專利名稱：臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞的誘導方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種應用全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子誘導臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞的方法。
背景技術(shù)：
目前，神經(jīng)干細胞主要從胚胎干細胞誘導或是直接從發(fā)育中和成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離培養(yǎng)獲得。但是倫理學、安全性問題以及細胞來源和數(shù)量的有限，在一定程度上限制了神經(jīng)干細胞的移植應用。因此，很有必要尋找其它能夠獲得神經(jīng)干細胞的途徑來克服這些限制。中胚層來源的間充質(zhì)干細胞向外胚層來源的神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)化的研究正處于起步階段，臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)來自新生兒，取材方便、易于體外擴增、安全無病毒感染風險以及不受倫理和法律限制等優(yōu)勢，表達胚胎干細胞特異性基因、端粒末端轉(zhuǎn)移酶SSEA4和TAR-1-60等原始干細胞表面標志，如能將UC-MSCs誘導為神經(jīng)干細胞后應用將規(guī)避上述不足之處。全反式維甲酸是維生素A的衍生物，能夠明顯增加神經(jīng)細胞的數(shù)量并呈劑量依賴效應，能調(diào)節(jié)表皮生長因子(EGF)反應的神經(jīng)干細胞分化，增加神經(jīng)元細胞和星形膠質(zhì)細胞的合成。將其與神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞因子聯(lián)合用于誘導胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞方向分化，同體內(nèi)發(fā)育過程相似，且可以部分模擬體內(nèi)環(huán)境，可以誘導UC-MSCs轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞，使其有可能成為今后臨床應用更為理想的種子細胞。

發(fā)明內(nèi)容
為使UC-MSCs有效轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞，本發(fā)明提供一種應用全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)誘導臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)分化為神經(jīng)干細胞的方法，UC-MSCs經(jīng)誘導轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞，經(jīng)分裂增殖多次傳代后仍然保持較強的活力，實現(xiàn)了間充質(zhì)細胞跨胚層分化為非間充質(zhì)細胞的能力。具體的，本發(fā)明的臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞的誘導方法包括如下步驟=UC-MSCs的分離、原代培養(yǎng)，UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴增，UC-MSCs體外誘導轉(zhuǎn)化神經(jīng)干細胞，神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)以及免疫熒光法檢測。其中，所述的UC-MSCs的分離、原代培養(yǎng)的步驟包括無菌條件下，將健康胎兒的臍帶用含有雙抗和兩性霉素的D-Hanks液充分沖洗，沖去臍靜脈及動脈內(nèi)的殘存積血；撕掉臍帶表面的羊膜得到間充質(zhì)組織，用組織剪將臍帶組織剪碎成Imm3大小的組織塊，將組織塊移至內(nèi)含一磁力攪拌子的玻璃瓶中，加入膠原酶37°C下持續(xù)磁力攪拌消化30分鐘；向膠原酶-組織塊消化體系內(nèi)加入終濃度為O. 125%的胰酶，在37°C環(huán)境中繼續(xù)磁力攪拌消化30分鐘后，加入10%體積的FBS終止消化；將收集的細胞用PBS吹打成均勻懸液，1500轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)15分鐘洗滌后收集細胞；用含20% FBS，4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數(shù)細胞；調(diào)整細胞濃度為1. OX IO6細胞/ml，接種于包被后的細胞培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)4-5天后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次；細胞貼壁生長至80-90%匯合時，以O(shè). 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，得到原代細胞。所述UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴增步驟包括觀察原代培養(yǎng)細胞貼壁生長至80-90%匯合時，吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)原有培養(yǎng)液，吸取PBS緩沖液加入培養(yǎng)瓶內(nèi)洗滌，棄去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液，浸漫覆蓋瓶底；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反復吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；棄去上清液，加入DMEM/F12重懸細胞，按1:2-1: 3比例在細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，計為第I代UC-MSC ;待細胞生長至80-90%匯合時，重復上述操作進行多代細胞培養(yǎng)擴增。所述UC-MSCs體外誘導轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞步驟包括取2-3代培養(yǎng)細胞，分別接種于6孔板，生長密度達到60%時，換成全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子的誘導培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)；待培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進行傳代培養(yǎng)；無菌條件下，在倒置顯微鏡下用玻璃微針將其中的大于200 μ m的大克隆球切成數(shù)塊，繼續(xù)培養(yǎng)；7 10天傳代I次；傳代后的細胞再無血清誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)。所述神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)步驟包括將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經(jīng)胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的小培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基和經(jīng)過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養(yǎng)。所述的免疫熒光法檢測步驟包括將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿中，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12 小時后行熒光檢測；經(jīng)分化培養(yǎng)后的細胞分別于2、7、14和21天行熒光檢測。本發(fā)明應用全反式維甲酸(ATRA)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)誘導臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)分化為神經(jīng)干細胞，經(jīng)分裂增殖多次傳代后仍然保持較強的活力，并呈巢蛋白(Nestin)的陽性表達，分化后細胞行免疫熒光檢測顯示均表達神經(jīng)元標志抗原神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、星型膠質(zhì)細胞標志抗原膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrilamentacidic protein,GFAP);具有自我更新及多分化潛能，證明UC-MSCs仍然保留了跨胚層分化為非間充質(zhì)細胞的能力，可跨胚層分化為神經(jīng)干細胞，有望成為神經(jīng)細胞替代治療的種子細胞。


通過下面結(jié)合附圖的詳細描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞的誘導方法的步驟流程不意圖。
具體實施例方式如圖1所示為本發(fā)明的臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞的誘導方法的步驟流程示意圖，所述實施例的方法包括如下步驟S1、UC-MSCs的分離、原代培養(yǎng)無菌條件下，將剖宮產(chǎn)足月妊娠健康胎兒的臍帶IOcm,用含有1%雙抗和250ug/mL兩性霉素的D-Hanks液充分沖洗臍帶外表面，并用20mL注射器分別插入兩根臍靜脈及一根臍動脈內(nèi)反復沖洗，沖去臍靜脈及動脈內(nèi)的殘存積血；撕掉臍帶表面的羊膜得到間充質(zhì)組織，用組織剪將臍帶組織剪碎成Imm3大小的組織塊，將組織塊(約30-40ml)移至內(nèi)含一磁力攪拌子的IOOmL玻璃瓶中，加入O. 2%膠原酶II30-40mL (終濃度約為O.1 % )，37°C，持續(xù)磁力攪拌下消化30分鐘；向膠原酶-組織塊消化體系內(nèi)加入終濃度為O. 125%的胰酶，在37°C環(huán)境中繼續(xù)磁力攪拌消化30分鐘后，加入10%體積的胎牛血清(FBS)終止消化；將收集的細胞用O. OlM PBS (磷酸鹽緩沖液)30mL吹打成均勻懸液，1500轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)15分鐘洗滌2次，收集細胞；用含20% FBS,4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數(shù)細胞；調(diào)整細胞濃度為1. OX IO6細胞/ml，接種于包被后的T75cm2型細胞培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相差顯微鏡動態(tài)觀察；培養(yǎng)4-5天后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次。觀察細胞貼壁生長至80-90%匯合時，以O(shè). 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA(乙二胺四乙酸)消化，所得細胞為原代細胞。S2、UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴增觀察原代培養(yǎng)細胞貼壁生長至80-90%匯合時，吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)原有培養(yǎng)液，吸取IOml O. OlM PBS緩沖液輕輕加入培養(yǎng)瓶內(nèi)洗滌，棄去洗液；加入O. 25%胰蛋白酶-O. 01%EDTA消化液1. 0ml，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察，見細胞間隙增大，胞質(zhì)回縮，搖動吹打后見細胞呈圓形漂起；加入1.0ml FBS中止胰酶消化；加入IOml O. OlM PBS反復吹打沖洗，在室溫下900rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入10mlDMEM/F12重懸細胞，按1:2-1: 3比例傳代培養(yǎng)；培養(yǎng)體系為20% FBS，4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液15ml/瓶。置37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計為第I代(passagel, PDUC-MSC ;待細胞生長至80-90%匯合時，重復上述操作進行P2、P3、P4…代細胞培養(yǎng)擴增。S3、UC-MSCs體外誘導轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞取2-3代培養(yǎng)細胞，分別接種于6孔板，生長密度達到60 %時，換成全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子的誘導培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+lymol/L ATRA+20ng/ml bFGF+20ng/mlEGF)。在37°C、5% CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)；待培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進行傳代培養(yǎng)。采用嚴格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球(大于200μπι)切成數(shù)塊，小克隆球(小于100 μ m)不作處理，繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)克隆球生長情況，7 10天傳代I次；傳代后的細胞無血清誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)。S4、 神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經(jīng)胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的、直徑3. 5cm的小培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基和經(jīng)過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養(yǎng)。神經(jīng)干細胞在DMEM/F12+50g/L FBS有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12小時后即可見部分細胞貼壁并有短小突起伸出，2天后可見大部分細胞貼壁生長，形態(tài)不規(guī)則，突起不斷增粗和伸長，I周后分化成形態(tài)不一的、分散成片的多突起星狀細胞和神經(jīng)元樣細胞，突起互相交織成網(wǎng)狀；2周后部分分化細胞開始衰退。在DMEM/F12+5%Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基中，一部分細胞出現(xiàn)貼壁分化現(xiàn)象，另一部分細胞則繼續(xù)分裂增殖，最后細胞可以很快貼滿整個皿底。新鮮成人腦脊液中亦出現(xiàn)很好的分化現(xiàn)象，經(jīng)適時更換腦脊液，細胞可以長期存活。S5、免疫熒光法檢測
將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿中，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12小時后行熒光檢測；經(jīng)分化培養(yǎng)后的細胞分別于2、7、14和21天行熒光檢測。每個培養(yǎng)皿用蠟筆畫五個圈，分別用抗Nestin IgG、抗NSE IgG、抗GFAP IgG、抗CNP IgG和空白對照行免疫熒光染色，二抗為FITC熒光二抗。貼壁的克隆球呈巢蛋白(Nestin)抗原陽性，同時NSE、GFAP和CNP免疫熒光染色均呈陰性。在DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基和新鮮成人腦脊液中分化的細胞，不同時間點均檢測到NSE、GFAP和CNP陽性細胞，2周后幾乎未找到Nestin陽性細胞。本實施例從人臍帶中分離培養(yǎng)出了人臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)，發(fā)現(xiàn)其具有自我更新、體外易擴增、多向分化潛能以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學特性，其形態(tài)、免疫表型以及多分化潛能等多種生物學特性與BMSCs極為相似。應用全反式維甲酸(ATRA)J#^成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)誘導臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)分化為神經(jīng)干細胞，經(jīng)分裂增殖多次傳代后仍然保持較強的活力，并呈巢蛋白(Nestin)的陽性表達，分化后細胞行免疫熒光檢測顯示均表達神經(jīng)元標志抗原神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase, NSE)、星型膠質(zhì)細胞標志抗原膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrilament acidic protein,GFAP);具有自我更新及多分化潛能,證明UC-MSCs仍然保留了跨胚層分化為非間充質(zhì)細胞的能力，可跨胚層分化為神經(jīng)干細胞，有望成為神經(jīng)細胞替代治療的種子細胞。本發(fā)明并不局限于所述的實施例 ，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準。
權(quán)利要求
1.一種臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞的誘導方法，其特征在于應用全反式維甲酸和細胞因子誘導臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞，所述誘導方法包括如下步驟UC-MSCs的分離、原代培養(yǎng)，UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴增，UC-MSCs體外誘導轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞，神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)以及免疫熒光法檢測；其中， 所述的UC-MSCs的分離、原代培養(yǎng)的步驟包括無菌條件下，將健康胎兒的臍帶用含有雙抗和兩性霉素的D-Hanks液充分沖洗，沖去臍靜脈及動脈內(nèi)的殘存積血；撕掉臍帶表面的羊膜得到間充質(zhì)組織，用組織剪將臍帶組織剪碎成Imm3大小的組織塊，將組織塊移至內(nèi)含一磁力攪拌子的玻璃瓶中，加入膠原酶37°C下持續(xù)磁力攪拌消化30分鐘；向膠原酶-組織塊消化體系內(nèi)加入終濃度為O. 125%的胰酶，在37°C環(huán)境中繼續(xù)磁力攪拌消化30分鐘后，加入10%體積的FBS終止消化；將收集的細胞用PBS吹打成均勻懸液，1500轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)15分鐘洗滌后收集細胞；用含20%FBS，4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數(shù)細胞；調(diào)整細胞濃度為1. OX IO6細胞/ml，接種于包被后的細胞培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)4-5天后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次；細胞貼壁生長至80-90%匯合時，以O(shè). 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，得到原代細胞； 所述的UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴增步驟包括觀察原代培養(yǎng)細胞貼壁生長至80-90%匯合時，吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)原有培養(yǎng)液，吸取PBS緩沖液加入培養(yǎng)瓶內(nèi)洗滌，棄去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液，浸漫覆蓋瓶底；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反復吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；棄去上清液，加入DMEM/F12重懸細胞，按1: 2_1 : 3比例在細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，計為第I代UC-MSC ;待細胞生長至80-90%匯合時，重復上述操作進行多代細胞培養(yǎng)擴增； 所述的UC-MSCs體外誘導轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞步驟包括取2-3代培養(yǎng)細胞，分別接種于6孔板，生長密度達到60%時，換成全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子的誘導培養(yǎng)基，在37°C、5%CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)；待培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進行傳代培養(yǎng)；無菌條件下，在倒置顯微鏡下用玻璃微針將其中的大于200 μ m的大克隆球切成數(shù)塊，繼續(xù)培養(yǎng)；7 10天傳代I次；傳代后的細胞再無血清誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)； 所述的神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)步驟包括將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經(jīng)胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的小培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基和經(jīng)過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養(yǎng)；以及 所述的免疫熒光法檢測步驟包括將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿中，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12小時后行熒光檢測；經(jīng)分化培養(yǎng)后的細胞分別于2、7、14和21天行熒光檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞的誘導方法，其特征在于，所述的UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴增步驟中，所述的傳代培養(yǎng)體系為20% FBS,4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液。
3.如權(quán)利要求1所述的臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞的誘導方法，其特征在于，所述的UC-MSCs體外誘導轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞步驟中，所述的誘導培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1μ mol/L ATRA+20ng/mlbFGF+20ng/ml EGF。
全文摘要
本發(fā)明提供一種臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)分化為神經(jīng)干細胞的誘導方法，所述誘導方法包括如下步驟UC-MSCs的分離、原代培養(yǎng)，UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴增，UC-MSCs體外誘導轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞，神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)以及免疫熒光法檢測。本發(fā)明的誘導方法應用全反式維甲酸聯(lián)合堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)誘導臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞，經(jīng)分裂增殖多次傳代后仍然保持較強的活力。反式維甲酸聯(lián)合細胞因子誘導UC-MSCs轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞，實現(xiàn)了間充質(zhì)細胞跨胚層分化為非間充質(zhì)細胞的能力，使其有可能成為今后臨床應用更為理想的種子細胞。
文檔編號C12N5/0775GK103031275SQ201210504988
公開日2013年4月10日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者陸華 申請人:陸華