專利名稱：一種純化梭形賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株賴氨酸芽孢桿菌所產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究。
背景技術(shù)：
氨基甲酸乙酯(英文名urethane或ethyl carbamate,簡稱EC)又名烏拉坦、尿燒，是一種醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料的中間體，或用于生產(chǎn)安眠藥、鎮(zhèn)靜劑、注射劑的助溶劑和印染工業(yè)著色劑，也可用于生物化學(xué)研究。此外，尿烷本身可作成藥使用，具有抗癌性能，用于治療多發(fā)性骨髓瘤和慢性白血病等。20世紀(jì)40年代，Nettleship實驗證明了氨基甲酸乙酯具有致癌作用。主要可以 引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等。氨基甲酸乙酯作為副產(chǎn)物廣泛存在于發(fā)酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪、醬油等)和酒精飲料(如葡萄酒、黃酒、蘋果酒和日本清酒等)中。人體攝取氨基甲酸乙酯主要是通過飲用酒精飲料和食物。氨基甲酸乙酯已成為影響人類健康的一個不可忽視的因素。目前各國政府對發(fā)酵食品中EC的含量已出臺相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國生產(chǎn)的白酒、葡萄酒、醬油等中也廣泛存在著氨基甲酸乙酯，這不僅制約我國相關(guān)產(chǎn)品的出口，更影響普通消費者的健康。因此采取有效的方法控制或消除發(fā)酵食品或飲料中的氨基甲酸乙酯迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種純化梭形賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯酶的方法，其特征在于將所述梭形賴氨酸芽孢桿菌活化發(fā)酵后破壁，使用硫酸銨將氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后獲得粗酶液，將所述粗酶液經(jīng)強陰離子柱、疏水柱、高分辨率離子柱、凝膠柱，純化獲得氨基甲酸乙酯水解酶；所述梭形賴氨酸芽孢桿菌SC02(Lysinibacillus fusiformis)，于2012年10月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC N0:M2012414o所述離子柱為Q XLlmL強陰離子柱，起始緩沖液為20mM PBS, pH7. O ;洗脫緩沖液為含有IM NaCl的起始緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7. O ;洗脫條件為20%B、100%B液線性洗脫，收
集有酶活的部分，進行下一步純化。所述疏水柱采用Phenyl HPlmL疏水柱，起始緩沖液為20mM PBS, pH7. O ；B液為含有IM(NH4) 2S04的起始緩沖液，調(diào)節(jié)pH為7. O ;洗脫條件為100%B、80%B和0%B液梯度洗脫，收集階段洗脫峰，經(jīng)IOkDa透析袋透析36h并測酶活，得到用80%B液洗脫時的蛋白質(zhì)組分，
用于進一步純化。所述離子柱使用Mono Q5/50GL高分辨率離子柱，起始緩沖液為20mM PBS,pH7. O ；洗脫緩沖液為含有IM NaCl的起始緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7. O ;洗脫條件為采用線性洗脫，30個柱體積由0%-100%B分別收集各峰并測定酶活。
所述凝膠柱采用Superdex_200prep grade,收集有酶活的峰,經(jīng)截留分子量IOkDa超濾離心管超濾濃縮后，蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離。所述梭形賴氨酸芽孢桿菌應(yīng)用于氨基甲酸乙酯水解酶的生產(chǎn)或氨基甲酸乙酯的降解也屬于本發(fā)明要保護的范圍。氨基甲酸乙酯水解酶活力測定方法1.原理在一定條件下，氨基甲酸乙酯水解酶將氨基甲酸乙酯分解生成乙醇、氨氣和二氧化碳。氨與苯酚一次氯酸鈉反應(yīng)形成靛酚藍，用分光光度計在625nm處測其OD值，分析氨的生成量。從而得到氨基甲酸乙酯水解酶的酶活。2、試劑底物稱取3g氨基甲酸乙酯溶于IOOmL超純水中，得到含量為396EC的底物。顯色劑1:稱取15g苯酚和O. 625g亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至250mL。顯色劑I1:稱取13. 125g氫氧化鈉和7. 5mL次氯酸鈉用超純水定容至250mL。終止劑稱取IOg三氯乙酸用超純水定容至100mL。3、酶活測定取兩支IOmL比色管，分別加入ImL酶液和超純水。然后在兩管中分別加入ImL底物溶液，在37 C恒溫水浴箱中反應(yīng)15min后，在兩管各加入ImL終止劑，混勾后加入ImL的顯色劑I和ImL顯色劑II，強烈震蕩，繼續(xù)在37°C恒溫水浴箱中保溫20min后取出，用超純水稀釋到IOmL, 625nm處比色，并記錄OD值。4、酶活計算酶活計算公式酶活力=Δ OD625 XnXkX 10/15式中AOD625 :酶反應(yīng)后樣品測定與空白試驗光密度值之差η :酶活測定液稀釋倍數(shù)k:標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)10 ImL樣品液稀釋至IOmL的倍數(shù)15 :酶反應(yīng)的時間(min)5.酶活定義酶活力定義在常壓、37°C條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生I μ mol氨為一個酶活力單位。 本發(fā)明還提供了一種分離純化所述氨基甲酸乙酯水解酶的方法，將所述菌種活化發(fā)酵后破壁，使用硫酸銨將所述氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后獲得粗酶液，將所述粗酶液經(jīng)強陰離子柱、疏水柱、高分辨率離子柱、凝膠柱，純化獲得氨基甲酸乙酯水解酶。


圖1氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化圖2氨基甲酸乙酯水解酶的耐鹽穩(wěn)定性圖3氨基甲酸乙酯水解酶的耐乙醇特性實施例1菌株的獲得將25g每只5周大雌性昆明小鼠進行五天的強飼氨基甲酸乙酯溶液(200mg/kgbody weight/d)后解剖，并用濃度為O. 9%的生理鹽水沖洗小鼠胃腸道組織，取組織懸浮液ImL于1000 Xg下離心10分鐘，取上清液接種于富集培養(yǎng)基中(牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaC15g,氨基甲酸乙酯10g，水1000mL，pH7. 0)，30°C下通氣培養(yǎng)20h。培養(yǎng)液于2000xg離心5分鐘，取上清涂布于篩選培養(yǎng)基(牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaC15g,氨基甲酸乙酯40g，瓊脂20g，水IOOOmL pH5. 0)中培養(yǎng)三天。挑選菌落形態(tài)較大的菌株轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h后進行保藏。挑取_80°C保藏的菌株在營養(yǎng)肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線,于37°C培養(yǎng)24h后,挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37°C在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床培養(yǎng)24h,離心5min(12000rpm,4°C )后收集菌體，再用pH7. O的磷酸鹽緩沖液重懸浮菌體至0. lg/mL。通過超聲破碎進行酶粗提液的提取，對粗酶液進行氨基甲酸乙酯水解酶酶活測定檢測到一株具有氨基甲酸乙酯水解酶的活性的菌株，通過16S rDNA序列分析可知該菌株為一株梭形賴氨酸芽孢桿菌，于2012年10月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0:M2012414，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。實施例2粗酶液的準(zhǔn)備將_80°C保藏的梭形賴氨酸芽孢桿菌菌種，在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上劃線，30°C過夜培養(yǎng)，第二天挑取單菌落接入裝有50mL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶，置于30°C搖床(200rpm)培養(yǎng)24h，4°C收集菌體。收集到的菌體溶于預(yù)冷至4°C的20mM K2HPO4-KH2PO4, pH7. O緩沖液中，將菌體充分懸浮，在冰浴條件下，超聲破壁功率設(shè)定為30W，破Is停ls，破壁Ih后，在4°C條件下IOOOOrpm離心20min,去掉沉淀,上清液即為粗酶液。在冰浴條件下，邊攪拌邊向粗酶液中不斷加入固體硫酸銨，至溶解度為30%，靜置Ih后，IOOOOrpm離心20min,收集上清液。在同樣條件下,繼續(xù)向上清液中加入固體硫酸銨至溶解度為80%，在4°C冰箱中靜置過夜，第二天4°C條件下IOOOOrpm離心20min，去掉上清液，收集到的沉淀溶解在預(yù)冷的20mM PBS, pH7. O中。裝入截留分子量為IOkDa的透析袋中，在4°C條件下，透析48h，其間更換5次20mM PBS, pH7. O緩沖液。實施例3氨基甲酸乙酯水解酶的純化將準(zhǔn)備好的粗酶液經(jīng)強陰離子柱、疏水柱、高分辨率離子柱、凝膠柱，純化得到單一條帶，純度達到95%。1.離子柱過Q XLlmL強陰離子柱，起始緩沖液為20mM PBS, pH7. O ;洗脫緩沖液為含有IMNaCl的起始緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7. O。洗脫條件為20%B、100%B液線性洗脫，收集有酶活的部分，進行下一步純化。2.疏水柱分離采用Phenyl HPlmL疏水柱，起始緩沖液為20mM PBS, pH7. O ；B液為含有IM(NH4)2SO4的起始緩沖液，調(diào)節(jié)pH為7. O。洗脫條件為100%B、80%B和0%B液梯度洗脫，收集階段洗脫峰，經(jīng)IOkDa透析袋透析36h并測酶活，得到用80%B液洗脫時的蛋白質(zhì)組分，用于進一步純化。3.離子柱分離使用Mono Q5/50GL高分辨率離子柱，起始緩沖液為20mM PBS，pH7. O ;洗脫緩沖液為含有IM NaCl的起始緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7. O。洗脫條件為采用線性洗脫，30個柱體積由0%_100%B分別收集各峰并測定酶活。4.凝膠柱收集Mono Q柱純化酶活集中區(qū),過Superdex_200prep grade,收集有酶活的峰,經(jīng)截留分子量IOkDa超濾離心管超濾濃縮后，蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，如圖1顯示為單一條帶。從而純化得到電泳純的氨基甲酸乙酯水解酶。經(jīng)以上純化步驟，得到電泳純的氨基甲酸乙酯水解酶，對純化得到的酶進行酶學(xué)性質(zhì)研究。實施例4氨基甲酸乙酯水解酶酶學(xué)性質(zhì)研究 1.溫度對酶活性及穩(wěn)定性的影響將純化得到的氨基甲酸乙酯水解酶與底物在不同溫度下反應(yīng)，并測定相應(yīng)條件下的酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液在不同溫度下保溫Ih后，調(diào)整酶液至最適溫度并測定殘余酶活力，確定酶的溫度穩(wěn)定性。由以上實驗過程確定此酶的最適反應(yīng)溫度為35°C。在15°C—45°C條件下保溫lh，酶活仍保留80%以上，酶活保持相對穩(wěn)定。2. pH對酶活性及穩(wěn)定性的影響將純化得到的氨基甲酸乙酯水解酶與底物在pH3. 0-8. O的相應(yīng)的緩沖液中反應(yīng)，并測定酶活，確定最適反應(yīng)pH。將酶液在不同pH緩沖液中保溫lh，保溫完成并調(diào)節(jié)pH至最適條件下，測定殘余酶活，確定pH穩(wěn)定性。在pH為3. O和8. O條件下，酶活性幾乎完全消失，在4. 0-7. O之間，隨著pH升高，酶活性逐漸升高。在pH為7. O時，酶活力最高，為最適反應(yīng)pH。超過pH7. O后，酶活性急劇下降。酶活在PH6. 0,7. 0,7. 5保溫Ih后酶活仍保留70%以上，能保持酶活相對穩(wěn)定。3.耐鹽性的研究將純化得到的氨基甲酸乙酯水解酶在不同NaCl濃度的緩沖液中保溫lh，測定相應(yīng)條件下的酶活，繪制鹽濃度-殘余酶活的關(guān)系曲線，確定酶的耐鹽穩(wěn)定性。由鹽濃度與酶活關(guān)系曲線(圖2)所示，在鹽濃度為10%，保溫Ih后，酶活保留10%，在鹽濃度為15%時，酶活仍保留8%。4.耐乙醇性研究將純化得到的氨基甲酸乙酯水解酶在含有不同乙醇濃度緩沖液中保溫lh，測定相應(yīng)條件下的酶活，繪制乙醇濃度-殘余酶活的關(guān)系曲線，確定酶的耐乙醇穩(wěn)定性。由乙醇濃度與酶活力曲線(圖3)可知，在乙醇濃度為2. 5%時，酶活保持在65%以上，在18%時，酶活仍保留5%。5.多種金屬離子與EDTA對酶活力的影響將酶液與含有ImM相應(yīng)金屬離子的緩沖液混合，在溫度穩(wěn)定條件下保溫5min，測定酶活力，以未添加金屬離子測得酶活為100%，估計金屬離子對酶活力的影響。結(jié)果如表1.由表I可以看出，Cu2+對酶活影響最大，保溫5min，酶活保留為原酶活的28%，F(xiàn)e2+和Ni2+對酶活同樣有抑制作用，保溫后使酶活下降一半。加入EDTA后酶活反而略有升高。說明此氨基甲酸乙酯水解酶為非金屬依賴型酶。
表I金屬離子與EDTA對酶活力的影響
權(quán)利要求
1.一種純化梭形賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯酶的方法，其特征在于將所述梭形賴氨酸芽孢桿菌活化發(fā)酵后破壁，使用硫酸銨將氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后獲得粗酶液，將所述粗酶液經(jīng)強陰離子柱、疏水柱、高分辨率離子柱、凝膠柱，純化獲得氨基甲酸乙酯水解酶；所述梭形賴氨酸芽孢桿菌SC02 (Lysinibacillus fusiformis),于2012年10月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2012414。
2.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述離子柱為QXLlmL強陰離子柱，起始緩沖液為20mM PBS, pH7. O ;洗脫緩沖液為含有IM NaCl的起始緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7. O ;洗脫條件為20%B、100%B液線性洗脫，收集有酶活的部分，進行下一步純化。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述疏水柱采用PhenylHPlmL疏水柱，起始緩沖液為20mM PBS, ρΗ7· O ；Β液為含有IM(NH4)2SO4的起始緩沖液，調(diào)節(jié)pH為7. O ; 洗脫條件為100%B、80%B和0%B液梯度洗脫，收集階段洗脫峰，經(jīng)IOkDa透析袋透析36h并測酶活，得到用80%B液洗脫時的蛋白質(zhì)組分，用于進一步純化。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述離子柱使用MonoQ5/50GL高分辨率離子柱，起始緩沖液為20mM PBS，pH7. O ;洗脫緩沖液為含有IM NaCl的起始緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7. O ; 洗脫條件為采用線性洗脫，30個柱體積由0%-100%B分別收集各峰并測定酶活。
5.權(quán)利要求1或2所述的方法,其特征在于所述凝膠柱采用Superdex_200prepgrade,收集有酶活的峰，經(jīng)截留分子量IOkDa超濾離心管超濾濃縮后，蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離。
6.權(quán)利要求1-5任一所述的梭形賴氨酸芽孢桿菌應(yīng)用于氨基甲酸乙酯的降解。
全文摘要
本發(fā)明一種純化梭形賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯酶的方法，所述賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus fusiformis)SC02，于2012年10月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2012414，將所述梭形賴氨酸芽孢桿菌活化發(fā)酵后破壁，使用硫酸銨將氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后獲得粗酶液，將所述粗酶液經(jīng)強陰離子柱、疏水柱、高分辨率離子柱、凝膠柱，純化獲得氨基甲酸乙酯水解酶，本方法可高效的具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/18GK103013948SQ20121057834
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者陳堅, 堵國成, 方芳, 李京京 申請人:江南大學(xué)