專(zhuān)利名稱(chēng)：利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽CecropinB2的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽 CecropinB2 的方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的殺傷作用，尤其是對(duì)某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視。隨著生物科技不斷發(fā)展，抗菌肽作為新型抗生素及新型藥物，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。至今為止，已從自然生物中分離得到上千種抗菌肽，其中ceCTopins類(lèi)抗菌肽是目前研究最清楚、效果最顯著的抗菌肽，已發(fā)現(xiàn)有A、B、C、D、E五種結(jié)構(gòu)，這類(lèi)抗菌肽還具有耐酸，耐熱，耐堿以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)， 在微生物，動(dòng)植物方面有廣泛應(yīng)用。
近年來(lái)，Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)得到廣泛應(yīng)用，該系統(tǒng)根據(jù)F因子載體的原理，改變了傳統(tǒng)的昆蟲(chóng)重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，構(gòu)建一種新桿狀病毒穿梭載體Bacmid， 該系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì)(1)重組率有顯著提高，幾乎可達(dá)100% (2)通過(guò)藍(lán)白斑篩選重組病毒有篩選優(yōu)勢(shì)，不會(huì)產(chǎn)生野生型和非重組型病毒污染的問(wèn)題，也不再需要傳統(tǒng)繁瑣的空斑篩選分析來(lái)純化重組病毒(3)大大地縮短了重組病毒構(gòu)建所需要的時(shí)間，可以由原來(lái)的4-6 周或更長(zhǎng)減少到僅7-10天。因此，該技術(shù)可以快速、同時(shí)產(chǎn)生多種重組病毒。這是一種最快速簡(jiǎn)捷地生產(chǎn)重組病毒的方法。
隨著抗生素的大量廣泛用于飼料中和人們對(duì)食品和環(huán)境質(zhì)量的要求越來(lái)越高，人們對(duì)抗生素的副作用認(rèn)識(shí)日益加深，而抗菌肽具廣譜抗菌作用，對(duì)畜禽具促生長(zhǎng)、保健和治療疾病的功能，屬無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)致細(xì)菌耐藥性的一類(lèi)環(huán)保型制劑?？蓱?yīng)用生物工程的技術(shù)方法生產(chǎn)抗病菌的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物產(chǎn)品，同時(shí)可以通過(guò)基因工程的技術(shù)方法大量的表達(dá)抗菌肽，使之成為新一代肽類(lèi)抗菌藥的來(lái)源，具有出廣闊的應(yīng)用前景。
利用家蠶桿狀病毒作為表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)用最多的是將外源目的基因替代polh基因，利用Pph帶動(dòng)目的基因高效表達(dá)。產(chǎn)生的重組病毒由于沒(méi)有多角體蛋白外殼的保護(hù)，只能通過(guò)皮下注射的方式接種家蠶，導(dǎo)致效率低下，因此可利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建可同時(shí)表達(dá)polh基因和BmCecB2基因的表達(dá)載體，獲得的重組病毒，可經(jīng)口接種家蠶，在家蠶體中表達(dá)抗菌肽，此方法與人工皮下注射家蠶相比，其優(yōu)點(diǎn)省時(shí)省力，提高了生產(chǎn)效率，有利于規(guī)?；a(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽CecropinB2的方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽Cecr0pinB2的方法， 步驟包括
將如序列表所示BmCecB2基因及polh基因分別克隆到啟動(dòng)子表達(dá)載體以構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體；將重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒， 獲得重組穿梭載體Bacmid ；Bacmid在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞,獲得重組病毒多角體；重組病毒多角體定量后以經(jīng)口接種五齡家蠶幼蟲(chóng)的方式，在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)， 獲得具有抑菌活性的抗菌肽。
進(jìn)一步地，上述雙啟動(dòng)子表達(dá)載體為pFastBacDUAL。
進(jìn)一步地，上述BmCecB2基因及polh基因分別插入雙啟動(dòng)子表達(dá)載體 pFastBacDUAL的PplO和Pph的MCS的下游處構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體。
進(jìn)一步地,上述重組穿梭載體Bacmid是通過(guò)將mini_Tn7轉(zhuǎn)座子從雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)位到穿梭載體Bacmid上mini_attTn7祀位點(diǎn),得到Gen抗性,再通過(guò)通過(guò)涂布于含有Kan，Gen, Tet, IPTG，X-gal的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取獲得的。
進(jìn)一步地，上述在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)是指重組Bacmid及脂質(zhì)體，分別加入無(wú)血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基，將兩種溶液混勻，室溫靜置，另取生長(zhǎng)良好的Bm細(xì)胞，加入無(wú)血清的 Bm細(xì)胞培養(yǎng)基及重組Bacmid/脂質(zhì)體復(fù)合物，培養(yǎng)一段時(shí)間，吸掉上清,加入含有10%血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察。
進(jìn)一步地，上述定量的重組病毒多角體的濃度為2X107NPB/ml。
進(jìn)一步地，上述重組病毒多角體的添食量為每頭蠶7 μ I。
本發(fā)明的有益效果
利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體，在家蠶Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中獲得的重組病毒，可經(jīng)口添食家蠶，使家蠶抗菌肽Cecropin B基因在家蠶體中表達(dá)，與人工注射家蠶相比，省時(shí)省力，提高了生產(chǎn)效率。由于桿狀病毒宿主域僅限于家蠶，不會(huì)感染其他動(dòng)物，因此，高效表達(dá)抗菌肽后，可以將蠶體磨粉后添加到飼料中，無(wú)需純化，作為飼料添加劑，有望成為替代抗生素的產(chǎn)品之一，具有很好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽Cecr0pinB2 的方法的流程示意圖2為重組雙啟動(dòng)子pFastBac Dual表達(dá)載體的示意圖3為BmCecB2基因及polh基因表達(dá)產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)示意圖；其中M為蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)，Γ2分別為正常家蠶第六天和第七天的血液，3 4分別為經(jīng)口添食重組病毒的家蠶第六天和第七天的血液，5飛分別為經(jīng)口舔食野生型桿狀病毒的家蠶第六天和第七天的血液，箭頭所指為目的條帶；
圖4為BmCecB2抑菌活性檢測(cè)示意圖2分別為添食重組病毒的家蠶第六天和第七天的血液,3為添食野生型病毒的家蠶血液，4為正常家蠶的血液，5表示Amp，6表示無(wú)菌水。
具體實(shí)施方式
下面根據(jù)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明的整體的方法流程如圖1所示。
實(shí)施例1
(I)構(gòu)建雙啟動(dòng)子表達(dá)載體分別以合成好的PET-32a-BmCecB2和野生型病毒株基因組DNA為模板，合成BmCecB2基因及polh基因，分別插入到雙啟動(dòng)子表達(dá)載體 pFastBacDUAL的PplO和Pph的MCS的下游,設(shè)計(jì)合成引物如下
CecB-F (5，-CATGCCATGGCGCCGGAACCGCGTTGGAAA-3，)
CecB-R(5’ ~CGGGGTACCTCATTATTTACCGATGGCTTTCG~3，)
Polh-F (5，~CGCGGATCCATGCCGAATTATTCATACA~3，)，
Polh-R(5’-CCCAAGCTTTTAATACGCCGGACCAGTGAACAG-3，)
插入的酶切位點(diǎn)為，BmCecB2(Nco Ι/Κρη I), polh (BamH I/Hind III)
(2)重組穿梭載體Bacmid :用上述雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞， 將已構(gòu)建好的重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E. coli DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中，37°C振蕩培養(yǎng) 4h,重組穿梭載體Bacmid是通過(guò)將mini_Tn7轉(zhuǎn)座子從雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)位到穿梭載體 Bacmid上min1-attTn7祀位點(diǎn)而產(chǎn)生的，并且得到了 Gen抗性。通過(guò)涂布于含有Kan,Gen, Tet, IPTG，X-gal的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選白斑過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取重組穿梭載體Bacmid,用M13引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。重組雙啟動(dòng)子pFastBac Dual表達(dá)載體如圖2所示。
注PCR反應(yīng)體系(25 μ L 反應(yīng)體系)10 X Taq Buffer 2. 5 μ I, dNTPs1. 5 μ 1，混合引物(M13F+M13R) I μ I, Taq polymerase 0. 2 μ I, ddH20 up to25 μ I,模板(rBacmid) I μ I。
PCR 擴(kuò)增條件93°C預(yù)變性 3min，94°C變性 45s，55°C 復(fù)性 45s，72°C延伸 4min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。
(3)獲得重組病毒
取重組穿梭載體Bacmid(7 10 μ g)及脂質(zhì)體8 μ I,并分別加入無(wú)血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至100 μ 1，將兩種溶液混勻，室溫靜置20min，另取生長(zhǎng)良好的Bm細(xì)胞，用無(wú)血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基洗2 3次，再加入800 μ I無(wú)血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基及準(zhǔn)備好的重組 Bacmid/脂質(zhì)體復(fù)合物200 μ 1，28°C培養(yǎng)3 5h后，吸掉上清，加入2ml含有10%血清的Bm 細(xì)胞培養(yǎng)基，28°C繼續(xù)培養(yǎng)60h后，在顯微鏡下觀察Bm細(xì)胞是否有感染的癥狀，吸取細(xì)胞上清，獲得重組病毒粒子，復(fù)感家蠶細(xì)胞，獲得重組病毒。
(4)家蠶抗菌肽Cecropin B2在家蠶體中表達(dá)
將重組病毒液定量至2X 107NPB/ml并準(zhǔn)備五齡第一天的家蠶幼蟲(chóng)，第一區(qū)經(jīng)口添食重組病毒液，每頭蠶添食7 μ 1，分別以相同濃度的野生型桿狀病毒和飼水區(qū)作為對(duì)照。每天觀察家蠶的感染情況，并分別在第6天，第7天后收集蠶血，純化多角體，并從中抽提病毒 DNA，PCR 驗(yàn)證(引物為 CecB-F/CecB-R)。
實(shí)施例2
家蠶抗菌肽Tricine-SDS-PAGE 鑒定
樣品處理取感染的家蠶血液,放入100°C煮 沸5min, IlOOOrpm離心5min,上清加 2X上樣緩沖液(4%SDS，12%甘油，50mM Tris, 2%巰基乙醇，O. 01%溴酚藍(lán)，6M Hcl調(diào)PH調(diào)到6. 8)，煮沸5分鐘。
Tricine-SDS-PAGE :制備15%濃度的分離膠(尿素)，10%濃度的中間膠及4%的濃縮膠；樣品處理后上樣電泳，固定液(50%甲醇，10%醋酸)固定30min，考馬斯亮藍(lán)染色lOmin， 再用脫色液脫色。
Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，其中polh蛋白的分子量為29KD， BmCecB2分子量為4.9KD。分析結(jié)果說(shuō)明多角體與家蠶抗菌肽cecropin B均得到了表達(dá)。
實(shí)施例3
家蠶抗菌肽Cecropin B抑菌活性檢測(cè)
取家蠶血液，經(jīng)超聲破碎細(xì)胞后離心取上清，進(jìn)行瓊脂糖孔穴擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。將大腸桿菌懸浮液(0D_=0. 3) 400 μ 1，與55°C的LB固體培養(yǎng)基IOOmL混勻后鋪平板待其凝固后，用滅過(guò)菌的打孔器(直徑5mm)打孔，孔中滴加200ul待測(cè)的表達(dá)上清，37°C培養(yǎng)16h，以同體積的滅菌水為陰性對(duì)照，Amp為陽(yáng)性對(duì)照，第2天測(cè)量抑菌直徑。根據(jù)抑菌圈的大小判定抗菌肽的活性。
活性檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明家蠶 抗菌肽cecropin B基因在家蠶體內(nèi)得到表達(dá)，有明顯的抑菌活性，抑菌直徑為10_，以Amp (100mg/ml)和無(wú)菌水作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)加樣正常家蠶的血液和添食野生型病毒的家蠶血液排除本底水平表達(dá)。
上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽Cecr0pinB2的方法，其特征在于，步驟包括將如序列表所示BmCecB2基因及polh基因分別克隆到啟動(dòng)子表達(dá)載體以構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體；將重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，獲得重組穿梭載體Bacmid ；Bacmid在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞,獲得重組病毒多角體；重組病毒多角體定量后以經(jīng)口接種五齡家蠶幼蟲(chóng)的方式，在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)，獲得具有抑菌活性的抗菌肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽CecropinB2的方法,其特征在于,所述雙啟動(dòng)子表達(dá)載體為pFastBacDUAL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽CecropinB2的方法，其特征在于，所述BmCecB2基因及polh基因分別插入雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pFastBacDUAL的Pp 10和Pph的MCS的下游處構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽CecropinB2的方法,其特征在于,所述重組穿梭載體Bacmid是通過(guò)將mini_Tn7轉(zhuǎn)座子從雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)位到穿梭載體Bacmid上mini_attTn7祀位點(diǎn),得到Gen抗性,再通過(guò)通過(guò)涂布于含有Kan，Gen, Tet, IPTG，X-gal的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取獲得的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽CecropinB2的方法,其特征在于,所述在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)是指重組Bacmid及脂質(zhì)體,分別加入無(wú)血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基，將兩種溶液混勻，室溫靜置，另取生長(zhǎng)良好的Bm細(xì)胞，加入無(wú)血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基及重組Bacmid/脂質(zhì)體復(fù)合物，培養(yǎng)一段時(shí)間，吸掉上清,加入含有10%血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽CecropinB2的方法，其特征在于，所述定量的重組病毒多角體的濃度為2X107NPB/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽CecropinB2的方法，其特征在于，所述重組病毒多角體的添食量為每頭蠶7 μ I。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)家蠶抗菌肽CecropinB2的方法。步驟包括將BmCecB2基因及polh基因分別克隆到啟動(dòng)子表達(dá)載體以構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體；將重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，獲得重組穿梭載體Bacmid；Bacmid在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，獲得重組病毒多角體；重組病毒多角體定量后以經(jīng)口接種五齡家蠶幼蟲(chóng)的方式，在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)，獲得具有抑菌活性的抗菌肽本發(fā)明的有益效果在于經(jīng)口添食家蠶，使家蠶抗菌肽Cecropin B基因在家蠶體中表達(dá)，與人工注射家蠶相比，省時(shí)省力，提高了生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12N15/866GK102994551SQ201210504848
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者徐家萍, 李昕琦, 杜暢, 王文兵, 高娟, 王成林 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)