專利名稱：一種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，微通道表面用牛血清蛋白分子進(jìn)行表面修飾，在溶液進(jìn)ロ與出ロ之間的液差產(chǎn)生的重力驅(qū)動下，利用液流之間的層流現(xiàn)象實現(xiàn)細(xì)胞在微通道中的植入，最后從溶液入口加入不同濃度的生物試劑的細(xì)胞培養(yǎng)溶液，實現(xiàn)研究試劑濃度變化對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，為研究細(xì)胞生物學(xué)奠定基礎(chǔ)，主要應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)80年代后期，為了建立更類似于體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)體系，盡可能使體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相吻合，從而使細(xì)胞間能相互溝通信息，相互支撐生長増殖，人們在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出了細(xì)胞共培養(yǎng)技木。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是將2種或2種以上的細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，由于其具有更好地反映體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，所以這種方法被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞研究中。目前，細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)最多應(yīng)用于骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。細(xì)胞共培養(yǎng)體系主要通過兩種方法建立①直接共培 養(yǎng)體系，即將2種或2種以上的細(xì)胞同時或分別接種于同一孔中，不同種類的細(xì)胞之間直接接觸；②間接共培養(yǎng)體系，即將2種或2種以上的細(xì)胞分別接種于不同的載體上，然后將這兩種載體置于同一培養(yǎng)環(huán)境之中，使不同種類的細(xì)胞共用同一種培養(yǎng)體系而不直接接觸。共培養(yǎng)體系主要作用誘導(dǎo)細(xì)胞向另一種細(xì)胞分化；誘導(dǎo)細(xì)胞自身分化；維持細(xì)胞功能和活力；調(diào)控細(xì)胞增殖；促進(jìn)早期胚胎發(fā)育和提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。從上世紀(jì)30年代開始，細(xì)胞培養(yǎng)逐漸成為研究人員實驗過程中不可缺少的重要步驟，其載體工具培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶也逐步被大家所認(rèn)可，成為了ー種常規(guī)的實驗耗材。雖然到目前為止，很多科學(xué)家認(rèn)為培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶的這種體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)生長環(huán)境有著顯著的不同,但是由于沒有更好的培養(yǎng)載體來改變這個現(xiàn)狀，所以生物學(xué)家們也只能退而求次的默認(rèn)這種情況的存在。不同的生物試劑濃度對細(xì)胞培養(yǎng)的影響在細(xì)胞生物學(xué)中非常重要，因此，發(fā)展一種便捷、快速、高效、低成本的多細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，研究不同試劑濃度對細(xì)胞的影響是細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的迫切需求。近年來，微流控芯片分析技術(shù)已成為分析化學(xué)中ー個重要的研究方向，是其中最活躍的一支，無論是在科研還是應(yīng)用領(lǐng)域都獲得了廣泛的重視。然而，采用微流控芯片，在其表面制備微結(jié)構(gòu)和微通道，依靠微通道中多層液體之間的層流效應(yīng)驅(qū)動樣品微流體，同時完成細(xì)胞的植入以及研究不同生物試劑濃度溫度對細(xì)胞生長影響的技術(shù)，目如在相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域尚未有實質(zhì)性的突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，微通道表面用牛血清蛋白分子進(jìn)行表面修飾，在溶液進(jìn)ロ與出口之間的液差產(chǎn)生的重力驅(qū)動下，利用液流之間的層流現(xiàn)象實現(xiàn)細(xì)胞在微通道中的植入，最后從溶液入口加入不同濃度的生物試劑的細(xì)胞培養(yǎng)溶液，實現(xiàn)研究試劑濃度變化對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，為研究細(xì)胞生物學(xué)奠定基礎(chǔ)，主要應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的操作步驟(I)用計算機(jī)輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制微流控芯片中各層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。(2)通過微加工技術(shù)在各層微流控芯片基材表面和粘性薄膜上加工所需的微結(jié)構(gòu)和微通道，包括樣品池、廢液池、微孔和微通道。(3)將牛血清蛋白溶液加入微通道中，進(jìn)行物理表面修飾固定。(4)利用雙層粘性薄膜，將各層離心式微流控芯片對齊、粘合、加壓封合，組成多細(xì)胞共培養(yǎng)的微流控芯片。(5)將細(xì)胞溶液從樣品孔加入，控制微流體的層流速度，將細(xì)胞植入到微流控芯片中的主微通道中，進(jìn)行細(xì)胞 培養(yǎng)。(6)細(xì)胞培養(yǎng)鋪滿主通道后，從溶液入口，同時加入含不同濃度的生物試劑的細(xì)胞培養(yǎng)溶液，紀(jì)錄細(xì)胞對不同試劑濃度的反應(yīng)。本發(fā)明中，試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的芯片基材可以是PMMA、PC、PVC、C0C、銅、鋁、不銹鋼、硅片、玻璃圓片，也可是市售的各類普通CD光盤。本發(fā)明中，試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片和粘性薄膜的微結(jié)構(gòu)和微通道可以通過數(shù)控銑刻、激光刻蝕、LIGA技術(shù)、模塑法、熱壓法、化學(xué)腐蝕制備，也可用軟刻蝕技術(shù)制備。本發(fā)明中，試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片是由兩層芯片組成，各層芯片之間用粘性薄膜貼合，粘性薄膜可以是雙層カ致粘性薄膜，也可是普通雙面膠薄膜。本發(fā)明中，試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片上的樣品溶液的驅(qū)動依靠液差產(chǎn)生的重力。本發(fā)明中，試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的細(xì)胞植入是依靠微通道中多液流之間的層流現(xiàn)象完成的。本發(fā)明中，試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片采用原位植入，微通道表面進(jìn)行BSA蛋白表面修飾固定。本發(fā)明提出的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，操作簡單、完成了細(xì)胞的平行植入和培養(yǎng)，降低了試劑與樣品的用量，簡化了細(xì)胞植入過程，實現(xiàn)了研究試劑濃度變化對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，具有便攜、經(jīng)濟(jì)、快速、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。


圖1.試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。a.細(xì)胞溶液與不同溫度溶液加入孔，b.細(xì)胞培養(yǎng)主通道，c.不同溫度溶液的廢液孔。具體實施方案實施例1用計算機(jī)輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制離心式微流控芯片的兩層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。利用數(shù)控CNC系統(tǒng)加工制備兩層圓片狀聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道，分別用自來水、蒸餾水清洗各層芯片，并用こ醇擦拭芯片表面殘留的指紋、油潰等污潰。在雙面膠薄膜上，用刻字機(jī)加工制備所需的微結(jié)構(gòu)和微通道。將兩層芯片小心對齊、粘合、加壓封合，制成適合細(xì)胞培養(yǎng)的含有六個入口、一個細(xì)胞培養(yǎng)主通道和六個出口的微流控芯片。從上部溶液入口加入細(xì)胞混合液，控制入口與出口的液差高度，從而控制層流速度，使細(xì)胞溶液緩慢流經(jīng)微通道，細(xì)胞因此吸附在用BSA蛋白修飾固定的微通道表面，從而完成細(xì)胞的植入。細(xì)胞培養(yǎng)一段時間，鋪滿主通道后，從六個入口依次加入不同濃度的生物試劑的細(xì)胞培養(yǎng)溶液，紀(jì)錄細(xì)胞對濃度的反應(yīng)。實施例2用計算機(jī)輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制離心式微流控芯片的兩層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。利用數(shù)控CNC系統(tǒng)加工制備兩層圓片狀聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道，分別用自來水、蒸餾水清洗各層芯片，并用こ醇擦拭芯片表面殘留的指紋、油潰等污潰。在雙面膠薄膜上，用刻字機(jī)加工制備所需的微結(jié)構(gòu)和微通道。將兩層芯片小心對齊、粘合、加壓封合，制成適合細(xì)胞培養(yǎng)的含有六個入口、一個細(xì)胞培養(yǎng)主通道和六個出口的微流控芯片。從上部溶液入口加入細(xì)胞混合液，控制入口與出口的液差高度，從而控制層流速度，使細(xì)胞溶液緩慢流經(jīng)微通道，細(xì)胞因此吸附在用BSA蛋白修飾固定的微通道表面，從而完成細(xì)胞的植入。細(xì)胞培養(yǎng)一段時間，鋪滿主通道后，從六個入口依次加入不同濃度的生物試劑的細(xì)胞培養(yǎng)溶液，紀(jì)錄細(xì) 胞對濃度的反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，微通道表面用牛血清蛋白分子進(jìn)行表面修飾，在溶液進(jìn)ロ與出口之間的液差產(chǎn)生的重力驅(qū)動下，利用液流之間的層流現(xiàn)象實現(xiàn)細(xì)胞在微通道中的植入，最后從溶液入ロ加入不同濃度的生物試劑的細(xì)胞培養(yǎng)溶液，實現(xiàn)研究試劑濃度變化對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，為研究細(xì)胞生物學(xué)奠定基礎(chǔ)，主要應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。
2.按權(quán)利要求1所述的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，其制作步驟如下 (1)用計算機(jī)輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制微流控芯片中各層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。
(2)通過微加工技術(shù)在各層微流控芯片基材表面和粘性薄膜上加工所需的微結(jié)構(gòu)和微通道，包括樣品池、廢液池、微孔和微通道。
(3)將牛血清蛋白溶液加入微通道中，進(jìn)行物理表面修飾固定。
(4)利用雙層粘性薄膜，將各層離心式微流控芯片對齊、粘合、加壓封合，組成多細(xì)胞共培養(yǎng)的微流控芯片。
(5)將細(xì)胞溶液從樣品孔加入，控制微流體的層流速度，將細(xì)胞植入到微流控芯片中的主微通道中，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
(6)細(xì)胞培養(yǎng)鋪滿主通道后，從溶液入口，同時加入含不同濃度的生物試劑的細(xì)胞培養(yǎng)溶液，紀(jì)錄細(xì)胞對不同試劑濃度的反應(yīng)。
3.按權(quán)利要求1或2所述的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的核心功能器件是微流控芯片，此芯片以液差產(chǎn)生的重力作為樣品微流體流動的驅(qū)動力，可以批量生產(chǎn)、多次利用、靈活設(shè)計與組裝。
4.按權(quán)利要求1或2所述的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片上的微結(jié)構(gòu)和微通道是通過數(shù)控銑刻、激光刻蝕、LIGA技術(shù)、模塑法、熱壓法、化學(xué)腐蝕、軟刻蝕技術(shù)的微加工方法在芯片基材表面制備，尺寸在微米級別。
5.按權(quán)利要求1或2所述的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片是由兩層芯片疊加而成，構(gòu)成三維立體的微結(jié)構(gòu)和微通道網(wǎng)絡(luò)。
6.按權(quán)利要求1或2所述的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片可以在ー塊芯片上制作六個溶液進(jìn)樣ロ，可以同時加入六種不同濃度的溶液，提高了単位時間的平行研究能力。
7.按權(quán)利要求1或2所述的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片通過微通道中多液流之間的層流現(xiàn)象完成微通道中細(xì)胞的植入。
8.按權(quán)利要求1或2所述的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片采用原位植入，在微通道表面進(jìn)行BSA蛋白表面修飾后進(jìn)行細(xì)胞的植入。
9.按權(quán)利要求1或2所述的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片適合同時加入一種、兩種、三種、四種、五種，甚至六種不同濃度的生物試劑溶液。
10.按權(quán)利要求1或2所述的試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片便于觀察、設(shè)備簡單、直接采樣、樣品和試劑用量小，平行培養(yǎng)能力高、樣品無需轉(zhuǎn)移、樣品交叉污染幾率小，能更真實地反映不同生物試劑濃度對人體組織細(xì)胞的影響，在細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種試劑濃度響應(yīng)性微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，微通道表面用牛血清蛋白分子進(jìn)行表面修飾，在溶液進(jìn)口與出口之間的液差產(chǎn)生的重力驅(qū)動下，利用液流之間的層流現(xiàn)象實現(xiàn)細(xì)胞在微通道中的植入，最后從溶液入口加入不同濃度的生物試劑的細(xì)胞培養(yǎng)溶液，實現(xiàn)研究試劑濃度變化對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，為研究細(xì)胞生物學(xué)奠定基礎(chǔ)，主要應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。該微流控芯片操作簡單、完成了細(xì)胞的植入和培養(yǎng)，降低了試劑與樣品的用量，簡化了細(xì)胞植入過程，實現(xiàn)了研究試劑濃度變化對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，具有便攜、經(jīng)濟(jì)、快速、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為細(xì)胞生物學(xué)研究提供了一種全新的細(xì)胞培養(yǎng)與分析技術(shù)。
文檔編號C12M3/00GK103060197SQ20121058965
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者葉嘉明, 沙俊, 王曉東, 聶富強(qiáng) 申請人:蘇州汶顥芯片科技有限公司