專利名稱：一種電化學微流控傳感芯片的制備方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微流控傳感芯片，具體地說，涉及一種電化學微流控傳感芯片的制備方法及其應用。
背景技術(shù)：
微流控系統(tǒng)是對微小體積液體(10_9 -1(T18L)在幾十到幾百微米管道內(nèi)操控的過程，該技術(shù)在生物醫(yī)學，環(huán)境監(jiān)控，食品安全具有非常廣泛的應用前景。微流控器件具備下列優(yōu)點，體積小，減少試劑消耗，多樣品平行檢測，增加可靠性，靈敏性等優(yōu)點。電化學系統(tǒng)可以很容易的整合到微流控芯片上，與傳統(tǒng)的分析平臺相比如質(zhì)譜，光學檢測等，電化學微流控具有更靈巧的樣品處理，優(yōu)越的靈敏度和多用途性，無需借助龐大的光學檢測設(shè)備。然而，目前電化學微流控傳感芯片制備是將金屬絲作為電極加工到微流控芯片中，如 James F.RusIing(Electrochemistry Communicationsll (2009) 819 - 822)報道的微流控電化學檢測器件，是用采用0.5mm直徑的金絲，經(jīng)用王水處理后，再進一步表面修飾后加工到微流控芯片上，該器件制備工藝復雜，耗時，成本高，需要在超凈間內(nèi)完成，一般實驗室條件難以達到，而且其電化學檢測重復性差。本發(fā)明采用的是標準化的印刷電極，將PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片直接在印刷電極上加工制備，獲得電化學微流控器件，該方法簡單，快速，成本低廉，可在普通實驗室下完成，而且檢測重復性很高，。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種簡單，快速，低成本，高靈敏度，具有普適性的新型電化學微流控傳感芯片的制備方法，并將該器件應用于醫(yī)學檢測。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種電化學微流控傳感芯片的制備方法，所述方法包括如下步驟:第一步，采用繪圖軟件設(shè)計微流控管道繪制掩模板，利用標準的軟光刻技術(shù)加工微流控PDMS芯片；第二步，配制玻璃溶液，具體方法:將3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)，正硅酸乙酯(TEOS)，乙醇(Et 0H)，水(H2OpH=2-8)按體積比5:1:1:1至1:5:10:20混合，超聲，然后放置在20_90°C烘箱進行熟化2-24h，即得到玻璃溶液。該改進后玻璃溶液相比現(xiàn)有的玻璃溶液制備，方法簡單，成本低廉，易于在印刷電極表面快速形成一層超薄玻璃，并且能夠牢固的結(jié)合到印刷電極表面。第三步，印刷電極表面玻璃涂層處理，在印刷電極涂上一層第二步配制的玻璃溶液，室溫下靜止干燥，待表面形成一層玻璃。第四步，將第一步的PDMS芯片和第三步的涂有玻璃的印刷電極印刷電極一起進行O2等離子體處理，然后取出來將PDMS芯片與印刷電極鍵合，即完成該電化學微流控傳感芯片制備。 優(yōu)選地，第一步中，所述的微流控管道繪制掩模板，其尺寸大小為進出樣管道寬度為100-500 μ m，中間檢測區(qū)域?qū)挾葹?-10mm，總長度為14_20mm，管道的高度為50-400 μ m。所述的微流控管道的進口、出口均具有設(shè)計弧度，管道中間為橢圓形，保證液體流暢通過，均勻的經(jīng)過工作電極表面。優(yōu)選地，第二步中超聲處理時間為5_30min。優(yōu)選地，第三步中所述的印刷電極，該電極采用是標準化的印刷電極。優(yōu)選地，第三步中所述的印刷電極玻璃涂層化處理，其具體加工工藝是，將熟化好的玻璃均勻的涂在印刷電極周圍，注意避免將玻璃溶液涂到印刷電極表面上，涂好之后放置室溫下干燥，形成一層超薄玻璃。優(yōu)選地，第四步中等離子體 處理時間為30-120S。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種上述得到的電化學微流控傳感芯片的應用，即將該電化學微流控傳感芯片應用于人血清中前列腺癌標志物PSA，胃癌標志物(CA199)，肺癌腫瘤標志物(CEA)，乳腺癌腫瘤標志物(CA153)，DNA, RNA, miRNA，核酸適體等生物樣品的檢測。優(yōu)選地，所述電化學微流控傳感芯片應用于人血清中前列腺癌標志物PSA的檢測，具體包括如下步驟:第一步,在外加磁場作用下將0.1-0.5mg/m帶有PSA捕獲抗體的磁珠固定到電化學微流控傳感芯片電極工作區(qū)域；第二步,通過注射泵以2-50 μ L/min注射0-10ng/mL不同濃度PSA抗原到電化學微流控傳感芯片中，在37°C培養(yǎng)箱孵育20-60min，PBS洗滌，封閉；第三步，將HRP標記的PSA檢測抗體以2_20 μ L/min速度注射到該電化學微流控傳感芯片中，同樣37°C孵育20-60min，然后采用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌；第四步，再注入20-100 μ L含有氫醌和雙氧水的PBS溶液；第五步，最后采用庫倫安培法在-1.0-5mV的恒電位下檢測，每組平行八次測定。優(yōu)選地，所述第一步中，首先將帶有biotin的PSA捕獲抗體修飾到帶有streptavidin的磁珠上,通過外加磁場的作用將50 μ L0.2mg/mL修飾好的磁珠固定到微流控芯片中的工作電極區(qū)域內(nèi)，進而PSA抗原捕獲。更優(yōu)選地，所述的磁珠大小為I μ m,其表面是鏈酶親和素修飾，與生物素標記的PSA捕獲抗體作用，得到PSA捕獲抗體修飾的磁珠。更優(yōu)選地，所述的通過外加磁場作用將磁珠固定到微流控芯片中的工作電極區(qū)域內(nèi)，是指將5mm大小的磁鐵固定到工作電極正下方,通過注射泵以50μ L/min的速度將0.2mg/mL磁珠注入到微流控芯片內(nèi)，并在外加的磁場作用下，將捕獲抗體修飾的磁珠固定到工作電極上。優(yōu)選地，所述第二步中，采用注射泵將10(^1^含有0-101^/1^不同濃度？54抗原的血清以10 μ L/min速度注射到芯片中，進行富集，再在37°C培養(yǎng)箱孵育30min，之后用100 μ L pH7.4PBS溶液以50 μ L/min速度充分洗滌，再用50 μ L的封閉液進行封閉，去除非特異性吸附。優(yōu)選地，所述的封閉液，是0.05%Tween-20,和2%的BSA的PBS溶液，所用體積是50uL,其目的是去除抗的非特異性結(jié)合。優(yōu)選地，所述第三步中，在第二步操作后，以10 μ L/min流速注射100 μ L PSA檢測抗體，將50 μ L辣根過氧化酶HRP標記的PSA檢測抗體以10 μ L/min速度注入，同樣再在37 °C培養(yǎng)箱孵育30min和PBA洗滌。優(yōu)選地，所述第四步中，以50 μ L/min速度注入50 μ L含有濃度為0.1-1OmM氫醌和0.05-5mM雙氧水的pH=7.4的PBS溶液。本發(fā)明上述芯片可以應用于醫(yī)學診斷，環(huán)境監(jiān)控，食品安全等的檢測領(lǐng)域，比如檢測胃癌標志物(CA199)肺癌腫瘤標志物(CEA)，前列腺癌標志物(PSA)，乳腺癌腫瘤標志物(CA153)等腫瘤標志物。本發(fā)明提供了一種簡單，快速，低成本，通用性的微流控電化學傳感器的制備方法。本發(fā)明通過對玻璃溶液制備工藝的改進，將改進后的玻璃溶液直接涂到標準化印刷電極上。然后有預先設(shè)計好管道的PDMS，和涂有玻璃的印刷電極一起進行真空等離子體處理，將聚二甲基硅氧烷(PDMS)直接鍵合到商品化印刷電極上，從而構(gòu)建了一種新型的微流控電化學傳感器平臺。該傳感器能夠在生物液樣如PBS溶液，血清中等對各種樣品分析物超靈敏檢測，本發(fā)明以檢測人血清中前列腺癌標志物PSA為例，采用庫倫安培法對PSA檢測，結(jié)果表明檢測靈敏度達0.84pg/mL，比標準化臨床檢測要求的0.1ng/mL提高了兩個數(shù)量級，具有超高的檢測靈敏度和準確性。高于其他電化學檢測器件，同時該器件易操作，能夠?qū)悠返奶幚?，分離等功能整合到一起。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:1，重量輕，可便攜，多功用；2，標準化；3，檢測重復性強，超高靈敏度和精確度；4，易操作，無需專業(yè)人員和復雜的儀器設(shè)備；5，允許高密度檢測體系整合到一個微型器件中；6，與小型的電化學工作站結(jié)合可在野外和家庭診斷；7，該器件易制備，可實現(xiàn)標準化，大規(guī)模生產(chǎn)。


通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯:圖1為本發(fā)明實施例一采用Freehand繪圖軟件設(shè)計微流控管道繪制掩模板；圖2為本發(fā)明實施例一電化學微流控器傳感器器件結(jié)構(gòu)不意圖；圖3為本發(fā)明實施例一電化學微流控器傳感器器件加工制備示意圖；圖4為本發(fā)明實施例一在微流控電化學器件中，不同掃速下的循環(huán)伏安圖a以及不同掃速下的陽極電流和陰極電流的標準曲線b ；圖5為本發(fā)明實施例庫倫安培法檢測在血清中檢測不同濃度PSA抗原圖a以及在血清中檢測不同濃度PSA抗原的標準曲線b。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。以下實施例中沒有詳細說明的操作，可以參照發(fā)明內(nèi)容，發(fā)明內(nèi)容也沒有說明的可以參照常規(guī)操作。
如圖2所示，為本發(fā)明實施例一電化學微流控器傳感器器件結(jié)構(gòu)示意圖；1為印刷電極連接頭，2為標準三電極即工作電極，參比電極，對電極；3為印刷電極，4為PDMS芯片，5為微流控器件液體出口管道，6為微流控液體進口管道。實施例1:(a)采用Freehand繪圖軟件設(shè)計微流控管道繪制掩模板，該管道設(shè)計根據(jù)流體力學設(shè)計如圖1所示，進口，出口均具有設(shè)計一定弧度，并無直角，管道中間為橢圓形，保證液體流暢通過，均勻的經(jīng)過工作電極表面，該技術(shù)不同于其他微流控芯片通常采用長方形管道設(shè)計。(b)利用軟光刻標準微加工技術(shù)制備PDMS芯片。(c)玻璃溶液配制，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)，正硅酸乙酯(TEOS)，乙醇(Et 0H)，水(H2O pH=2 - 8)按1:1:1:1體積比混合，超聲5 - 30min，在20_90°C下熟化2 - 24h。，比如超聲可以為5min，15min, 30min,熟化溫度可以為20°C，50°C，90°C，熟化時間可以為2h，15h，24h等等。(d)在標準化印刷電極表面上均勻涂一層玻璃溶液，室溫下靜置干燥。(e)將PDMS芯片和涂有玻璃的印刷電極O2等離子體處理30-120S，之后鍵合(如圖3)。(f)在外加磁場作用下將50 μ L0.1 - 0.5mg/m帶有PSA捕獲抗體的磁珠固定到芯片電極工作區(qū)域。(g)通過注射泵以1(^1711^11注射10(^1^0011^/1^，？54抗原到芯片中，在371:培養(yǎng)箱孵育30min。PBS洗滌，封閉。(h)將50 μ L HRP標記的PSA檢測抗體以2-20 μ L/min速度注射到該芯片中。同樣在37°C孵育30min，PBS洗滌。⑴再以20 - 80yL/min速度注入20-90yL含有氫醌(0.1-1OmM)和雙氧水(0.05 - 0.5mM)的 pH=7.4PBS 溶液。(j)最后采用庫倫安培法在-1.0 - 4mV的恒電位下檢測，每組平行八次測定。實施例2:(a)采用Freehand繪圖軟件設(shè)計微流控管道繪制掩模板，具體設(shè)計見附圖1。(b)利用軟光刻標準微加工技術(shù)制備PDMS芯片。(c)玻璃溶液配制，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)，正硅酸乙酯(TEOS)，乙醇(Et OH), 7jC (H2O pH=2-8)按 5:1:1:1 至 1:5:10:20 體積比混合，超聲 5_15min，在 20_90°C下熟化2-24h。(d)在標準化印刷電極表面上均勻涂一層玻璃溶液，室溫下靜置干燥。(e)將PDMS芯片和涂有玻璃的印刷電極O2等離子體處理60s，然后鍵合。(f)在外加磁場作用下將50 μ L0.05-0.5mg/m帶有CEA捕獲抗體的磁珠固定到芯片電極工作區(qū)域。(g)通過注射泵以10 μ L/min注射100 μ L0.1ng/mL，CEA抗原到芯片中，在37°C培養(yǎng)箱孵育20-60min。PBS洗滌，封閉。(h)將50 μ L HRP標記的CEA檢測抗體以5_20 μ L/min速度注射到該芯片中。同樣 37°C 孵育 20-60min，PBS 洗滌。
(i)再以50 μ L/min速度注入20-100 μ L含有氫醌(0.5_4mM)和雙氧水(0.005-0.1mM)的 pH=7.4PBS 溶液。(j)最后采用庫倫安培法在-1.0-4.0mV的恒電位下檢測，每組平行八次測定。實施例3:(a)采用Freehand繪圖軟件設(shè)計微流控管道繪制掩模板，具體設(shè)計見附圖1。(b)利用軟光刻標準微加工技術(shù)制備PDMS芯片。(c)玻璃溶液配制，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)，正硅酸乙酯(TEOS)，乙醇(Et 0H),水(H2O pH=2-8)按體積比 I:5:10:20 混合，超聲 5 - 20min,在 20_90°C下熟化
2- 24h。(d)在標 準化印刷電極表面上均勻涂一層玻璃溶液，室溫下靜置干燥。(e)將PDMS芯片和涂有玻璃的印刷電極O2等離子體處理90s，之后鍵合。(f)在外加磁場作用下將50 μ L0.05 - 0.5mg/m帶有CA199捕獲抗體的磁珠固定到芯片電極工作區(qū)域。&)通過注射泵以2-5(^1711^11注射10(^1^01^/1111^4199抗原到芯片中，在37°C培養(yǎng)箱孵育20-60min。PBS洗滌，封閉。(h)將50 μ L HRP標記的CA199檢測抗體以2_20 μ L/min速度注射到該芯片中。同樣37°C孵育30min，PBS洗滌。⑴再以50 μ L/min速度注入20-100 μ L含有氫醌(0.5-lOmM)和雙氧水(0.05-5mM)的 pH=7.4PBS 溶液。(j)最后采用庫倫安培法在-1.0-5mV的恒電位下檢測，每組平行八次測定。如圖4所示，其中曲線a為在微流控電化學器件中不同掃速10，25，50，80，100, 15
O,200，250，300，350mV s—1下的循環(huán)伏安圖；b為不同掃速下的陽極電流和陰極電流的標準曲線如圖5所示，其中a為庫倫安培法檢測在血清中檢測不同濃度
O,0.001，0.01，0.1, IandlOng mL—1的PSA抗原；b為在血清中檢測不同濃度PSA抗原的標準曲線。本發(fā)明介紹了一種簡單，快速加工制備微流控電化學傳感器的工藝，并將該芯片應用于檢測胃癌標志物(CA 199 )肺癌腫瘤標志物(CEA )，前列腺癌標志物(PSA )，乳腺癌腫瘤標志物(CA153)等腫瘤標志物。本發(fā)明是將帶有設(shè)計不同管道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)直接耦合到標準化印刷電極上，從而構(gòu)建了一種新型的微流控電化學傳感器平臺，并將該器件應用于人血清中前列腺癌標志物PSA的檢測，結(jié)果表明檢測靈敏度達0.84pg/mL，比商業(yè)化臨床檢測要求的0.1ng/mL提高了兩個數(shù)量級，具有超高的檢測靈敏度和準確性。本發(fā)明工藝簡單新穎，材料簡單，設(shè)備數(shù)量少，能耗低，加工環(huán)境要求不高，一般實驗室即可完成，便于推廣，并且很容易將樣品制備，分離，檢測多功能集成在一個芯片上，可以實現(xiàn)芯片檢測微型化，同時該器件在人類健康，食品安全，環(huán)境檢測等領(lǐng)域。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種電化學微流控傳感芯片的制備方法，其特征在于所述方法包括如下步驟: 第一步，采用繪圖軟件設(shè)計微流控管道繪制掩模板，利用標準的軟光刻技術(shù)加工微流控roMS芯片； 第二步，配制玻璃溶液: 將3-氨基丙基三乙氧基硅烷，正硅酸乙酯，乙醇，pH=2-8的水按體積比5:1:1:1至I:5:10:20混合，超聲，然后放置在20°C _90°C烘箱進行熟化2_24h，即得到玻璃溶液； 第三步，化印刷電極表面玻璃圖涂層處理，在印刷電極涂上一層第二步配制的玻璃溶液，室溫下靜止干燥，待表面形成一層玻璃；該電極采用是標準化的印刷電極； 第四步，將第一步的PDMS芯片和第三步的涂有玻璃的印刷電極印刷電極一起進行O2等離子體處理，然后取出來將PDMS芯片與印刷電極鍵合，即完成該電化學微流控傳感芯片制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學微流控傳感芯片的制備方法，其特征在于，第二步中超聲處理時間為5-30 min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學微流控傳感芯片的制備方法，其特征在于，第三步中所述的印刷電極玻璃涂層化處理，其具體加工工藝是，將熟化好的玻璃均勻的涂在印刷電極周圍，避免將玻璃溶液涂到印刷電極表面上，涂好之后放置室溫下干燥，形成一層超薄玻3 ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學微流控傳感芯片的制備方法，其特征在于，第四步中等離子體處理時間為30-120S。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的電化學微流控傳感芯片的制備方法，其特征在于，第一步中，所述的微流控管道繪制掩模板，其尺寸大小為進出樣管道寬度為100-500 μ m，中間檢測區(qū)域?qū)挾葹?-10mm，總長度為14_20mm，管道的高度為50-400 μ m ;所述的微流控管道的進口、出口均具有設(shè)計弧度，管道中間為橢圓形，保證液體流暢通過，均勻的經(jīng)過工作電極表面。
6.一種權(quán)利要求1所得到的電化學微流控傳感芯片的應用，其特征在于，將該電化學微流控傳感芯片應用于人血清中前列腺癌標志物PSA，胃癌標志物CA199，肺癌腫瘤標志物CEA,乳腺癌腫瘤標志物CA153，DNA, RNA, miRNA,核酸適體生物樣品的檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的電化學微流控傳感芯片的應用，其特征在于，所述電化學微流控傳感芯片應用于人血清中前列腺癌標志物PSA的檢測，具體包括如下步驟: 第一步，在外加磁場作用下將0.1 - 0.5mg/m帶有PSA捕獲抗體的磁珠固定到電化學微流控傳感芯片電極工作區(qū)域； 第二步，通過注射泵以2-50 μ L/min注射0-10ng/mL不同濃度PSA抗原到電化學微流控傳感芯片中，在37°C培養(yǎng)箱孵育20-60min，PBS洗滌，封閉； 第三步，將HRP標記的PSA檢測抗體以2-20 μ L/min速度注射到該電化學微流控傳感芯片中，同樣37°C孵育20-60min，然后采用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌； 第四步，再注入20-100 μ L含有氫醌和雙氧水的PBS溶液； 第五步，最后采用庫倫安培法在-1.0-5mV的恒電位下檢測，每組平行八次測定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的電化學微流控傳感芯片的應用，其特征在于，所述第一步中，首先將帶有biotin的PSA捕獲抗體修飾到帶有streptavidin的磁珠上,通過外加磁場的作用將50μ L0.2mg/mL修飾好的磁珠固定到微流控芯片中的工作電極區(qū)域內(nèi)，進而PSA抗原捕獲。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的電化學微流控傳感芯片的應用，其特征在于，所述第二步中，采用注射泵將100 μ L含有0-10ng/mL不同濃度PSA抗原的血清以10 μ L/min速度注射到芯片中，進行富集，再在37°C培養(yǎng)箱孵育30min，之后用100 μ L pH7.4PBS溶液以50 μ L/min速度充分洗滌，再用50 μ L的封閉液進行封閉，去除非特異性吸附。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的電化學微流控傳感芯片的應用，其特征在于，所述的封閉液，是0.05%Tween-20,和2%的BSA的PBS溶液，所用體積是50uL，其目的是去除抗的非特異性結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項所述的電化學微流控傳感芯片的應用，其特征在于，所述第三步中，在第二步操作后，以10 μ L/min流速注射100 μ L PSA檢測抗體，將50 μ L辣根過氧化酶HRP標記的PSA檢測抗體以10 μ L/min速度注入，同樣再在37°C培養(yǎng)箱孵育30min和PBA洗滌。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項所述的電化學微流控傳感芯片的應用，其特征在于，所述第四步中，以50 μ L/min速度注入50 μ L含有濃度為0.1-1OmM氫醌和0.05-5mM雙氧水的pH=7.4 的 PBS 溶液。`
全文摘要
本發(fā)明提供一種電化學微流控傳感芯片的制備方法及其應用，將改進后的玻璃溶液直接涂到商業(yè)化標準印刷電極上。然后將預先設(shè)計好管道的PDMS芯片和涂有玻璃的印刷電極一起進行真空等離子體處理，將PDMS直接鍵合到商業(yè)化標準印刷電極上，從而構(gòu)建了一種新型的微流控電化學傳感器平臺。該傳感器能夠在生物液樣對各種樣品分析物超靈敏檢測，以檢測人血清中前列腺癌標志物PSA為例，采用庫倫安培法對PSA檢測，結(jié)果表明檢測靈敏度達0.84pg/mL,比標準化臨床檢測要求的0.1ng/mL提高了兩個數(shù)量級，具有超高的檢測靈敏度和準確性,高于其他電化學檢測器件，同時易操作，能將樣品的處理，分離等集成到一個微型電化學微流控傳感器芯片上。
文檔編號G01N27/416GK103182334SQ20131008082
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者陳守慧, 王智華, 聶志鴻, 陳小元, 崔大祥 申請人:上海交通大學