專利名稱：特異性沉默雞馬立克氏病病毒gI、gE基因的siRNA序列及其載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及針對雞馬立克氏病病毒US7 (gl)和US8 (gE)基因的SiRNA序列設(shè)計、篩選及其在體外抑制MDV gl和gE的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及序列為SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3和SEQID NO 4的siRNA序列，其可以特異性干擾雞馬立克氏病病毒gl基因。
背景技術(shù)：
I. MDV的研究現(xiàn)狀雞馬立克氏病(MD)是雞的一種淋巴增生性病，在養(yǎng)殖業(yè)受到廣泛關(guān)注。如果缺乏控制手段，MD將產(chǎn)生巨大的損失。MD在1907年被發(fā)現(xiàn)，1968年首次分離到雞馬立克氏病病毒(MDV)。MDV屬皰疹病毒科雙鏈DNA病毒，基因組接近180kb，MDV具有Y -皰疹病毒的生物學(xué)特性，但是根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)被歸類為a-皰疹病毒。其基因組龐大，由長獨特區(qū)(UL)及其兩側(cè)的反向長重復(fù)序列(TRL和IRL)、短獨特區(qū)(US)及其兩側(cè)的反向短重復(fù)序列(TRS和IRS)組成。MDV包括三種血清型，凡能引起腫瘤的MDV均屬于血清I型(MDV-I)，而天然不致瘤的MDV和火雞皰疹病毒(HVT)分別屬于血清2型和血清3型。相比其他a -皰疹病毒，MDV具有如下特點嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合特性，在淋巴細(xì)胞中建立潛伏感染，基因組中包含的致癌基因能夠產(chǎn)生淋巴瘤。從1969年開始，MD就通過疫苗免疫得到了很好的控制。然而，伴隨著MDV毒力不斷增強(qiáng)，疫苗的免疫效果逐步降低，病毒不斷演化迫使我們必須加快MD新疫苗的研發(fā)進(jìn)度以應(yīng)對毒力不斷增強(qiáng)所帶來的疾病控制壓力。然而，新疫苗研發(fā)速度還遠(yuǎn)跟不上病毒進(jìn)化速度，這對家禽業(yè)無疑一個潛在的最大威脅。另外，，強(qiáng)化商品雞的生產(chǎn)管理、使雞早期接觸病毒或接種低劑量病毒也是控制該病的一個好方法?，F(xiàn)有的結(jié)果證明，MD疫苗能有效地控制該病，但是并不能阻止病毒的進(jìn)化。CVI988病毒株仍然是當(dāng)前控制MD的最好的疫苗，應(yīng)對(或者適應(yīng))將來不斷進(jìn)化的MDV毒力增強(qiáng)的趨勢，開發(fā)免疫效果更好的新型MD疫苗是控制該病的一種戰(zhàn)略需要。在MD的控制環(huán)節(jié)上有三個關(guān)鍵控制點，即呼吸道、細(xì)胞間播散、病毒門戶(羽毛毛囊上皮細(xì)胞)，這三個環(huán)節(jié)任何一點的突破都會對MD的控制產(chǎn)生跨越性的影響。
_4] 2. MDVrI和gE基因及其表達(dá)蛋白的研究現(xiàn)狀。gl和gE是MDV基因編碼很重要的病毒糖蛋白，位于MDV的基因組的US區(qū)，在所有的a -皰疹病毒中均存在編碼gE的同源基因，gE中都具有2個保守的半胱氨酸簇，并且gE蛋白C端的半胱氨酸簇在所有的a -皰疹病毒中都有5個半胱氨酸殘基，說明皰疹病毒屬各成員的gE具有相似的功能很保守。與I型單純皰疹病毒(HSV_1、VZV、PRV等)有很高的同源性，影響體外病毒的生長。gE是一個重要的毒力基因，gl也與毒力有關(guān)，且對誘導(dǎo)完全保護(hù)是必須的。gE和gl基因是以非共價鍵形式結(jié)合成復(fù)合體gl/gE，它們與MDV在淋巴組中的侵襲和擴(kuò)散作用密切相關(guān)，是影響病毒生長的功能成分。有文獻(xiàn)報道gl/gE是病毒復(fù)制、增殖必需基因，gE是gG Fe受體，利用細(xì)胞的銜接機(jī)制來幫助病毒在細(xì)胞間擴(kuò)散。且gl-gE復(fù)合物有助于介導(dǎo)病毒侵入細(xì)胞，在細(xì)胞間傳播起到重要的作用(Schumacher et al. , 2001 ；shamblin et al. , 2004 ；Tischer et al.,2002)。Knapp等的研究證明，缺失gl/gE的PrV對大鼠的毒力大幅度降低，但將BHV-I的gl/gE克隆到該P(yáng)rV突變株后，重組病毒又恢復(fù)了對大鼠的毒力。BHV-I的同源區(qū)段能夠彌補(bǔ)PrV gE和gl缺失株對小鼠的毒力缺損，這也進(jìn)一步證明皰疹病毒同源gE蛋白具有相互互補(bǔ)的功能。通過對BHV-IgE缺失突變病毒體外表現(xiàn)型的分析揭示，gE對病毒分泌和蝕斑的縮小都有利。3. RNA干擾的研究現(xiàn)狀RNA干擾(RNA interference,RNAi)是序列特異的雙鏈RNA(dsRNA)使細(xì)胞內(nèi)同源mRNA降解，從而產(chǎn)生特異性基因表達(dá)沉默的過程。它是機(jī)體的一種小分子RNA介導(dǎo)的序列特異性免疫保護(hù)機(jī)制，可以對抗侵入性遺傳因子的作用。自1998年首次被報道以來，RNAi
技術(shù)以其特有的優(yōu)越性而被迅速應(yīng)用于抗病毒及其相關(guān)方面的研究中，目前已在HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要進(jìn)展。已有成功的可抗丙型肝炎表達(dá)小干擾RNA的轉(zhuǎn)基因鼠。MicroRNAs (miRNAs)是眾多生物體內(nèi)的主要基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，包括病毒。當(dāng)前，已報道MDV基因組的MEQ和LAT區(qū)域編碼6個miRNAs。另外，識別了 17個新的血清特性型HiiRNAs0這些miRNAs在致病過程和疫苗免疫應(yīng)答中的作用功能分析工作正在開展。RNAi的作用主要由長約19_21nt的dsRNA介導(dǎo),其中一類稱為小干擾RNA(smallinterfering RNA, siRNA),它和目的mRNA序列具有嚴(yán)格的配對，能引起相應(yīng)mRNA降解。由于RNAi是SiRNA靶向作用mRNA引起的特異性降解，因此要產(chǎn)生有效RNAi的關(guān)鍵是選擇合適的SiRNA作用靶點。目前RNAi靶點的選擇原則可以概括為以下幾點①選擇GC含量在50%左右的mRNA區(qū)域；②避免選擇啟動子起始部位下游50_100nt以內(nèi)或終止子上游50-100nt內(nèi)的區(qū)域避免超過三個G或三個C的重疊，因為多聚G或多聚C能形成類聚物而干擾RNAi的沉默機(jī)制；④選擇以兩個AA開始的序列，這將使合成siRNA更加容易； 保證靶序列與其他基因沒有同源性。目前，制備siRNA的方法主要包括化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、長片段dsRNA經(jīng)RNaseIII降解法、siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄法及PCR制備的siRNA表達(dá)框法等5種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)SiRNA設(shè)計原則，選擇的siRNA其序列的GC含量分別為47. 5 %和52%，對應(yīng)的起始位點在gl和gE基因mRNA序列上的位置，分別命名為sigI735和sigE936。構(gòu)建針對MDV gl和gE基因的siRNA真核表達(dá)載體，提取純化質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞可有效地抑制MDV gl和gE基因的表達(dá)，再通過DFl、Vero、MDCK穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)一步檢測干擾序列抑制MDV gl和gE基因的表達(dá)效果。在一個方面中，本發(fā)明提供一種針對MDV gl和gE基因的siRNA序列，其核苷酸序列是sigI735 正義鏈 5 ' CAATTCCCATGTCGATGCA 3 ' (SEQ ID NO :I)，反義鏈5' TGCATCGACATGGGAATTG 3' (SEQ ID NO :3) ;sigE936 正義鏈 5' AGATGTCCAGGTAGACGAT3' (SEQ ID NO : 2);反義鏈 5' ATCGTCTACCTGGACATCT 3' (SEQ ID NO :4)。在第二個方面中，本發(fā)明提供包含上述第一個方面所述的siRNA序列的載體。在一個實施方案中，所述載體為pGEM-T Easy載體。在一個實施方案中，所述載體特征在于按下述方法構(gòu)建而成一步法PCR擴(kuò)增含有禽源U6啟動子的特異性干擾gl和gE基因的cU6-3-siRNA的表達(dá)盒，將其定向克隆到pGEM_T Easy載體，構(gòu)建得到pGEM-T-cU6-3-shgI735 和 pGEM-T-cU6-3_shgE935 表達(dá)載體；所述 cU6-3_siRNA 序列包含394bp的cU6_3啟動子、19nt的siRNA正義鏈、7bp loop環(huán)、19nt的siRNA反義鏈、6個連續(xù)T為終止信號序列，5'和3'端均為HindIII酶切位點。在一個實施方案中，所述載體為真核表達(dá)載體。在一個實施方案中，所述真核表達(dá)載體為帶有EGFP標(biāo)記的真核表達(dá)載體。在一個實施方案中，所述載體為基于PGEM-T Easy載體構(gòu)建的載體。在第三個方面中，本發(fā)明提供第一個方面所述的siRNA序列和第二個方面所述的載體在針對MDV的基因研究中的應(yīng)用。在第四個方面中，本發(fā)明提供第一個方面所述的siRNA序列和第二個方面所述的載體在制備用于針對MDV基因工程疫苗中的應(yīng)用。在第五個方面中，本發(fā)明提供第一個方面所述的siRNA序列和第二個方面所述的
載體在制備用于預(yù)防或治療由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用。在一個實施方案中，所述由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病是雞馬立克氏病。在第六個方面中，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病的藥物，所述藥物包含第一個方面所述的siRNA序列和第二個方面所述的載體作為活性成分。在一個實施方案中，所述由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病是雞馬立克氏病。本發(fā)明的另一個目的是提供了一種初步鑒定雞馬立克氏病病毒復(fù)制特異性干擾靶位點的方法，及其在制備治療MDV病毒感染的基因治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益之處是:提供的siRNA序列針對MDV的增殖必需基因gl和gE，目前，國內(nèi)外尚無以此基因作為RNAi靶點的報道。以此序列為基礎(chǔ)的真核表達(dá)載體在細(xì)胞中能有效抑制gl和gE基因mRNA水平和蛋白表達(dá)水平，因此可作為MDV基因治療的一個新靶點。


圖I為一步法PCR快速擴(kuò)增CU6-3-表達(dá)盒上下游設(shè)計。M DL2000DNA ；1 :cU6-3_shgI97 ；2 :cU6-3_shgI328 ；3 :cU6-3_shgI487 ；
4cU6-3-shgI735 ；5 :cU6-3_shgI922 ；6 :cU6-3_shgE172 ；7 :cU6-3_shgE328 ；8 cU6-3-shgE461 ；9 :cU6-3_shgE936 ；10 :cU6-3_shgE1261 ；11 cU6-3-conshRNA ；12 Negative control.圖2 為擴(kuò)增 cU6-3-shRNAgI 和 cU6_3_shRNAgE 表達(dá)盒 PCR 鑒定。圖3 為 pEGFP-gl 和 pEGFP-gE 酶切鑒定。圖4為轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡觀察cU6-3-shRNA對gE_EGFP、gI-EGFP融合蛋白的表達(dá)抑制觀察結(jié)果。A transfect ion of pEGFP-Cl ；B cotransf ection of pEGFP-gE andpcU6-3-conshRNA ；C co-transfeet ion of pEGFP-gl and cU6-3_conshRNA ；D transfection reagent-only control(no-plasmid DNA) ；E :no-fluorescencemicroscopy image cU6-3_conshRNA ;F_J Co-transfected with pEGFP-gE and variouscU6-3-shRNA gE expression Plasmids ;K_0 :Co_transfected with pEGFP-gl andvarious cU6-3_shRNAgI expression plasmids.圖5為轉(zhuǎn)染48h后流式細(xì)胞儀檢測cU6-3-shRNA對gE_EGFP、gI-EGFP融合蛋白的表達(dá)抑制分析結(jié)果。(圖注部分見圖4)圖6 為 pGEMT-cU6-3-shRANgI735 質(zhì)粒載體中 shRNA 測序圖譜。圖7 為 pGEMT-cU6-3-shRANgE936 質(zhì)粒載體中 shRNA 測序圖譜。圖8為特異性重組干擾質(zhì)粒在不同細(xì)胞系上的基因抑制效果。(a)特異性重組干擾質(zhì)粒和融合基因質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染48h后不同細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察(100X) ； (b)流式細(xì)胞儀定量檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組對gE-EGFP和gl-EGFP陽性細(xì)胞的抑制作用。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合實施例作進(jìn)一步說明。實施例一 siRNA直核表汰載體體外抑制gl-EGFP和gE_EGFP融合蛋白的表汰I. siRNA的設(shè)計根據(jù)siRNA設(shè)計原則，從gl和gE mRNA起始密碼子AUG下游IOOnt處搜索AA序列，其3'端相鄰19nt序列作為候選靶點，分別選擇GC含量在40 % -60 %的5條siRNA序列，利用GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast功能對雞體內(nèi)全基因組序列進(jìn)行比對，確保無相似性。最終選擇的siRNA其cDNA序列為sigI735 5 ' CAATTCCCATGTCGATGCA3 ' (SEQ ID NO: I) ；sigE936 5 ' AGATGTCCAGGTAGACGAT 3 ' (SEQ ID NO 2),對應(yīng)gl和gE mRNA的735和936位核苷酸位點。所述sigI735和sigE936反義鏈分別為5' TGCATCGACATGGGAATTG 3' (SEQ ID NO 3)或 5' ATCGTCTACCTGGACATCT 3' (SEQ IDNO 4)。2.表汰siRNA所需shRNA的合成與制備:通過一步法PCR擴(kuò)增含有禽源U6啟動子的siRNA表達(dá)盒特異性干擾gl和gE基因的cU6_3_shRNA序列。(gl 基因開放閱讀框如下ATGTATCTACTACAATTATTAITITGGATCCGCCTCTTTCGAGGCATCTGGTCTATAGTTTATACTGGAACATCTGTTACGTTATCAACGGACCAATCTGCTCTTGTTGCGTTCTGCGGATTAGATAAAATGGTGAATGTACGCGGCCAACTTTTATTCCTGGGCGACCAGACTCGGACCAGTTCTTATACAGGAACGACGGAAATCTTGAAATGGGATGAAGAATATAAATGCTATTCCGTTCTACATGCGACATCATATATGGATTGTCCTGCTATAGACGCCACGGTATTCAGAGGCTGTAGAGACGCTGTGGTATATGCTCAACCTCATGATAGAGTACAACCTTTTCCCGAAAAGGGAACATTGTTGAGAATTGTCGAACCCA GAGTATCAGATACAGGCAGCTATTACATACGTGTAGCTCTCGCTGGAAGAAATATGAGCGATATATTTAGAATGGCTGTTATTATAAGGAGTAGCAAATCTTGGGCCTGTAATCACTCTGCTAGTTCATTTCAGGCCCATAAATGTATTCGCTATGTCGACCGTATGGCCTTTGAAAATTATCTGATTGGACATGTAGGCAATTTGCTGGACAGTGACTCGGAATTGCATGCAATTTATAATATTACTCCCCAATCCATTTCCACAGATATTAATATTATAACGACTCCATTTTACGATAATTCGGGAACAATTTATTCACCTACGGTTTTTAATTTGTTTAATAACAATTCCCATGTCGATGCAATGAATTCGACTGGTATGTGGAATACCGTTTTAAAATATACCCTTCCAAGGCTTATTTACTTTTCTACGATGATTGTACTATGTATAATAGCATTGGCAATTTATTTGGTCTGTGAAAGGTGCCGCTCTCCCCATCGTAGGATATACATCGGTGAACCAAGATCTGATGAGGCCCCACTCATCACTTCTGCAGTTAACGAATCATTTCAATATGATTATAATGTAAAGGAAACTCCTTCAGATGTTATTGAAAAGGAGTTGATGGAAAAACTGAAGAAGAAAGTCGAATTGTTGGAAAGAGAAGAATGTGTATAG(SEQ ID NO :5)；
gE 基因開放閱讀框如下ATGTGTGITITCCAAATCCTGATAATAGTGACGACGATCAAAGTAGCTGGAACGGCCAACATAAATCATATAGACGTTCCTGCAGGACATTCTGCTACAACGACGATCCCGCGATATCCACCAGTTGTCGATGGGACCCTTTACACCGAGACGTGGACATGGATTCCCAATCACTGCAACGAAACGGCAACAGGCTATGTATGTCTGGAAAGTGCTCACTGTTTTACCGATTTGATATTAGGAGTATCCTGCATGAGGTATGCGGATGAAATCGTCTTACGAACTGATAAATTTATTGTCGATGCGGGATCCATTAAACAAATAGAATCGCTAAGTCTGAATGGAGTTCCGAATATATTCCTATCTACGAAAGCAAGTAACAAGTTGGAGATACTAAATGCTAGCCTACAAAATGCGGGTATCTACATTCGGTATTCTAGAAATGGGACGAGGACTGCAAAGCTGGATGTTGTTGTGGTTGGCGTTTTGGGTCAAGCAAGGGATCGCCTACCCCAAATGTCCAGTCCTATGATCTCATCCCACGCCGATATCAAGTTGTCATTAAAAAACTTTAAAGCATTAGTATATCACGTGGGAGATACTATCAATGTCTCGACGGCGGTTATACTAGGACCTTCTCCGGAGATATTCACATTGGAATTTAGGGTGTTGTTCCTCCGTTATAATCCAACGTGCAAGTTCGTCACGATTTATGAACCTTGTATATTTCACCCCAAAGAACCAGAGTGTATTACTACTGCAGAACAATCGGTATGTCATTTCGCATCCAACATTGACATTCTGCAGATAGCCGCCGCACGTTCTGAAAATTGTAGCACAGGGTATCGTAGATGTATTTATGACACGGCTATCGATGAATCTGTGCAGG CCAGATTAACATTCATAGAACCAGGAATTCCTTCCTTTAAAATGAAAGATGTCCAGGTAGACGATGCTGGATTGTATGTGGTTGTGGCTTTATACAATGGACGTCCAAGTGCATGGACTTACATTTATTTGTCAACGGTGGAAACATATCTTAATGTA
TATGAAAACTACCACAAGCCGGGATTTGGGTATAAATCATTTCTACAGAACAGTAGTATCGTCGACGAAAATGAGGCTAGCGATTGGTCCAGCTCGTCCATTAAACGGAGAAATAATGGTACTATCATTTATGATATTTTACTCACATCGCTATCAATTGGGGCGATTATTATCGTCATAGTAGGGGGTGTTTGTATTGCCATATTAATTAGGCGTAGGAGACGACGTCGCACGAGGGGGTTATTCGATGAATATCCCAAATATATGACGCTACCAGGAAACGATCTGGGGGGCATGAATGTACCGTATGATAATACATGCTCTGGTAACCAAGTTGAATATTATCAAGAAAAGTCGGCTAAAATGAAAAGAATGGGTTCGGGTTATACCGCTTGGCTAAAAAATGATATGCCGAAAATTAGGAAACGCTTAGATTTATACCACTGA(SEQ ID NO :6))設(shè)計原則如圖I所示，以含禽源啟動子(CU6-3)的雞全基因組DNA(登錄號DQ531569)為模板，上游引物與cU6啟動子5'端序列(GACTAAGAGCATCGAGACTG)互補(bǔ)，其引物序列為5' AAGCTTCAGACAGACGTCAGGCTTTC 3';下游引物如表I所示包含與cU6_3啟動子3'端(GACTAAGAGCATCGAGACTG)互補(bǔ)的序列、編碼siRNA正義鏈序列(斜體)、7nt的loop序列(CTCTTGA)、siRNA反義鏈序列(下劃線)和6個連續(xù)T為終止信號的序列，此外還加入酶切位點(HindIII)。表IMDV gl 和 gE 基因的 siRNA 下游引物 Table. IThe MDV gl and gE of siRNAsreverse primers
權(quán)利要求
1.一種特異性干擾雞馬立克氏病病毒gE基因的SiRNA序列，其特征在于所述SiRNA序列為sigE936 :正義鏈 5' AGATGTCCAGGTAGACGAT 3' ； (SEQ ID NO 2)反義鏈 5' ATCGTCTACCTGGACATCT 3'。(SEQ ID NO 4)
2.ー種包含權(quán)利要求I所述的siRNA序列的載體。
3.權(quán)利要求2所述的載體，其為真核表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求2的載體,其特征在于所述載體為基于pGEM-TEasy載體構(gòu)建的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能有效地特異性沉默雞馬立克氏病病毒(MDV)gI和gE的siRNA序列及其載體和在MDV基因治療和制備基因工程疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明使用http//www.ambion.com的靶位點篩選和設(shè)計工具，通過一步法PCR擴(kuò)增含有禽源U6啟動子的siRNA表達(dá)盒用于快速篩選出MDV gI和gE基因的干擾序列。根據(jù)siRNA對應(yīng)的起始位點在gI和gE基因mRNA序列上的位置，分別命名為sigI735和sigE936。構(gòu)建分別含有干擾序列的siRNA真核表達(dá)載體，提取純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，可有效抑制MDV gI和gE基因的表達(dá)，并利用DF1、Vero、MDCK穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)一步檢測干擾序列抑制MDV gI和gE基因表達(dá)的效果。
文檔編號C12N15/113GK102851292SQ20121030383
公開日2013年1月2日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者王云峰, 趙妍, 石星明, 崔紅玉, 劉長軍, 王玫 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所