專利名稱：一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝紊亂的常見多發(fā)慢性病，臨床癥狀主表現(xiàn)為高血糖。隨著社會經(jīng)濟(jì)條件的改善和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來糖尿病的患病率大幅度增長，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)上一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，給國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了很大的影響。目前臨床上用于治療糖尿病的藥劑主要有胰島素類、磺酰脲類、雙胍類及α -糖苷酶抑制劑類這幾類，胰島素類、磺酰脲類、雙胍類藥物會引起肝損傷、血糖過低、水腫等，副作用較大，α -糖苷酶抑制劑為當(dāng)前開發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域。1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)是一種α-糖苷酶抑制劑，可竟?fàn)幮缘嘏cα-糖苷酶結(jié)合，以阻害α-糖苷酶對二糖的水解，使二糖不能被水解成單糖進(jìn)入血液內(nèi)，而被直接送入大腸排泄，從而起到了有效降血糖的作用，是當(dāng)前糖尿病治療藥物開發(fā)的一個(gè)嶄新領(lǐng)域。國外學(xué) 者對DNJ進(jìn)行了大量的研究，人工化學(xué)合成出了許多衍生物，其中N-羥乙基-1-DNJ被開發(fā)成了治療糖尿病的新藥一格列米醇(也叫格列本醇)，于1998年用于臨床。但DNJ分子中具有多個(gè)(4個(gè))手性中心，與其相關(guān)的立體異構(gòu)體多達(dá)15種以上，人工化學(xué)合成的其衍生物在藥理藥效與毒副作用上與天然DNJ存在較大的差異，不能滿足當(dāng)今社會的高水平需求。家蠶是當(dāng)今地球上室內(nèi)飼養(yǎng)量最大的經(jīng)濟(jì)資源昆蟲，不僅資源豐富，而且活性物質(zhì)與營養(yǎng)成分充足，很適宜作為高效、安全生物反應(yīng)器用于開發(fā)生產(chǎn)附價(jià)值高、發(fā)展前景廣闊的活性藥物。家蠶幼蟲體具有高效合成與富集DNJ的特性，不僅DNJ含量高，而且降血糖效果顯著，可用于糖尿病治療藥物和保健食品的開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法，是用
9-芴基氯甲酸甲酯(FMOC-Cl)標(biāo)記DNJ，在配有熒光檢測器的反相高效液相色譜檢測，建立精確、穩(wěn)定的家蠶幼蟲體DNJ含量檢測方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
1)家蠶幼蟲于-50°c下真空干燥36h，于-15°c下超微粉碎10 15 min，過80 100目篩，得到家蠶幼蟲粉；
2)取家蠶幼蟲體粉，按重量體積比為1:70(Γ800比例，加入0.05 mol/L HC1，常溫下渦流15 20 s并超聲波處理20 30 min后，用21690 g離心20 min，收集上清液，沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液；
3)取10UL供試液，與10 μ L 0.4 mol/L、pH8.5的硼酸鉀緩沖液混和，加入20 μ L5 mmol/L FM0C-C1液，混勻并在20°C水浴鍋中反應(yīng)20 25 min，加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC-Cl來終止反應(yīng)； 4)反應(yīng)液用950μ L質(zhì)量百分比為0.1%醋酸液稀釋，生成的DNJ-FMOC，并用孔徑0.2μ m尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液；
5)將10μ L測定液用進(jìn)樣器注入色譜柱為DIAMONSIC C18柱的Waters 600高效液相色譜儀，以體積比為1:1的乙腈-0.1%醋酸為流動相，按1.0 mL/min流速在常溫下洗脫；
6)用激發(fā)光254nm、發(fā)射光322 nm的Waters 474熒光檢測器檢測洗脫曲線，根據(jù)DNJ-FMOC色譜峰面積按回歸方程Y=0.0002X+ 2.9815計(jì)算出1-脫氧野尻霉素含量。本發(fā)明具有的有益效果是:
本發(fā)明建立的家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量測定方法，精密度、重現(xiàn)性與加樣回收率高，穩(wěn)定地好，可用于大數(shù)量家蠶幼蟲制品中DNJ含量的檢測，這對于推進(jìn)家蠶幼蟲體的藥用開發(fā)，具有積極的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:
取家蠶幼蟲體粉，按1:700 (ff:V)比例，加入0.05 mol/L HC1，常溫下渦流15 s并超聲波處理30 min后,用21690 g離心20 min,收集上清液,沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液。取10 μ L供試液，與10 UL 0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液(pH8.5)混和，加入20 uL 5 mmol/L FMOC-Cl液，迅速混勻并在20°C水浴鍋中反應(yīng)20 min,加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FM0C-C1來終止反應(yīng)。反應(yīng)液用950 μ L 0.1%(V/V)醋酸液稀釋，以穩(wěn)定生成的DNJ-FM0C，并用孔徑0.2 μ m尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液。將10 UL測定液用進(jìn)樣器注入色譜柱為DIAMONSIC C18柱(250 X 4.60 mm, ID)的Waters 600高效液相色譜儀，以乙腈-0.1%醋酸(1:1，V/V)為流動相，按1.0 mL/min流速在常溫下洗脫。用Waters 474熒光檢測器(激發(fā)光254 nm，發(fā)射光322 nm)檢測洗脫曲線，DNJ與FMOC-CI絡(luò)合成的DNJ-FMOC得到很好的分離，根據(jù)DNJ-FMOC色譜峰面積按標(biāo)樣的回歸方程計(jì)算出DNJ含量為0.523%，精密度試驗(yàn)的RSD = 0.6%，穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD =
1.59%，重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD = 6.78%，平均加樣回收率為104.5% (RSD=4.64%)。試驗(yàn)6批次均得到相同的結(jié)果。實(shí)施例2:
取家蠶幼蟲體粉，按1:800 (W:V)比例，加入0.05 mol/L HC1，常溫下渦流20 s并超聲波處理25 min后,用21690 g離心20 min,收集上清液,沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液。取10 μ L供試液，與10 UL 0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液(pH8.5)混和，加入20 uL 5 mmol/L FM0C-C1液，迅速混勻并在20°C水浴鍋中反應(yīng)25 min,加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FM0C-C1來終止反應(yīng)。反應(yīng)液用950 μ L 0.1%(V/V)醋酸液稀釋，以穩(wěn)定生成的DNJ-FM0C，并用孔徑0.2 μ m尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液。將10 μ L測定液用進(jìn)樣器注入色譜柱為DIAMONSIC C18柱(250 X 4.60 mm，ID)的Waters 600高效液相色譜儀，以乙腈-0.1%醋酸(1: 1，V/V)為流動相，按1.0 mL/min流速在常溫下洗脫。用Waters 474熒光檢測器(激發(fā)光254 nm，發(fā)射光322 nm)檢測洗脫曲線，DNJ與FMOC-CI絡(luò)合成的DNJ-FMOC得到很好的分離，根據(jù)DNJ-FMOC色譜峰面積按標(biāo)樣的回歸方程計(jì)算出DNJ含量為0.525%，精密度試驗(yàn)的RSD = 0.56%，穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD =1.41%，重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD = 5.78%，平均加樣回收率為101.2% (RSD=3.12%)。試驗(yàn)7批次均得到相同的結(jié)果。實(shí)施例3:
取家蠶幼蟲體粉，按1:750 (ff:V)比例，加入0.05 mol/L HC1，常溫下渦流18 s并超聲波處理20 min后,用21690 g離心20 min,收集上清液,沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液。取10 μ L供試液，與10 UL 0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液(pH8.5)混和，加入20 uL 5 mmol/L FMOC-Cl液，迅速混勻并在20°C水浴鍋中反應(yīng)23 min,加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC-Cl來終止反應(yīng)。反應(yīng)液用950 μ L 0.1%(V/V)醋酸液稀釋，以穩(wěn)定生成的DNJ-FM0C，并用孔徑0.2 μ m尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液。將10 4 1測定液用進(jìn)樣器注入色譜柱為0^^0吧1(:(:18柱(250\4.60臟，ID)的Waters 600高效液相色譜儀，以乙腈-0.1%醋酸(1: 1，V/V)為流動相，按1.0 mL/min流速在常溫下洗脫。用Wat ers 474熒光檢測器(激發(fā)光254 nm，發(fā)射光322 nm)檢測洗脫曲線，DNJ與FMOC-CI絡(luò)合成的DNJ-FMOC得到很好的分離，根據(jù)DNJ-FMOC色譜峰面積按標(biāo)樣的回歸方程計(jì)算出DNJ含量為0.524%，精密度試驗(yàn)的RSD = 0.72%，穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD =
1.33%，重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD = 4.58%，平均加樣回收率為102.1% (RSD=2.21%)。試驗(yàn)7批次均得到相同的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法，其特征在于: .1)家蠶幼蟲于-50°c下真空干燥36h，于-15°c下超微粉碎10 15 min，過80 100目篩，得到家蠶幼蟲粉； .2)取家蠶幼蟲體粉，按重量體積比為1:70(Γ800比例，加入0.05 mo I/L HC1，常溫下渦流15 20 s并超聲波處理20 30 min后，用21690 g離心20 min，收集上清液，沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液； .3)取10UL供試液，與10 μ L 0.4 mol/L、pH8.5的硼酸鉀緩沖液混和，加入20 μ L.5 mmol/L FM0C-C1液，混勻并在20°C水浴鍋中反應(yīng)20 25 min，加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC-Cl來終止反應(yīng)； .4)反應(yīng)液用950μ L質(zhì)量百分比為0.1%醋酸液稀釋，生成的DNJ-FM0C，并用孔徑0.2μ m尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液； .5)將10μ L測定液用進(jìn)樣器注入 色譜柱為DIAMONSIC C18柱的Waters 600高效液相色譜儀，以體積比為1:1的乙腈-0.1%醋酸為流動相，按1.0 mL/min流速在常溫下洗脫； .6)用激發(fā)光254nm、發(fā)射光322 nm的Waters 474熒光檢測器檢測洗脫曲線，根據(jù)DNJ-FMOC色譜峰面積按回歸方程 Y=0.0002X+ 2.9815計(jì)算出1-脫氧野尻霉素含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法。以0.05mol/LHCl為溶劑，在室溫下經(jīng)渦流15~20s并超聲波處理20~30min的步驟抽提2次，從家蠶幼蟲體中有效提取出DNJ。用5mmol/L9-芴基氯甲酸甲酯(FMOC-Cl)在20℃下標(biāo)記DNJ20~25min，形成具有熒光性的DNJ-FMOC絡(luò)合物，用配有熒光檢測器的反相高效液相色譜檢測，根據(jù)峰面積計(jì)算出DNJ含量。本發(fā)明建立的家蠶幼蟲體DNJ含量測定方法，精密度、重現(xiàn)性與加樣回收率高，穩(wěn)定地好，可用于大數(shù)量家蠶幼蟲制品中DNJ含量的檢測，對于推進(jìn)家蠶幼蟲體的藥用開發(fā)具有積極的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號G01N30/02GK103091421SQ20131001538
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者時(shí)連根, 張作法, 劉淑梅, 金衛(wèi)明, 費(fèi)建明, 李玉峰, 趙麗華, 施國方, 黃秀娣 申請人:浙江大學(xué), 湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院