專利名稱：大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取方法和專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取方法和專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種來源于中胚層和外胚層的多潛能干細(xì)胞，按照發(fā)育過程分類屬于成體干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞一樣具有自我更新的能力，同時(shí)并具有向多 個(gè)胚層分化潛能，在特定誘導(dǎo)條件下能分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肝細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞存在于多種組織中，目前已經(jīng)從骨髓、月旨肪、肌肉等組織中成功獲得了間充質(zhì)干細(xì)胞。2001年，祖克(Zuk)從病人抽脂手術(shù)中的脂肪液中提取了一種具有自我更新和分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，這類干細(xì)胞被命名為脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)。脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞具有以下特點(diǎn):(1)增殖能力強(qiáng):體外培養(yǎng)第5代后可擴(kuò)增100倍，且無明顯衰老跡象。(2)免疫原性低:脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞在用于干細(xì)胞移植時(shí)，由于自體脂肪組織含量較高，所以多用于自體移植，所以其具有較低的免疫原性。(3)致腫瘤風(fēng)險(xiǎn)低:脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞具有穩(wěn)定的端粒酶活性，在維持其增殖性的同時(shí)不具有致腫瘤性。近年來研究表明，ADSC細(xì)胞由于脂肪組織具有取材方便和干細(xì)胞含量較高等優(yōu)勢，同時(shí)在分化性能上，和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞基本相同，因此在干細(xì)胞進(jìn)行受損的組織或器官的修復(fù)上具有廣闊的應(yīng)用前景。但是在脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞在從實(shí)驗(yàn)室走上臨床應(yīng)用，要面臨干細(xì)胞的來源的不同會(huì)導(dǎo)致其自我更新以及分化能力的不同，因此尋找和對比多種脂肪來源可以豐富脂肪干細(xì)胞的組織來源。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題:鑒于現(xiàn)有的動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)部位具有脂肪組織，因此本發(fā)明提出了一種從大鼠大網(wǎng)膜脂肪提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，同時(shí)提供一種能提取和長期維持大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源帶間充質(zhì)干細(xì)胞活性的提取和培養(yǎng)液。使用本發(fā)明提取和培養(yǎng)的大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞在傳至10代后仍能維持干細(xì)胞的活性，保持干細(xì)胞的較高的增殖能力和多個(gè)胚層方向分化潛能。技術(shù)方案:為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取方法，該方法包括如下步驟:步驟1:無菌條件下取健康斯?jié)娎鄹?多雷(SD)大鼠的大網(wǎng)膜脂肪，剪碎成l_3mm3的小塊；步驟2:用冰磷酸鹽緩沖液混合后離心，去除部分脂肪組織；步驟3:1型和II混合膠原酶消化離心，去除上部脂肪細(xì)胞組織；步驟4:再次離心后用加入含有特定生長因子的培養(yǎng)基重懸后移入培養(yǎng)瓶中；
步驟5:培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中持續(xù)傳代培養(yǎng)。優(yōu)選的,步驟I中，剪碎至l-3mm3。優(yōu)選的，步驟2中，用4°C的磷酸鹽緩沖液混合剪碎的脂肪組織后低速離心。優(yōu)選的，步驟3中，使用混合的I型和II型膠原酶消化，I型和II型膠原酶比例為1:1，混和膠原酶和磷酸鹽緩沖液的總體積分?jǐn)?shù)比為1:1000，每克脂肪組織使用3ml膠原酶-磷酸鹽緩沖液消化，水浴消化時(shí)間為I小時(shí)，消化時(shí)水浴溫度為37°C。本發(fā)明還提供了一種用于大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基:該培養(yǎng)基包括低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、胎牛血清、胰島素、大鼠重組成纖維生長因子、大鼠表皮生長因子、甲狀腺原氨酸。優(yōu)選的，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾的培養(yǎng)基百分比位94%、，添加胎牛血清的體積百分比為5%、抗生素體積百分比為1%、胰島素lOug/ml、大鼠重組成纖維生長因子5ng/ml、大鼠表皮生長因子5ng/ml、甲狀腺原氨酸10ng/ml。有益效果:本發(fā)明提供的提取和培養(yǎng)方法能快速獲得大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞，并且能長時(shí)間維持干細(xì)胞的增殖和分化能力，在傳代至第10代后獲得的細(xì)胞仍然具有干細(xì)胞活性。


圖1a為原代細(xì)胞第10天時(shí)細(xì)胞在明場下細(xì)胞形態(tài)，圖1b為細(xì)胞培養(yǎng)第10代時(shí)干細(xì)胞在明場下細(xì)胞形態(tài)；圖2a為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白⑶29流式細(xì)胞儀檢測陽性結(jié)果；圖2b為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白⑶44流式細(xì)胞儀檢測陽性結(jié)果；圖2c為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白⑶73流式細(xì)胞儀檢測陽性結(jié)果；圖2d為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白⑶106流式細(xì)胞儀檢測陽性結(jié)果；圖2e為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白⑶Ilb流式細(xì)胞儀檢測陰性結(jié)果；圖2f為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD31流式細(xì)胞儀檢測陰性結(jié)果；圖2g為干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD45流式細(xì)胞儀檢測陰性結(jié)果；圖3a為向骨細(xì)胞分化的ALP染色檢測；圖3b為向脂肪細(xì)胞分化的明場顯微鏡檢測；圖3c為向神經(jīng)細(xì)胞分化的明場顯微鏡檢測。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。本發(fā)明提供的一種分離提取人的皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟:步驟1:取健康，體重大概為100_130g的斯?jié)娎鄹?多雷(SD)大鼠，麻醉后無菌環(huán)境下從大鼠腹部側(cè)面開3cm的切口，取大網(wǎng)膜脂肪。用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗脂肪組織數(shù)次，剪碎至1-3_3左右的小塊。步驟2:加入PBS重懸，800rmp離心5分鐘去除部分脂肪組織。步驟3:用I型和II膠原酶混合物消化、離心；
步驟5:消化I小時(shí)后800rmp離心5分鐘去除上部脂肪細(xì)胞組織，加入PBS重懸，800rmp離心5分鐘。步驟6:用培養(yǎng)液重懸沉淀后，用孔徑為IOOum的無菌尼龍網(wǎng)過濾后計(jì)數(shù)，按照濃度為IO5個(gè)細(xì)胞每ml將過濾后單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱溫度為37°C、CO2濃度為5%、濕度為95%條件下培養(yǎng)7-10天。步驟7:干細(xì)胞克隆出現(xiàn)后，細(xì)胞按常規(guī)方法消化傳代培養(yǎng)。步驟2中，用4°C的冰磷酸鹽緩沖液混合切碎的脂肪組織后低速離心步驟3中，加入的混合物為質(zhì)量比為1:1的I型膠原酶和II型膠原酶以及PBS混合物，水浴消化0.5-2h，每克脂肪組織加入3ml膠原酶和PBS混合物，消化過程中間斷振蕩混勻組織塊以促進(jìn)消化，水浴消化時(shí)溫度為37°C本發(fā)明提供的一種大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基和添加成分組成:包括低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、胎牛血清的、抗生素(青霉素和鏈霉素)、胰島素、大鼠重組成纖維生長因子、大鼠表皮生長因子、甲狀腺原氨酸。具體成分配比為低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基體積百分比位94%、添加胎牛血清的體積百分比為5%、抗生素(青霉素和鏈霉素)體積百分比為1%、胰島素濃度為lOug/ml、大鼠重組成纖維生長因子濃度為5ng/ml、大鼠表皮生長因子濃度為5ng/ml、甲狀腺原氨酸濃度為10ng/ml。實(shí)施例1大鼠大網(wǎng)膜提取脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞和使用專用培養(yǎng)基，包括以下步驟大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的專用培養(yǎng)基配制:在470ml低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基中加入25ml胎牛血清、抗生素(青霉素和鏈霉素)5ml、胰島素5mg、大鼠重組成纖維生長因子2.5ug、大鼠表皮`生長因子2.5ug、甲狀腺原氨酸5ug，0.22 u m濾器過濾除菌，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩４笫蟠缶W(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞提取與培養(yǎng)步驟:1、取健康、體重為100g_130g大鼠,麻醉后側(cè)放置無菌手術(shù)臺中,用無菌手術(shù)刀從大鼠腹部側(cè)面剖開，取大網(wǎng)膜脂肪，質(zhì)量大概為3g，放入預(yù)冷的PBS中，縫合創(chuàng)口。然后用PBS清洗數(shù)次洗掉殘留血液，剪碎至Imm3左右的小塊；2、加入PBS清洗，800rmp離心5分鐘去除上側(cè)大塊脂肪組織；3、加入IOml I型膠原酶和II膠原酶混合物，密封EP管后放入37°C水浴消化lh，消化過程中每10分鐘振蕩組織塊以促進(jìn)消化；4、消化完成后800rmp離心5分鐘去除懸浮大塊脂肪組織，加入PBS清洗，800rmp離心5分鐘一次；5、用含有自制培養(yǎng)基重懸后，用孔徑為IOOum的無菌尼龍網(wǎng)過濾，將過濾后的單細(xì)胞溶液計(jì)數(shù)，按照濃度為105/ml將過濾液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)；6、24h后，半量換液，48h后全量換液，第四天全量換液，觀察細(xì)胞生長情況，一般10天后細(xì)胞成克隆生長，用0.25%的胰酶消化后，按照1:3的比例傳代。圖1:大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞純度較高，成克隆生長，在PlO代時(shí)，細(xì)胞純度依然較高，且細(xì)胞活力以及分化能力依然較高。
實(shí)施例2:三代大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原的鑒定。免疫表型檢測:1、取第3代細(xì)胞分別用0.25%的胰酶消化后移入1.5ml離心管，800rmp離心5分
鐘去除上清；2、每管加入Iml PBS重懸，800rmp離心5分鐘去除上清；3、加入PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為I X IO6個(gè)/ml ；4、將細(xì)胞懸液分為每管500 iU，選其中一管作為流式對照組；5、按組分別加入流式抗體，4°C避光孵育30分鐘；6、800rmp離心5分鐘去除上清；7、加入Iml PBS重懸，800rmp離心5分鐘去除上清；8、加入500 U I PBS重懸細(xì)胞；9、流式細(xì)胞儀檢測樣品。圖2:經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，使用本發(fā)明方法培養(yǎng)的大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞均高表達(dá)⑶29、⑶44、⑶73，⑶106而⑶lib、⑶31、⑶45、呈陰性，表明經(jīng)培養(yǎng)第10代后細(xì)胞仍表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志抗原，細(xì)胞仍保持干細(xì)胞特征。大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨，成脂肪，成神經(jīng)誘導(dǎo)分化試驗(yàn)。提取的大鼠大網(wǎng)膜脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞分化能力檢測:1、大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化能力檢測。步驟為:正常培養(yǎng)后換成骨誘導(dǎo)液(低糖DMEM培養(yǎng)液，5%胎牛血清，1%雙抗，5nM地塞米松，5nM維生素D3，5mM P -甘油磷酸鈉，25 u M抗壞血酸及300mg/L L-谷氨酰胺)，此后每3天換液I次，連續(xù)換液誘導(dǎo)15天。采用堿性磷酸酶檢測細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化情況。步驟為:用PBS清洗細(xì)胞一次，后浸泡在4% (w/v)的多聚甲醒溶液中室溫下固定30分鐘。然后再用PBS漂洗一遍,浸泡在BCIP/NBT溶液中于室溫下避光染色30分鐘，最后用超純水漂洗2遍除去殘余溶液，放在倒置顯微鏡(Nikon T1-S)下觀察。2、大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化能力檢測。步驟為:正常培養(yǎng)后換成脂誘導(dǎo)液(低糖DMEM培養(yǎng)液，10%胎牛血清，1%雙抗，IM地塞米松，I Oumo I/ml胰島素，0.5mM IBMX及200uM吲哚美辛)，以后每3天換液I次，連續(xù)換液誘導(dǎo)15天。采用油紅0染色鑒定細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化情況。步驟為:用PBS清洗細(xì)胞一次，接著用4%多聚甲醛于4°C固定30分鐘。固定后，用油紅0對進(jìn)行染色。油紅0溶于乙醇配成
0.5%的儲(chǔ)存液,使用前用超純水以2:3體積比稀釋。樣品與室溫下在油紅0溶液中染色15分鐘后用超純水洗3遍，去掉殘余染液。放在倒置顯微鏡(Nikon T1-S)下觀察。3、大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化能力檢測。步驟為:正常培養(yǎng)后換成神經(jīng)誘導(dǎo)液(低糖DMEM培養(yǎng)液，10%胎牛血清，1%雙抗，2ug/ml全反式維甲酸RA)放在倒置顯微鏡(Nikon Ti_S)下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。圖3表示在不同誘導(dǎo)劑下，干細(xì)胞向骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞分化檢測情況。以上實(shí)例說明本技術(shù)提取的大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為一種干細(xì)胞的來源， 這一發(fā)明能有效的豐富脂肪來源干細(xì)胞的種類，為干細(xì)胞的近一步的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以上述實(shí)施方式為限，但凡本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所揭示內(nèi)容所作的等效修飾或變化，皆應(yīng)納入權(quán)利要求書中記 載的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 步驟1:無菌條件下取健康康斯?jié)娎鄹?多雷大鼠的大網(wǎng)膜脂肪，剪碎成l_3mm3的小塊； 步驟2:用冰磷酸鹽緩沖液混合后低速離心，去除部分脂肪組織； 步驟3:1型和II混合膠原酶消化離心，去除脂肪細(xì)胞組織； 步驟4:再次離心后用加入專用培養(yǎng)基重懸后移入培養(yǎng)瓶中； 步驟5:培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中持續(xù)傳代培養(yǎng)，干細(xì)胞成克隆生長后傳代持續(xù)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取方法，其特征在于:步驟2中，用4°C的磷酸鹽緩沖液混合剪碎的脂肪組織后低速離心。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取方法，其特征在于:步驟3中，使用混合的I型和II型膠原酶消化，I型和II型膠原酶比例為1:1，混和膠原酶和磷酸鹽緩沖液的總體積分?jǐn)?shù)比為1: 1000，每克脂肪組織使用3ml膠原酶-磷酸鹽緩沖液消化，水浴消化時(shí)間為I小時(shí)，消化時(shí)水浴溫度為37°C。
4.一種用于大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取的培養(yǎng)基，其特征在于:該培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、胎牛血清、胰島素、大鼠重組成纖維生長因子、大鼠表皮生長因子、甲狀腺原氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于大鼠大網(wǎng)膜脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取的培養(yǎng)基，其特征在于:基礎(chǔ)培養(yǎng)基為低糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾的培養(yǎng)基體積百分比位94%、，添加胎牛血清的體積百分比為5%、抗生素體積百分比為1%、胰島素lOug/ml、大鼠重組成纖維生長因子5ng/ml、大鼠表皮 生長因子5ng/ml、甲狀腺原氨酸10ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離提取大鼠大網(wǎng)膜脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法和專用培養(yǎng)基。無菌條件下取健康斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠的大網(wǎng)膜脂肪，剪碎后用冰磷酸鹽緩沖液混合后離心，去除部分脂肪組織。用I型和II混合膠原酶消化離心，去除上部脂肪細(xì)胞組織。再次離心后用加入含有特定化學(xué)物質(zhì)和生長因子的專用培養(yǎng)基重懸后移入培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱中持續(xù)傳代培養(yǎng)。本發(fā)明在大鼠體內(nèi)提出一種大網(wǎng)膜脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)在培養(yǎng)過程中通過添加特定的化學(xué)物質(zhì)和生長因子的專用培養(yǎng)既可以解決干細(xì)胞在體外培養(yǎng)中容易衰老以及分化問題，獲得了一種能長期保持干細(xì)胞特性的大網(wǎng)膜脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
文檔編號C12N5/0775GK103184191SQ20121051241
公開日2013年7月3日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者胡飛虎, 孫博, 肖忠黨 申請人:東南大學(xué)