專利名稱：人羊膜間充質干細胞分化為神經元樣細胞的誘導方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域的一種人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)分化為神經元樣細胞誘導方法，特別涉及一種應用全反式維甲酸、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子誘導人羊膜間充質干細胞分化為神經元樣細胞的方法。
背景技術：
人羊膜間充質干細胞(humanamnion membrane mesenchymal stemcelIs, hAMSCs)維持了原腸胚形成前期胚胎干細胞的可塑性，擁有更大的多向分化潛能。hAMSCs理論上可以分化成各種組織細胞，同時因羊膜獲得方便且回避了倫理學爭議，有潛力成為未來臨床應用的干細胞來源之一。但hAMSCs移植后神經細胞轉化率在體內僅為3% 10%，而且在 體內環(huán)境下分化為神經膠質細胞的比率較大而分化為神經元樣細胞的比率較小，這無疑會給神經系統(tǒng)功能的恢復帶來不利因素。如果能將hAMSCs在體外分化為神經元樣細胞，再行細胞移植會有事半功倍的效果。中胚層來源的骨髓間充質干細胞(BMSCs)向外胚層來源的神經元分化的研究正處于起步階段。全反式維甲酸是維生素A的衍生物，能夠明顯增加神經細胞的數(shù)量并呈劑量依賴效應，能調節(jié)EGF (表皮生長因子)反應的神經干細胞分化，增加神經元細胞和星形膠質細胞的合成。將其與神經營養(yǎng)因子和細胞因子聯(lián)合用于誘導胚胎干細胞向神經干細胞方向分化，同體內發(fā)育過程相似，且可以部分模擬體內環(huán)境，因此日益受到重視。但是，這些研究多停留在誘導后hAMSCs具有神經元形態(tài)特征和表達神經細胞標記物水平上，而缺乏具有神經細胞生理學特性的證據(jù)，因此許多學者認為這類細胞被稱為“神經元樣細胞”更為妥當。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)分化為神經元樣細胞誘導方法，其是應用全反式維甲酸、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子誘導人羊膜間充質干細胞分化為神經元樣細胞，不僅具有了神經細胞的典型形態(tài)，并表達神經元標志抗原神經元特異性烯醇化酶、星型膠質細胞標志抗原膠質纖維酸性蛋白，所述方法具體包括以下步驟:hAMSCs分離，hAMSCs原代培養(yǎng)，hAMSCs的傳代培養(yǎng)與擴增，hAMSCs細胞免疫表型的檢測，hAMSCs誘導分化為神經元樣細胞以及細胞免疫熒光染色。其中，所述的hAMSCs分離的步驟包括無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤，采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hanks液沖洗，將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約Imm3碎塊，加入2. 5g/L胰蛋白酶37°C消化10分鐘；加入含5%小牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后用200目細胞篩過濾；過濾后的羊膜組織中加入1. Og/LII型膠原酶消化液，37°C消化O. 5小時；加入含5%小牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞；在1000轉/分鐘條件下離心5分鐘；臺盼蘭染色計數(shù)活細胞，調整細胞密度為I X 106/ml，接種至25cm2培養(yǎng)瓶，加入含10ng/ml bFGF和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基；置37°C、飽和濕度、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下每日觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態(tài)特征，隔天換液I次，并攝片記錄；待細胞匯合度達80%后，用O. 25%胰蛋白酶-O. 02% EDTA(乙二胺四乙酸)溶液于37°C消化2_3分鐘，加入培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用，1000轉/分鐘下離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀用培養(yǎng)基重新懸浮后，以IXlOVml的細胞密度傳代；傳代過程中，隔日換液I次，待細胞長滿70%瓶底重復以上步驟；·
所述的hAMSCs的原代培養(yǎng)步驟包括將羊膜細胞懸液移入離心管，配平，2000轉/分鐘進行15分鐘離心，棄上清，收集細胞；將收集的細胞用O. OlM PBS 30mL吹打成均勻懸液，1500轉/分鐘進行15分鐘離心，洗滌2次，收集細胞；接種細胞前吸取FBS 3mL加入T75cm2型細胞培養(yǎng)瓶，置37°C，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱孵育30分鐘，對培養(yǎng)瓶進行包被；棄包被液，用含20% FBS,4ng/ml表皮生長因子的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數(shù)細胞；調整細胞濃度為1. OX IO6細胞/ml，接種于包被后的T75cm2型細胞培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相差顯微鏡動態(tài)觀察；培養(yǎng)4-5天后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次；觀察細胞貼壁生長至80-90%匯合時，以O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，所得細胞為原代細胞。所述的hAMSCs的傳代培養(yǎng)與擴增步驟包括觀察原代hAMSCs細胞貼壁生長至80-90%匯合時，吸棄培養(yǎng)瓶內原有培養(yǎng)液，吸取IOmlO. OlM PBS緩沖液輕輕加入培養(yǎng)瓶內洗滌，棄去洗液；加入O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化液1. 0ml，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察；加入1. Oml FBS中止胰酶消化；加入IOml O. OlM PBS反復吹打沖洗，在室溫下900轉/分鐘進行10分鐘離心；棄去上清液，加入10mlDMEM/F12重懸細胞，按1: 2-1 : 3比例傳代培養(yǎng)；置371，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計為第I代(Pl)hAMSCs，待細胞生長至80-90%匯合時，重復上述操作進行P2、P3、P4…代細胞培養(yǎng)擴增。所述hAMSCs細胞免疫表型的檢測步驟包括取培養(yǎng)第2或第3代細胞，首先用O. 25 %的胰蛋白酶消化后，然后用含I %小牛血清白蛋白的PBS調整細胞濃度至I X IO7/ml ;分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、0)44^^、0)105411'(、0)106411'(、!11^-01 - 11'(，置41孵育半小時，？83洗 I 次，進行流式細胞儀檢測分析。所述的hAMSCs誘導分化為神經元樣細胞的步驟包括取2-3代培養(yǎng)細胞，分別接種于6孔板，生長密度達到60%時，換成誘導培養(yǎng)基；37°C、5% CO2，飽和濕度靜置培養(yǎng)。所述的細胞免疫熒光染色步驟包括培養(yǎng)細胞在誘導分化3天后采用免疫熒光染色。本發(fā)明應用全反式維甲酸(ATRA)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)誘導人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)分化為神經元樣細胞，不僅具有了神經細胞的典型形態(tài)，并表達神經元標志抗原神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、星型膠質細胞標志抗原膠質纖維酸性蛋白(glial fibrilament acidicprotein,GFAP);提示BMSCs仍然保留了跨胚層分化為非間充質細胞的能力，可跨胚層分化為神經元樣細胞，有望成為神經細胞替代治療的種子細胞。


通過下面結合附圖的詳細描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的人羊膜間充質干細胞分化為神經元樣細胞的誘導方法的步驟流程圖。
具體實施例方式如圖1所示的本發(fā)明的人羊膜間充質干細胞分化為神經元樣細胞誘導方法的步驟流程圖，其是應用全反式維甲酸、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子誘導人羊膜間充質干細胞分化為神經元樣細胞所述方法具體包括以下步驟S1、人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)的分離 無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤，采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hanks液沖洗數(shù)次以清除殘留血跡，將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約Imm3碎塊，加入
2.5g/L胰蛋白酶37°C消化10分鐘；加入含5%小牛血清的DMEM終止消化，并輕柔吹打混勻后用200目細胞篩過濾；過濾后的羊膜組織中加入1. Og/L II型膠原酶消化液，37°C消化O. 5小時；加入含5%小牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞；在1000轉/分鐘條件下離心5分鐘；臺盼蘭染色計數(shù)活細胞，調整細胞密度為I X 106/ml，接種至25cm2培養(yǎng)瓶，加入含10ng/ml bFGF和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基；置37°C、飽和濕度、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下每日觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態(tài)特征，隔天換液I次，并攝片記錄；待細胞匯合度達80%后，用O. 25%胰蛋白酶-O. 02% EDTA(乙二胺四乙酸)溶液于37°C消化2_3分鐘，加入培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用，1000轉/分鐘下離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀用培養(yǎng)基重新懸浮后，以I X IOVml的細胞密度傳代；傳代過程中，隔日換液I次，待細胞長滿70%瓶底重復以上步驟。S2、hAMSCs 的原代培養(yǎng)將羊膜細胞懸液移入離心管，配平，2000轉/分鐘進行15分鐘離心，棄上清，收集細胞；將收集的細胞用O. OlM PBS 30mL吹打成均勻懸液，1500轉/分鐘進行15分鐘離心，洗滌2次，收集細胞；接種細胞前吸取FBS 3mL加入T75cm2型細胞培養(yǎng)瓶，置37°C，5%C02，飽和濕度培養(yǎng)箱孵育30分鐘，對培養(yǎng)瓶進行包被；棄包被液，用含20% FBS，4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數(shù)細胞；調整細胞濃度為1.0父106細胞/1111，接種于包被后的175(^2型細胞培養(yǎng)瓶中，置于371，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相差顯微鏡動態(tài)觀察；培養(yǎng)4-5天后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次；觀察細胞貼壁生長至80-90%匯合時，以O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，所得細胞為原代細胞。S3、hAMSCs的傳代培養(yǎng)與擴增觀察原代hAMSCs細胞貼壁生長至80-90 %匯合時，吸棄培養(yǎng)瓶內原有培養(yǎng)液，吸取IOml O. OlM PBS緩沖液輕輕加入培養(yǎng)瓶內洗滌，棄去洗液；加入O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化液1. 0ml，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察，見細胞間隙增大，胞質回縮，搖動吹打后見細胞呈圓形漂起；加入1. Oml FBS中止胰酶消化；加入IOml O. OlM PBS反復吹打沖洗，在室溫下900轉/分鐘進行10分鐘離心；棄去上清液，加入IOml DMEM/F12重懸細胞，按1:2-1:3比例傳代培養(yǎng)；培養(yǎng)體系為20% FBS,4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培養(yǎng)液15ml/瓶。置37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計為第I代(passagel，Pl)hAMSCs，待細胞生長至80-90%匯合時，重復上述操作進行P2、P3、P4…代細胞培養(yǎng)擴
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>曰OS4、hAMSCs細胞免疫表型的檢測取培養(yǎng)第2或第3代細胞，首先用O. 25%的胰蛋白酶消化后，然后用含1%小牛血清白蛋白的PBS調整細胞濃度至IXlOVml ;分別加入下列鼠抗人單克隆抗體⑶34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、HLA-DR-FITC，置 4°C孵育半小時，PBS洗I次，進行流式細胞儀檢測分析；流式細胞儀檢測顯示，BMSCs表達CD29、CD44 和 CD 106。 S5、hAMSCs誘導分化為神經元樣細胞取2-3代培養(yǎng)細胞，分別接種于6孔板，生長密度達到60 %時，換成誘導培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+lymol/L ATRA+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF) ;37°C、5% CO2，飽和濕度靜置培養(yǎng)；加入誘導液2小時后細胞形態(tài)即明顯變化，光鏡下BMSCs的細胞質向核收縮，呈典型的核周體形態(tài)；3 5小時后多數(shù)細胞能形成神經元樣細胞形態(tài)，胞體呈圓形，突起較長，在突起末端出現(xiàn)分支，部分相鄰細胞的突起連接成網，但細胞數(shù)目無明顯增加；3天后大多數(shù)細胞轉變?yōu)殡p極或多極神經元細胞樣形態(tài)，伸出突觸(類似軸突或樹突)，部分細胞之間拉成網狀。S6、細胞免疫熒光染色培養(yǎng)細胞在誘導分化3天后采用免疫熒光染色。貼壁細胞去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，經4 %的多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗滌3次，O. 3% TritonX-1OO處理20分鐘，PBS漂洗3次，10%羊血清室溫封閉20分鐘，吸出血清，分別加入兔抗人NSE(1 500)、GFAP(1 1000)，37°C孵育2小時，然后PBS洗3次，加入羊抗鼠-FITCd 500)孵30分鐘，染色可見50-70% NSE,25-50% GFAP陽性，Nestin陽性細胞在48h時下降為1. 6%0本發(fā)明應用全反式維甲酸(ATRA)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)誘導人羊膜間充質干細胞(human amnionmembrane mesenchymal stem cells,hAMSCs)分化為神經元樣細胞，不僅具有了神經細胞的典型形態(tài)，而且表達神經細胞標志蛋白，提示BMSCs仍然保留了跨胚層分化為非間充質細胞的能力，可跨胚層分化為神經元樣細胞，有望成為神經細胞替代治療的種子細胞。本發(fā)明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。
權利要求
1.一種人羊膜間充質干細胞分化為神經元樣細胞誘導方法，其特征在于，其應用全反式維甲酸聯(lián)合bFGF、EGF誘導臍帶間充質干細胞分化為神經干細胞，所述方法包括以下步驟hAMSCs分離，hAMSCs原代培養(yǎng)，hAMSCs的傳代培養(yǎng)與擴增，hAMSCs細胞免疫表型的檢測，hAMSCs誘導分化為神經元樣細胞以及細胞免疫熒光染色；其中， 所述的hAMSCs分離的步驟包括無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤，采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hanks液沖洗，將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約Imm3碎塊，加入2.5g/L胰蛋白酶37°C消化10分鐘；加入含5%小牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后用200目細胞篩過濾；過濾后的羊膜組織中加入1. Og/L II型膠原酶消化液，37°C消化O. 5小時；加入含5%小牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞；在1000轉/分鐘條件下離心5分鐘；臺盼蘭染色計數(shù)活細胞，調整細胞密度為IX IO6/ml，接種至25cm2培養(yǎng)瓶，加入含10ng/ml bFGF和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基；置37。。、飽和濕度、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下每日觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態(tài)特征，隔天換液I次，并攝片記錄；待細胞匯合度達80%后,用O. 25%膜蛋白酶-O. 02% EDTA(乙二胺四乙酸)溶液于37°C消化2_3分鐘，加入培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用，1000轉/分鐘下離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀用培養(yǎng)基重新懸浮后，以I X IOVml的細胞密度傳代；傳代過程中，隔日換液I次，待細胞長滿70%瓶底重復以上步驟； 所述的hAMSCs的原代培養(yǎng)步驟包括將羊膜細胞懸液移入離心管，配平，2000轉/分鐘進行15分鐘離心，棄上清，收集細胞；將收集的細胞用O. OlM PBS 30mL吹打成均勻懸液，1500轉/分鐘進行15分鐘離心，洗滌2次，收集細胞；接種細胞前吸取FBS 3mL加入T75cm2型細胞培養(yǎng)瓶，置37°C，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱孵育30分鐘，對培養(yǎng)瓶進行包被；棄包被液，用含20% FBS，4ng/ml表皮生長因子的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數(shù)細胞；調整細胞濃度為1. OX IO6細胞/ml，接種于包被后的T75cm2型細胞培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相差顯微鏡動態(tài)觀察；培養(yǎng)4-5天后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次；觀察細胞貼壁生長至80-90%匯合時，以O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，所得細胞為原代細胞； 所述的hAMSCs的傳代培養(yǎng)與擴增步驟包括觀察原代hAMSCs細胞貼壁生長至80-90%匯合時，吸棄培養(yǎng)瓶內原有培養(yǎng)液，吸取IOmlO. OlM PBS緩沖液輕輕加入培養(yǎng)瓶內洗滌，棄去洗液；加入O. 25 %胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化液1. 0ml，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察；加入1. Oml FBS中止胰酶消化；加入IOml O. OlM PBS反復吹打沖洗，在室溫下900轉/分鐘進行10分鐘離心；棄去上清液，加入IOml DMEM/F12重懸細胞，按1: 2-1 : 3比例傳代培養(yǎng)；置371，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計為第I代(Pl)hAMSCs，待細胞生長至80-90%匯合時，重復上述操作進行P2、P3、P4…代細胞培養(yǎng)擴增； 所述hAMSCs細胞免疫表型的檢測步驟包括取培養(yǎng)第2或第3代細胞，首先用O. 25%的胰蛋白酶消化后，然后用含1%小牛血清白蛋白的PBS調整細胞濃度至IXlOVml ;分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、HLA-DR-FITC，置4°C孵育半小時，PBS洗I次，進行流式細胞儀檢測分析； 所述的hAMSCs誘導分化為神經元樣細胞的步驟包括取2-3代培養(yǎng)細胞，分別接種于6孔板，生長密度達到60%時，換成誘導培養(yǎng)基；37°C、5% CO2，飽和濕度靜置培養(yǎng)；以及所述的細胞免疫熒光染色步驟包括培養(yǎng)細胞在誘導分化3天后采用免疫熒光染色。
2.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞分化為神經元樣細胞誘導方法，其特征在于，所述hAMSC s誘導分化為神經元樣細胞的步驟中的誘導培養(yǎng)基為DMEM+10 %FBS+1 μ mol/LATRA+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF。
全文摘要
本發(fā)明提供一種應用全反式維甲酸、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)誘導人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)分化為神經元樣細胞的方法，所述方法包括以下步驟hAMSCs分離，hAMSCs原代培養(yǎng)，hAMSCs的傳代培養(yǎng)與擴增，hAMSCs細胞免疫表型的檢測，hAMSCs誘導分化為神經元樣細胞以及細胞免疫熒光染色。本發(fā)明的誘導方法應用全反式維甲酸聯(lián)合bFGF、EGF誘導臍帶間充質干細胞分化為神經干細胞，不僅具有了神經細胞的典型形態(tài)，并表達神經元標志抗原神經元特異性烯醇化酶、星型膠質細胞標志抗原膠質纖維酸性蛋白，實現(xiàn)了間充質細胞跨胚層分化為非間充質細胞的能力，使其有可能成為今后臨床應用更為理想的種子細胞。
文檔編號C12N5/0793GK103013917SQ20121050524
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權日2012年11月30日
發(fā)明者陸華 申請人:陸華