液制備的模擬血標(biāo)本，按照QIAamp全血DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取DNA，分別以各個(gè)稀釋度菌液制備的模擬血標(biāo)本的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)稀釋度菌液制備的模擬血標(biāo)本分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將每個(gè)稀釋度菌液制備的模擬血標(biāo)本的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，結(jié)果表明，DNA芯片可以檢測(cè)到10-7稀釋度的菌液制備的模擬血標(biāo)本(圖6)，經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)，計(jì)算出鼠疫耶爾森氏菌菌液的原始濃度為1.1×109CFU/ml。因此對(duì)于鼠疫耶爾森氏菌而言，模擬血標(biāo)本檢測(cè)靈敏度為1.1×109CFU/ml×10-7(稀釋度)＝110CFU/ml。
4、染色體稀釋靈敏度實(shí)驗(yàn)用LB斜面轉(zhuǎn)接鼠疫耶爾森氏菌(EV76)，26℃培養(yǎng)48小時(shí)，收集菌體，用酚氯仿抽提的方法提取染色體DNA，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸定量后，將其倍比稀釋為100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl和1pg/μl的溶液；隨后取各稀釋度的DNA為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)稀釋度的DNA分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)稀釋度的DNA的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，結(jié)果表明，本技術(shù)可以檢測(cè)到10pg/μl鼠疫耶爾森氏菌(EV76)染色體DNA；而在常規(guī)的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳中，在100pg/μl時(shí)可以觀察到陽(yáng)性信號(hào)，10pg/μl稀釋度已經(jīng)觀察不到條帶(圖7)?？梢?jiàn)實(shí)施例1制備的DNA芯片比常規(guī)PCR凝膠電泳檢測(cè)靈敏度高一個(gè)數(shù)量級(jí)。圖7中，A為DNA芯片檢測(cè)10pg/μl染色體DNA結(jié)果，B為PCR-凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
5、動(dòng)物感染標(biāo)本的檢測(cè)將鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株感染BALB/C小白鼠，感染48小時(shí)解剖，取出肝、脾、肺器官并將其研磨，用全血DNA提取試劑盒(QIAGEN)分別提取組織DNA后，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)組織的DNA分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)組織的DNA的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，結(jié)果如圖8所示，表明在三種感染組織中均可以檢測(cè)到鼠疫耶爾森氏菌的特異雜交信號(hào)。
二、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)的檢測(cè)1、特異性實(shí)驗(yàn)分別以提取的炭疽芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)菌分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)菌的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結(jié)果如圖9，表明炭疽芽孢桿菌的模板可以在正確的探針位置產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，而枯草芽孢桿菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無(wú)信號(hào)產(chǎn)生，可見(jiàn)實(shí)施例1制備的DNA芯片對(duì)于炭疽芽孢桿菌檢測(cè)具有良好的特異性。
2、細(xì)菌菌液檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)用LB斜面轉(zhuǎn)接炭疽芽孢桿菌，37℃培養(yǎng)24h，懸浮菌體，制備10倍系列稀釋直至10-9稀釋度(原菌液稀釋10倍為10-1稀釋度，稀釋100倍為10-2稀釋度，依此類推……稀釋109倍為10-9稀釋度)。利用平板涂抹法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取各個(gè)稀釋度菌液1ml，收集菌體，提取DNA。分別以各個(gè)稀釋度的菌液的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)稀釋度的菌液分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)稀釋度的菌液的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，考察細(xì)菌系列稀釋菌液雜交靈敏度。結(jié)果如圖10所示，表明實(shí)施例1制備的DNA芯片可以檢測(cè)到10-8稀釋度的菌液。經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)，計(jì)算出炭疽芽孢桿菌菌液的原始濃度為1.4×109CFU/ml。因此對(duì)于炭疽芽孢桿菌而言，檢測(cè)靈敏度為1.4×109CFU/ml×10-8＝14CFU/ml。
3、模擬血標(biāo)本檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)用LB斜面轉(zhuǎn)接炭疽芽孢桿菌A16R，37℃培養(yǎng)24h，用0.01M的PBS溶液懸浮菌體，制備10倍系列稀釋直至10-9稀釋度(原菌液稀釋10倍為10-1稀釋度，稀釋100倍為10-2稀釋度，依此類推……稀釋109倍為10-9稀釋度)。利用平板涂抹法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；同時(shí)取各個(gè)稀釋度，各個(gè)稀釋度中各取20μl加入180μl兔血制備成系列濃度(1-10-9稀釋度)的模擬血標(biāo)本。分別取各個(gè)稀釋度菌液制備的模擬血標(biāo)本，按照QIAamp全血DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取DNA，分別以各個(gè)稀釋度菌液制備的模擬血標(biāo)本的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)稀釋度菌液制備的模擬血標(biāo)本分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將每個(gè)稀釋度菌液制備的模擬血標(biāo)本的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，結(jié)果如圖11所示，表明實(shí)施例1制備的DNA芯片可以檢測(cè)到10-7稀釋度的菌液制備的模擬血標(biāo)本。經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)，計(jì)算出炭疽芽孢桿菌菌液的原始濃度為1.4×109CFU/ml。因此對(duì)于炭疽芽孢桿菌來(lái)說(shuō)，模擬血標(biāo)本檢測(cè)靈敏度為1.4×109CFU/ml×10-7＝140 CFU/ml。
三、布魯氏菌(Brucella)的檢測(cè)1、特異性實(shí)驗(yàn)分別以布魯氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)菌分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)菌的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結(jié)果如圖12所示，表明布魯氏菌的模板可以在正確的探針位置產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無(wú)特異性信號(hào)產(chǎn)生，可見(jiàn)實(shí)施例1制備的DNA芯片對(duì)于布魯氏菌檢測(cè)具有良好的特異性。
2、染色體稀釋靈敏度實(shí)驗(yàn)將布魯氏菌染色體DNA，倍比稀釋成100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl，并在1pg/μl～10pg/μl設(shè)置1ng/μl的遞進(jìn)梯度；隨后取各稀釋度的DNA為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)稀釋度的DNA分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)稀釋度的DNA的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，結(jié)果如圖13所示，表明本發(fā)明的方法可以檢測(cè)到6pg/μl布魯氏菌染色體DNA；而在常規(guī)的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳中，在100pg/μl時(shí)可以觀察到陽(yáng)性信號(hào)，10pg/μl稀釋度已經(jīng)觀察不到條帶。
四、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)的檢測(cè)分別以土拉弗朗西斯氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)菌分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)菌的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結(jié)果如圖14所示，表明土拉弗朗西斯氏菌的模板可以在正確的探針位置產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無(wú)信號(hào)產(chǎn)生，可見(jiàn)實(shí)施例1制備的DNA芯片對(duì)于土拉弗朗西斯氏菌檢測(cè)具有良好的特異性。
五、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)的檢測(cè)分別以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)菌分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)菌的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結(jié)果如圖15所示，表明類鼻疽伯克霍爾德氏菌的模板可以在正確的探針位置產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無(wú)信號(hào)產(chǎn)生，可見(jiàn)實(shí)施例1制備的DNA芯片對(duì)于類鼻疽伯克霍爾德氏菌檢測(cè)具有良好的特異性。
六、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)的檢測(cè)分別以普氏立克次體、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)菌分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)菌的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結(jié)果如圖16所示，表明普氏立克次體的模板可以在正確的探針位置產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無(wú)信號(hào)產(chǎn)生，可見(jiàn)實(shí)施例1制備的DNA芯片對(duì)于普氏立克次體檢測(cè)具有良好的特異性。
七、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)的檢測(cè)分別以立氏立克次體、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)菌分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)菌的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結(jié)果如圖17所示，表明立氏立克次體的模板可以在正確的探針位置產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無(wú)信號(hào)產(chǎn)生，可見(jiàn)實(shí)施例1制備的DNA芯片對(duì)于立氏立克次體檢測(cè)具有良好的特異性。
八、伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)的檢測(cè)分別以伯氏考克斯氏體、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的DNA作為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)菌分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)菌的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，掃描結(jié)果如圖18所示，表明伯氏考克斯氏體的模板可以在正確的探針位置產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，而白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌的模板均無(wú)信號(hào)產(chǎn)生，可見(jiàn)實(shí)施例1制備的DNA芯片對(duì)于伯氏考克斯氏體檢測(cè)具有良好的特異性。
九、八種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌同時(shí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分別以2、3、4、5、6、8個(gè)目標(biāo)細(xì)菌的DNA混合物作為擴(kuò)增的模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每種混合模板分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每種混合模板的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，雜交結(jié)果如圖19所示，表明各個(gè)雜交結(jié)果均有多組探針出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，且信號(hào)模式與目標(biāo)細(xì)菌完全吻合，說(shuō)明本發(fā)明的方法完全能夠同時(shí)檢測(cè)多種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌，同時(shí)也表明以多重PCR為基礎(chǔ)的DNA芯片檢測(cè)方法是可行的。其中，圖19中，鼠+布表示以鼠疫耶爾森氏菌和布魯氏菌的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；類+伯表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌和伯氏考克斯氏體的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；鼠+布+炭表示以鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏菌和炭疽芽孢桿菌的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；立+土+普表示以立氏立克次體、土拉弗朗西斯氏菌和普氏立克次體的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；類+炭+伯+布表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、炭疽芽孢桿菌、伯氏考克斯氏體和布魯氏菌的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；立+土+鼠+普表示以立氏立克次體、土拉弗朗西斯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌和普氏立克次體的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；普+土+布+炭+伯表示以普氏立克次體、土拉弗朗西斯氏菌、布魯氏菌、炭疽芽孢桿菌和伯氏考克斯氏體的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；立+鼠+土+布+類表示以立氏立克次體、鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、布魯氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；類+鼠+伯+布+立+土表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、伯氏考克斯氏體、布魯氏菌、立氏立克次體和土拉弗朗西斯氏菌的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；類+炭+伯+布+立+土+鼠+普表示以類鼻疽伯克霍爾德氏茵、炭疽芽孢桿菌、伯氏考克斯氏體、布魯氏菌、立氏立克次體、土拉弗朗西斯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、和普氏立克次體的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果。
十、雜菌干擾實(shí)驗(yàn)將鼠疫耶爾森氏菌(EV76)與大腸桿菌以1∶100、1∶1000與1∶10000的細(xì)胞數(shù)目比例進(jìn)行混合，以提取的各個(gè)混合比例的混合菌液的DNA為模板，利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)混合菌液分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)混合菌液的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制備的DNA芯片雜交，結(jié)果如圖20所示，表明即使在10000倍無(wú)關(guān)細(xì)菌(大腸桿菌)的干擾之下，本發(fā)明的方法仍可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)細(xì)菌(鼠疫耶爾森氏菌)的準(zhǔn)確檢測(cè)。圖20中比例為鼠疫耶爾森氏菌和大腸桿菌的菌數(shù)比例。
十一、混合樣品盲測(cè)實(shí)驗(yàn)選擇幾個(gè)目標(biāo)細(xì)菌的模板DNA，與水一起進(jìn)行隨機(jī)組合編號(hào)，樣品制備由一人完成共制備6份樣品(表3)。然后由另一人利用實(shí)施例1步驟2的(1)的表2中的引物對(duì)組合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法，每個(gè)樣品分別單獨(dú)進(jìn)行三組多重PCR，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將每個(gè)樣品的三組擴(kuò)增產(chǎn)物分別各自混合，按照實(shí)施例1步驟2的(2)的方法分別與實(shí)施例1中制各的DNA芯片雜交，進(jìn)行樣品盲測(cè)，根據(jù)芯片雜交圖譜給出檢測(cè)結(jié)果，判斷樣品中含有何種目標(biāo)細(xì)菌的核酸，隨后與原始樣品組成信息進(jìn)行復(fù)核，考察本技術(shù)檢測(cè)未知樣品(可能含有多種目標(biāo)細(xì)菌)的能力。
混合樣品雜交圖譜如圖21所示，混合樣品組合方式和通過(guò)雜交檢測(cè)后判讀結(jié)果如表3所示，表明檢測(cè)全部正確無(wú)誤，說(shuō)明本發(fā)明的方法完全可以用于檢測(cè)未知樣品中是否含有以上8種生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌。圖21中鼠表示以鼠疫耶爾森氏菌的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；水表示以水代替DNA模板進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；類+伯+鼠+布表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、伯氏考克斯氏體、鼠疫耶爾森氏菌和布魯氏菌的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；類+土+鼠+伯表示以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌和伯氏考克斯氏體的DNA為模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；伯+鼠表示以伯氏考克斯氏體和鼠疫耶爾森氏菌的DNA模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果；布+立表示布魯氏菌和立氏立克次體的DNA模板，進(jìn)行三組多重PCR、芯片雜交的檢測(cè)結(jié)果。
表3.盲測(cè)樣品組合方式與雜交判讀結(jié)果

序列表<160>16<210>1<211>334<212>DNA<213>炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)<400>1aggaacatcc cacagacttt tctgtagaat tcttggaaca aaatagcaat gaggtacaag60aagtatttgc gaaagctttt gcatattata tcgagccaca gcatcgtgat gttttacagc120tttatgcacc ggaagctttt aattacatgg ataaatttaa cgaacaagaa ataaatctat180ccttggaaga acttaaagat caacggatgc tgtcaagata tgaaaaatgg gaaaagataa240aacagcacta tcaacactgg agcgattctt tatctgaaga aggaagagga cttttaaaaa300agctgcagat tcctattgag ccaaagaaag atga334<210>2<211>249<212>DNA<213>炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)<400>2caagtgctgg acctacggtt ccagaccgtg acaatgatgg aatccctgat tcattagagg60tagaaggata tacggttgat gtcaaaaata aaagaacttt tctttcacca tggatttcta120atattcatga aaagaaagga ttaaccaaat ataaatcatc tcctgaaaaa tggagcacgg180cttctgatcc gtacagtgat ttcgaaaagg ttacaggacg gattgataag aatgtatcac240cagaggcaa249<210>3<211>268<212>DNA<213>類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)<400>3acggcgtaat gctctgcgcg atccgctggg tcacgctgtc gtacgacgaa caggcggcca60gtccgaccac ggcgacagct gcgatgacgg tgctccgcac gcggctcctc tgaagttgca120aaagcgatct tggaatcatg tccctcaccg tgctggccct tgtccaaggc cgcgcgagaa180tgtcacagat gactgaaaag gcgaaaagcc ggtactattg aagccctgca ttgtactcta240gggacgccta gccatgacca atccgacc 268<210>4<211>319<212>DNA<213>類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)
<400>4catattgatc gggagccttg ggtccacgct gccggctgtg gctggtacgg taataggcgg60cggggctcaa taccccaatt cggtaggcgg aacgagttct acgaccggcg atttgggcaa120cagctatatt ggtgcgagcg gtatgggtac cgccattact ggggataatg attgcctgag180cttgacttcg acccgcaacg tgctaaacag tgcgaatgtc ggctggcttt tgggaacgac240ttcacagacc accgatcctg gtccgttgta ccccggcccc ggcgcggaaa acaaccagac300tatcagttac agtggcacc 319<210>5<211>416<212>DNA<213>布魯氏菌(Brucella)<400>5acgcctattt ctttgtgggc ggctatccga cgggcgcaat ctcggaactg gccatctcga60acggtatttc gctcgttccg atctccgggc cggaagcgga caagattctg gagaaatatt120ccttcttctc gaaggatgtg gttcctgccg gagcctataa ggacgtggcg gaaacaccga180cccttgccgt tgccgcacag tgggtgacga gcgccaagca gccggacgac ctcatctata240acatcaccaa ggttctctgg aacgaggata cacgcaaggc actcgatgcg ggccatgcga300agggcaagct catcaagctc gatagtgcga cgagcagcct cggtattccg ctgcatcccg360gcgcagaacg cttttacaag gaagcgggcg tgctgaaata atccctcaat gatcgg416<210>6<211>413<212>DNA<213>布魯氏菌(Brucella)<400>6tcgggcgtag atggtaaata tggtaatgaa accagcagcg gcaccgtcat ggagttcgcg60tatatccagc tcggtggtct gcgcgttggt atcgatgaat cggaattcca taccttcacc120ggttacctcg gcgatgtcat caacgatgac gtgatctcgg ctggctccta ccgcaccggc180aagatctcgt acaccttcac tggcggaaac ggcttctcgg ctgtgatcgc tctcgaacag240ggtggcgaag acgttgacaa cgattacacg atcgacggtt acatgccgca cgttgttggc300ggcctgaaat atgctggcgg ctggggttcg atcgctggtg ttgttgccta tgactcggtc360atagaagaat gggctgccaa ggttcgtggc gacgtcaaca tcaccgacca gtt 413<210>7<211>421<212>DNA<213>伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)<400>7
cagtggcagg caatcctcat ggcaatgtta cattggttga atttttcgat tatcaatgtg60gccattgcaa agccatgaat tctgttattc aagctatcgt gaaacaaaat aaaaacctcc120gcgttgtctt caaagaactg cccatttttg gcggccaatc gcaatacgct gccaaagtat180cattagcagc cgctaaacaa ggaaaatatt atgctttcca cgacgcgctg ctcagtgtcg240acggccaatt atcagaacaa atcacccttc aaaccgcaga aaaagtagga ttaaatgttg300ctcagctcaa aaaagacatg gataatcctg ctatccaaaa acaactgcgt gataacttcc360aattagctca atcgttacag ctagcaggca ccccgacgtt cgtcattggt aataaagcgt420t421<210>8<211>296<212>DNA<213>伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)<400>8acggaagtta tgttgcgaat gcgcattatt ggctcggtga aatttatctt caacagaaag60atcggaaaaa tgccgcccac gaatttcaaa ccgtaaggga taaatttccc aaatcggaaa120aggtacttga tgcgaaatta aaattagcca tcattgatgc ggaagacggg aaaattaaac180aggctaagga agaattaacc gaaattaaaa aacaacaccc tgaatctacg gcagcacaac240tcgccaatat ccgactccaa caattggagg aagtcgattc agcaacaaca acgcct296<210>9<211>457<212>DNA<213>土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)<400>9aatttcattg ctccttttgc aaatacttat agcgctttga ctaacaagga caatacttgg60ggtcctcaag atagaactgg ccagtggtac ttaggtgtag atgctaacgg tctagctaga120actcctaact ctccatcagg tgctggtgct aacttcacaa tcggttataa catcaataaa180tacttcgctg tacagtacaa ccaattagtt ggtagagtat ttgctggttt aggtgaaggt240gttgtaaact ttagtaataa tactatgttt actccatatg ctgcaggtgg tgctggttgg300gcaaatctag caggtcaagc aacaggtgct tgggatgtgg gtggtggtct taagtttgaa360ctatctagaa atgttcaagc aagtgttgac tacagatata tccaaacaat ggcacctagt420aatatttctg gtgctaatgg cagagcgggt actaaca 457<210>10<211>330<212>DNA<213>土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)<400>10gaaagctgat tcggctacag ctgctgctag tgtaatacgt ttatctataa cgccaggctc60tataaatcca acaataagta ttactcttgg tgttctaatt aaatcaaatg ttagaactaa120
aattgaagag aaagtttcga gtatattaca agcaagtgct acagatatga aaattaagtt180aggtaattct aataaaaaac aagagtataa aactgatgaa gcatggggta ttatgataga240tctatctaat ttagagttat atccaataag tgctaaggct tttagtatta gtatagagcc300aacagaactt atgggtgttt caaaagatgg 330<210>11<211>474<212>DNA<213>普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)<400>11aggtggcaat gatgagcgtg agcaaacctt aaaccaaatg ttagtcgaaa tggatgggtt60tgaggcaaac gagggtgtgg taattattgc agctacaaac cgtccagacg ttcttgatcg120tgcattactg cgtcctggta gatttgatcg tcaaattgct gttgcaaacc ctgatataaa180tggtcgtgag caaattctaa aagtacattt aaaaaaaatt aaatataata gtacggtact240agcacgaatt attgctcgtg gaactcctgg tttctccggt gctgaacttg ctaatttagt300taatgaagct gcgcttattg ctgcgaggct tggtaaaaaa gaagtagata tgcacgatat360ggaagaagca aaagataagg ttttgatggg tgttgtgcgt cgctctattg caatgtcaga420gaaggagaaa agattaactg cgtatcatga aggaggacac gcattagtcg ggct 474<210>12<211>214<212>DNA<213>普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)<400>12gctaatgaag cagtgataaa tatgcttaaa gaaattggca gttctgagaa tattcctaaa60tatgtagcta aagctaaaga taagaatgat ccatttaggt taatgggttt tggtcatcga120gtatataaaa gctatgaccc gcgtgccgca gtacttaaag aaacttgtaa agaagtatta180aatgaattag gtcagttaga caataatccg ctgt214<210>13<211>371<212>DNA<213>立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)<400>13aaggagcggg agattgtagc acggcaggta ccacttttaa tacaacaaat atagtacttg60atattacagg tcaattagaa cttggagcta ctacggcaaa tgtagtttta tttaatgatg120ctgttcaatt aactcaaacc ggtaatattg gcggtttctt agattttaat gcaaaaaacg180gtatggtaac attaaataac aatgtaaatg ttgcgggagc agtccaaaat accggcggta240ctaataacgg tacgttaata gttttaggtg caagtaatct taatagagta aacgggattg300ctatgttaaa agtaggtgca ggaaatgtaa ctattgccaa aggcggtaaa gttaaaatcg360gcgaaatcca a 371
<210>14<211>385<212>DNA<213>立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)<400>14tggtgccgtg actgatacga ttgcttttga aaattcaagt ttaggtgcag ttgtattctt60acctagaggc attccattca atgatgcagg caacacaatg cctttaacaa ttaaaagtac120cgtaggtaat aaaacagcta aaggttttga tgttcctagc gtggttgttt taggtgttga180tagtgtcatc gctgacggtc aagtaatcgg tgatcaaaat aatatcgtag gtctaggtct240tggaagcgat aacggcataa tcgttaatgc tactacatta tatgcaggta tcagtactct300aaacaataat caaggtactg tcacacttag cggtggtgtt cctaataccc ctggtacagt360ttatggctta ggcacaggta ttggc 385<210>15<211>235<212>DNA<213>鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)<400>15ccccaatgtc aaacggctct taattgtatt caatcctcgc tcggcataaa tatacgaacg60ctgccatcct tgttgtttcc accatgaggt tgaactacga aagcgccaag cccctatgtt120taatcccggt tgcaactgag cataataaga gtccagagac ttgcctcctt ctctgaattt180tcttgtctgc atgttcgtat tataattcat gaacagagca ggaatgccgt catcc 235<210>16<211>317<212>DNA<213>鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)<400>16tccatactca tttctgaccc tgaatgccag ggggtggacg tctctggctt ccgggtcagg60taatatggat gactacgact ggatgaatga aaatcaatct gagtggacag atcactcatc120tcatcctgct acaaatgtta atcatgccaa tgaatatgac ctcaatgtga aaggctggtt180actccaggat gagaattata aagcaggtat aacagcagga tatcaggaaa cacgtttcag240ttggacagct acaggtggtt catatagtta taataatgga gcttataccg gaaacttccc300gaaaggagtg cgggtaa 31權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的DNA芯片，包括下述1)至16)中的至少一種探針1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)序列表中SEQ ID №3的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)序列表中SEQ ID №4的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；5)序列表中SEQ ID №5的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；6)序列表中SEQ ID №6的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；7)序列表中SEQ ID №7的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；8)序列表中SEQ ID №8的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；9)序列表中SEQ ID №9的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №9限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；10)序列表中SEQ ID №10的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№10限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；11)序列表中SEQ ID №11的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№11限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；12)序列表中SEQ ID №12的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；13)序列表中SEQ ID №13的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№13限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；14)序列表中SEQ ID №14的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№14限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；15)序列表中SEQ ID №15的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№15限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；16)序列表中SEQ ID №16的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片包括下述8對(duì)探針中的至少一對(duì)探針?biāo)?)和2)、3)和4)、5)和6)、7)和8)、9)和10)、11)和12)、13)和14)、15)和16)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA芯片，其特征在于所述生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌包括下述八種細(xì)菌中的至少一種炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomalleii)、布魯氏菌(Brucella)、伯氏考克斯體(Coxiella burnetii)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片包括序列表中SEQ ID №1至16的DNA序列和/或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1至16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA芯片，其特征在于所述生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌包括炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapseudomalleii)、布魯氏菌(Brucella)、伯氏考克斯體(Coxiella burnetii)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)。
6.一種檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的方法，是分別以待測(cè)樣品的DNA為模板，用下述1)至8)的8對(duì)引物對(duì)或由從所述8對(duì)引物對(duì)的每對(duì)引物對(duì)中選出的一個(gè)引物對(duì)組成的8個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物和權(quán)利要求1至4中任一所述的檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的DNA芯片進(jìn)行雜交，如果雜交信號(hào)為陽(yáng)性，則待測(cè)樣品為或含有雜交信號(hào)陽(yáng)性的探針對(duì)應(yīng)的生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌；所述8對(duì)引物對(duì)如下1)由Balf-1和Balf-B組成的引物對(duì)，和由Bapa-1和Bapa-A組成的引物對(duì)；2)由Bpfur-2和Bpfur-A組成的引物對(duì)，和由Bpsl1705-F和Bpsl1705-R組成的引物對(duì)；3)由Bra31kd-3和Bra31kd-C組成的引物對(duì)，和由Bromp2b-4和Bromp2b-D組成的引物對(duì)；4)由Coxb27kd-5和Coxb27kd-C組成的引物對(duì)，和由Coxb34kd-3和Coxb34kd-D組成的引物對(duì)；5)由Ftfop-1和Ftfop-D組成的引物對(duì)，和由Ft23kd-3和Ft23kd-B組成的引物對(duì)；6)由Rickpor-Rpa-3和Rickpor-Rpa-C組成的引物對(duì)，和由Rpglta-1和Rpglta-A組成的引物對(duì)；7)由Rric190kd-1和Rric190kd-A組成的引物對(duì)，和由Rricompb-3和Rricompb-C組成的引物對(duì)；8)由Ypcalf-2和Ypcalf-B組成的引物對(duì)，和由Yppla-2和Yppla-C組成的引物對(duì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中，用所述1)至8)的8對(duì)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌包括炭疽芽孢桿菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、伯氏考克斯體、土拉弗朗西斯氏菌、普氏立克次體、立氏立克次體和鼠疫耶爾森氏菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述PCR為多重PCR。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的方法及其專用DNA芯片。該檢測(cè)生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌的方法，是將待測(cè)樣品的DNA用表1中的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與下述DNA芯片進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)雜交信號(hào)，如果雜交信號(hào)為陽(yáng)性，則待測(cè)樣品為或含有雜交信號(hào)陽(yáng)性的探針對(duì)應(yīng)的生物恐怖相關(guān)病原細(xì)菌。所述DNA芯片包括序列表中序列1至序列16中的至少一種探針。本發(fā)明在反生物恐怖領(lǐng)域以及臨床微生物檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1786197SQ20051012405
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日
發(fā)明者宋亞軍, 王豫, 翟俊輝, 郭兆彪, 王津, 楊瑞馥 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所