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一種電化學(xué)發(fā)光紙芯片的制備及其在硫化氫檢測中的應(yīng)用

文檔序號(hào):8498074閱讀:722來源:國知局
一種電化學(xué)發(fā)光紙芯片的制備及其在硫化氫檢測中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及低成本、簡單、便攜式的硫化氫分析檢測技術(shù)領(lǐng)域,更具體的說是一種電化學(xué)發(fā)光中空通道紙芯片分析器件的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著經(jīng)濟(jì)文化的快速發(fā)展,人民生活水平得到明顯提高,人們對自身健康問題投入的經(jīng)費(fèi)也越來越高。癌癥,作為五大絕癥之一,直接威脅著人類健康,因此,癌癥的早期診斷和治療成為當(dāng)今科研工作者的重要研宄課題之一。目前,癌癥臨床診斷的途徑主要有兩種,一種是通過醫(yī)院的大型儀器設(shè)備進(jìn)行初步診斷,這種方法準(zhǔn)確度高,但是費(fèi)時(shí),費(fèi)力且費(fèi)用昂貴;另一種便是通過簡單的小型掌上設(shè)備,實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速分析診斷。
[0003]微流控紙芯片實(shí)驗(yàn)室,將樣品的制備、分離、檢測集成為一體,具有操作簡單,攜帶方便,響應(yīng)快速的特點(diǎn),得到了廣大科研工作者的認(rèn)可。目前,微流控紙芯片實(shí)驗(yàn)室主要是靠紙纖維的毛細(xì)管拉力推動(dòng)液體的流動(dòng),但是樣品在這種通道內(nèi)流動(dòng)緩慢,耗時(shí)長,且樣品揮發(fā)嚴(yán)重。為了解決這個(gè)問題,具有中空通道的微流控紙芯片實(shí)驗(yàn)室應(yīng)運(yùn)而生。中空通道使得樣品在通道內(nèi)流動(dòng)快速,增加了樣品的儲(chǔ)備量,減少了樣品的揮發(fā),提高了檢測的靈敏度及準(zhǔn)確度。但是由于紙纖維導(dǎo)電性不佳,微流控紙芯片實(shí)驗(yàn)室響應(yīng)信號(hào)較差,限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用。
[0004]貴金屬納米粒子和石墨稀的復(fù)合納米材料,因其比表面積大、生物相容性及導(dǎo)電性好,催化性能高等優(yōu)點(diǎn)備受科研工作者的關(guān)注。生長有這種復(fù)合納米粒子的紙芯片,提高了紙纖維的導(dǎo)電性,增加了紙纖維的比表面積,因而廣泛應(yīng)用于各種類型的生物傳感器中。
[0005]H2S,是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體,在血清中的含量為10-100微摩爾每升。它是繼NO和CO后第三種內(nèi)生氣體信號(hào)分子,與很多的病理過程息息相關(guān)。因此,發(fā)展及研制H2S超靈敏、高選擇性的檢測技術(shù)成為科研工作者奮斗的目標(biāo)。目前,H2S的檢測技術(shù),主要包括以下幾種:比色、氣相色譜及熒光光譜的方法。這些檢測方法靈敏度高,線性范圍寬,但是不適合于臨床在線檢測。因此,尋找一種能夠?qū)2S進(jìn)行定量分析、操作簡單、攜帶方便、響應(yīng)靈敏的微流控紙芯片成為當(dāng)前該研宄領(lǐng)域急需解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種生長有貴金屬納米粒子的合金和石墨稀復(fù)合納米材料的中空通道微流控紙芯片,通過電化學(xué)發(fā)光的方法,實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞內(nèi)H2S的快速、靈敏檢測。
[0007]為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明是通過構(gòu)建一種新型的中空通道電化學(xué)發(fā)光紙芯片來實(shí)現(xiàn)的,該中空通道電化學(xué)發(fā)光紙芯片的制備方法為:
(1)在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)中空通道紙芯片的疏水蠟打印圖案(附圖1);
(2)通過蠟打印機(jī)將步驟(I)中設(shè)計(jì)的紙芯片打印上疏水圖案;
(3)將步驟(2)中得到的紙芯片于60-150°C下加熱1-2分鐘,使蠟融化,形成疏水層;
(4)將步驟(3)中得到的紙芯片放于激光切割機(jī)上,將中間紙芯片上親水區(qū)域切掉,形成樣品液體流動(dòng)的中空通道;
(5)在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)與步驟(I)中設(shè)定的疏水蠟打印圖案相互匹配的三電極,包括工作電極,參比電極以及對電極;
(6)采用絲網(wǎng)印刷技術(shù),將步驟(4)所制備的紙芯片上印上三電極(附圖2);
(7)在工作電極上生長三維石墨烯和AuOPd合金納米粒子(3D-GN-Au@Pd-PWE),實(shí)現(xiàn)工作電極的功能化;
(8)將石墨烯量子點(diǎn)(GQDs),適配體鏈及癌細(xì)胞固定在親水區(qū)域,隨后用牛血清白蛋白(BSA)封鎖活性位點(diǎn);
(9)在步驟(8)所得的紙芯片前處理區(qū)埋伏上儲(chǔ)備液;
(10)將步驟(9)所得的紙芯片折疊(附圖3),滴加電解質(zhì)溶液,并將紙芯片與電化學(xué)工作站相連,準(zhǔn)備樣品的測定。
[0008]本發(fā)明所設(shè)計(jì)中空通道紙芯片的疏水蠟打印圖案所用的軟件為Adobeillustrator CS4,蠟打印圖案包括三個(gè)顏色區(qū)域,白色區(qū)域,灰色區(qū)域和黑色區(qū)域,白色區(qū)域四分色所占比例均為0%;灰色區(qū)域四分色所占比例依次為:藍(lán)綠色0%,洋紅色0%,黃色50-60%,黑色0% ;黑色區(qū)域四分色所占比例依次為:藍(lán)綠色0%,洋紅色0%,黃色0%,黑色
100% ο
[0009]本發(fā)明所設(shè)計(jì)的中空通道紙芯片的具體尺寸如附圖2所示,工作電極所在親水區(qū)域直徑為6 _,四個(gè)工作電極間的疏水區(qū)域?yàn)榘胧杷畢^(qū)亦即正面為疏水區(qū),反面為親水區(qū),四個(gè)工作電極兩兩間距為15 mm,與四個(gè)工作電極間橢圓形的區(qū)域相對應(yīng)的反面親水區(qū)域?yàn)闃悠非疤幚韰^(qū),橢圓長軸直徑為3.5 _,短軸直徑為2 _,中空通道寬為2 _,中空通道的直徑與左側(cè)紙芯片完全一致,右側(cè)紙芯片為參比電極和對電極所在區(qū)域,直徑為8 mm,中間區(qū)域?yàn)? _的孔洞,用于滴加電解質(zhì)溶液。
[0010]本發(fā)明所用的蠟打印機(jī)為富士施樂噴蠟打印機(jī)。
[0011]本發(fā)明所用的紙芯片為普通濾紙或者色譜紙。
[0012]本發(fā)明所述的絲網(wǎng)印刷技術(shù)印刷的工作電極為碳印刷電極,對電極為碳電極,參比電極為Ag/AgCl電極。
[0013]本發(fā)明所述的在工作電極上生長三維石墨稀和AuOPd合金納米粒子以實(shí)現(xiàn)紙芯片功能化的步驟為:
制備生長有Au納米粒子種子的工作電極:首先先制備Au納米粒子的種子:量取80 mL去離子水于三口燒瓶中,加熱至96 ° C并保持I min,之后加入2.8 mL 1%檸檬酸鈉,繼續(xù)攪拌15 min,自然冷卻到室溫即可;取15 μ?的所得到的Au納米粒子,滴加到裸露的紙芯片的工作區(qū)域,室溫下干燥I h即可;
制備三維氧化石墨稀:0.75 g石墨粉加入到100 mL H2S04/H3P04 (體積比為9:1)混合溶液中,室溫下攪拌,隨后加入4.5 g KMnO4加熱到50 °C,回流12 h,隨后冷卻到室溫,將混合物加入到300 mL含4 mL H2O2的冰水混合物中,隨后離心,去除未反應(yīng)的石墨,將產(chǎn)物于60 ° C真空干燥,隨后將制備的氧化石墨烯溶解在超純水中,形成0.5 mg.mL—1的單層氧化石墨稀片;
制備3D-GN-Au@Pd-PWE:將生長有Au納米粒子的紙芯片,放于含有10 mL 0.5 mg ?πιΓ1氧化石墨烯,100 mM HAuCl4,100 mM H2PdCl4, 20 PL的聚乙二醇的混合溶液中,超聲I h,隨后將混合溶液放于高壓釜中,190 °C下加熱8-10 h,最后將紙芯片取出,冰凍干燥即可;
本發(fā)明所述的將石墨烯量子點(diǎn)(GQDs),適配體鏈及癌細(xì)胞固定在親水區(qū)域,隨后用牛血清白蛋白封鎖活性位點(diǎn)的步驟為:
制備GQDs:稱取2 g檸檬酸放于5 mL燒杯中,使用電熱套加熱到200 ° C,溶液顏色將由無色,轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色,再轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬?,繼續(xù)加熱30 min即可得到GQDs ;
固定GQDs、適配體鏈(Apt)及癌細(xì)胞:將10 yL GQDs,10 μ L Apt, 10 yL不同濃度的MCF-7癌細(xì)胞依次固定在經(jīng)GQDs和3D-GN_Au@Pd修飾過的紙芯片工作電極上,得到MCF-7-Apt-GQDs-3D-GN-Au@Pd-PWE,最后加入 10 μ L BSA 以封鎖活性位點(diǎn);
本發(fā)明所述的紙芯片樣品前處理區(qū)儲(chǔ)備溶液為MCF-7癌細(xì)胞的相應(yīng)刺激物也就是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,或者空白儲(chǔ)備區(qū),具體的步驟為:
將10 PL癌細(xì)胞的相應(yīng)刺激物也就是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子提前滴加到樣品前處理區(qū),干燥,完成電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與癌細(xì)胞濃度關(guān)系的測定;將前處理區(qū)變?yōu)榭瞻浊疤幚韰^(qū),電解質(zhì)溶液中外加不同濃度的Na2S,測定硫化鈉濃度與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度關(guān)系;
電解質(zhì)溶液為含有0.01-1 M K2S2O8,0.1-10 μΜ Cu2+的0.1M的PBS緩沖溶液。
[0014]本發(fā)明的有益效果
(1)中空通道紙芯片的采用,提高了樣品液體流動(dòng)速度,減少了樣品的揮發(fā),提高了檢測的靈敏度;
(2)3D-GN-AuiPd-PWE的使用,提高了紙芯片的導(dǎo)電性及比表面積,使信號(hào)強(qiáng)度獲得大幅度提尚;
(3)通過將電化學(xué)發(fā)光與紙芯片聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子,亦即H2S的靈敏檢測。
【附圖說明】
[0015]圖1:中空通道紙芯片的疏水蠟打印圖案;
圖2:疏水蠟打印圖案上絲網(wǎng)印刷上4個(gè)工作電極,用數(shù)字I表示,4個(gè)參比電極,用數(shù)字2表示及4個(gè)對電極,用數(shù)字3表示后的圖,其中,左側(cè)紙芯片上為4個(gè)工作電極;右側(cè)紙芯片上為4個(gè)參比電極,4個(gè)為對電極;中間紙芯片為中空通道所在區(qū);
圖3:中空通道紙芯片的折疊方式。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1
一種電化學(xué)發(fā)光中空通道紙芯片的制備及其在癌細(xì)胞硫化氫檢測中的應(yīng)用:
(1)在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)中空通道紙芯片的疏水蠟打印圖案,工作電極所在親水區(qū)域直徑為6 _,四個(gè)工作電極間的疏水區(qū)域?yàn)榘胧杷畢^(qū)亦即正面為疏水區(qū),反面為親水區(qū),四個(gè)工作電極兩兩間距為15 _,與四個(gè)工作電極間橢圓形的區(qū)域相對應(yīng)的反面親水區(qū)域?yàn)闃悠非疤幚韰^(qū),橢圓長軸直徑為3.5 mm,短軸直徑為2 mm,中空通道的直徑與左側(cè)紙芯片完全一致,右側(cè)紙芯片為參比電極和對電極所在區(qū)域,直徑為8 mm,中間區(qū)域?yàn)? mm的孔洞;
(2)通過富士施樂噴蠟打印機(jī)將步驟(I)中設(shè)計(jì)的濾紙紙芯片打印上疏水圖案;
(3)將步驟(2)中得到的紙芯片于60-150°C下加熱1-2分鐘,使蠟融化,形成疏水層;
(4)將步驟(3)中得到的紙芯片放于激光切割機(jī)上,將中間紙芯片上親
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