專利名稱：熒光分子修飾的納米銀探針及其試劑盒與在檢測鏈霉親和素中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光分子修飾的納米銀探針及其試劑盒與在檢測鏈霉親和素中的應用。
背景技術(shù)：
金屬納米粒子和其他納米結(jié)構(gòu)能夠用來增強熒光強度和提高熒光檢測的靈敏度。當熒光分子靠近金屬表面時，能使熒光分子的熒光特性改變，產(chǎn)生金屬熒光增強的效應。這種由金屬納米結(jié)構(gòu)所導致的熒光增強效應可以解釋為1.近場增強所致的外來光吸收增強和納米粒子散色所致的發(fā)射增強；2.納米粒子表面的熒光分子的放射性衰變速度改變所致的熒光壽命和量子產(chǎn)率變化。該熒光增強效應與納米粒子的形狀和尺寸相關(guān)，也與熒光分子和納米粒子之間的距離相關(guān)。最佳的熒光分子-金屬表面的距離是8nm。銀納米粒子和島狀銀膜已被用來增強熒光分子的熒光強度從而提高熒光檢測的靈敏度。由于入射光 帶來的表面等離子體激發(fā)產(chǎn)生的強等離子體吸收帶和增強的局域電磁場，使得金屬納米粒子具有極佳的光學性質(zhì)。局域表面等離子共振傳感器已經(jīng)用于免疫分析、生物分子檢測、表面增強拉曼散射和金屬熒光增強中。但是，基于局域表面等離子共振所產(chǎn)生的金屬熒光增強效應是有限的，而且對不同的熒光分子的熒光增強能力也是有局限性的。此外，在基于金屬熒光增強效應的傳感器制備過程中，涉及到復雜的合成技術(shù)。因此，在金屬熒光增強領(lǐng)域中，一個簡單高效的金屬熒光增強傳感器具有很大的吸引力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，是提供一種靈敏的熒光增強技術(shù)并適用于蛋白質(zhì)鏈霉親和素(SA)檢測的熒光分子修飾的納米銀探針。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題，是提供包含上述納米銀材料的試劑盒，用于SA的檢測。本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題，是提供上述試劑盒在檢測SA中的應用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種熒光分子修飾的納米銀探針，它以直徑為l(T30nm的納米銀球為內(nèi)核，銀球外表面鍵合有熒光分子鏈和寡核苷酸鏈；其中，所述的熒光分子鏈為5’ -SH-AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-熒光分子；所述的熒光分子為Cy3或Cy5 ；其中，所述的寡核苷酸鏈為5’ -SH-AAAAAAAAAAAAAAA-生物素。上述的熒光分子修飾的納米銀探針的制備方法，它包括如下步驟(I)在冰浴條件下，將2-20mmol/L硝酸銀溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氫化鈉溶液中，硝酸銀與硼氫化鈉的反應摩爾比為I :3，不斷攪拌至反應完全，然后補加硼氫化鈉溶液，補加的硼氫化鈉的摩爾量為上述參與反應的硼氫化鈉的摩爾量的7%，繼續(xù)攪拌至室溫，得到納米銀溶液；(2)將熒光分子鏈和寡核苷酸鏈按摩爾比(1、9) (rg)加入步驟(I)得到的納米銀溶液中，靜置1(T24小時，熒光分子鏈和寡核苷酸鏈的總摩爾量與納米銀摩爾量之比為(100-1000):1 ；所述的熒光分子鏈，其核苷酸序列為5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巰基修飾，3’端由突光分子修飾,所述的突光分子為Cy3或Cy5 ；所述的寡核苷酸鏈，其核苷酸序列為5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巰基修飾，3’端由生物素標記；(3)向步驟(2)得到的混合體系中加入I X PBS緩沖溶液，使得混合體系中的PBS緩沖溶液的濃度為0. 1XPBS，靜置3 10小時；
(4)向步驟(3)得到的混合體系中加入廣5mol/L氯化鈉溶液，靜置2 4小時，重復加入氯化鈉溶液與靜置的步驟廣4次，使得氯化鈉的終濃度為0. ro. 3mol/L ；(5)將步驟(4)得到的混合體系靜置24 72小時，取上清液；(6)將步驟(5)得到的上清液經(jīng)離心去除上清，取沉淀加入IXPBS緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟2 4次，PBS緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的
0.I飛倍；最后離心得到的沉淀用IXPBS緩沖溶液重懸即得備用探針。步驟(2)中，熒光分子鏈和寡核苷酸鏈摩爾比優(yōu)選為(廣10):(廣10)，最優(yōu)選為3:1 ;靜置時間優(yōu)選為15 20h，最優(yōu)選為18h ;熒光分子鏈和寡核苷酸量的總摩爾量與納米銀摩爾量之比優(yōu)選為(20(T300) :1，最優(yōu)選為288:1。步驟(3)中，PBS緩沖溶液優(yōu)選為I XPBS，即包含如下物質(zhì)的水溶液137mM NaCl，
2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4. 12H20,2mM KH2PO4 ;靜置時間優(yōu)選為 6h。步驟(4)中，氯化鈉溶液的濃度優(yōu)選為2mol/L ;氯化鈉的終濃度優(yōu)選為0. 2mol/L ；靜置時間優(yōu)選為3h。步驟(5)中，靜置時間優(yōu)選為48h。步驟(6)中，所述的離心條件為1000(T20000rpm條件下離心10 30分鐘，優(yōu)選15000條件下離心15分鐘。上述熒光分子修飾的納米銀探針在制備檢測鏈霉親和素的試劑中的應用。一種用于檢測鏈霉親和素的試劑盒，該試劑盒包含如下試劑熒光分子修飾的納米銀探針、磷酸鹽緩沖液、Tween-20、鏈霉親和素、硝酸銀、氫醌、牛血清白蛋白溶液、醛基片基。上述用于檢測鏈霉親和素的試劑盒在檢測鏈霉親和素中的應用。利用上述檢測鏈霉親和素的試劑盒檢測鏈霉親和素含量的具體方法，依次順序包括如下步驟(I)配制溶液稀釋液將20 X PBS用二次水稀釋20倍至IXPBS ;洗滌液I X PBS溶液按0. 05%的體積比加入吐溫-20溶液；陰性對照將0. Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl X PBS溶液中，得lmg/mlBSA溶液；封閉液將Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封閉液；
熒光增強液18. 2mmol/L硝酸銀和I. 82mmol/L氫醌等體積混合；鏈霉親和素標準溶液配制不同濃度的鏈霉親和素標準樣品溶液；探針用IXPBS溶液配制I. 3nmol/L的熒光分子修飾的納米銀探針；(2)將不同濃度的鏈霉親和素標準溶液，待測樣品和陰性對照在醛基片上點樣，分別為25iU，4°C條件下固定過夜；
(3)每孔加入l(T200ii L封閉液，在37 °C條件下封閉廣3小時，用洗滌液蕩洗5 15min,洗漆3 4次,拍干；(4)每孔加入I. 3nmol/L熒光分子修飾的納米銀探針30 y L，在37°C條件下反應1^3小時，用洗滌液蕩洗5 15min，洗滌3 4次，拍干；(5)每孔加入30 y L熒光增強液，避光反應f 8min，去離子水沖洗3 4遍，拍干；(6)用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner生物芯片掃描儀掃描,不同濃度的鏈霉親和素標準樣品溶液對應不同的熒光信號強度，得到鏈霉親和素的標準曲線，由標準曲線計算得到樣品中鏈霉親和素的濃度。有益效果本發(fā)明的納米銀探針耦合熒光增強液的方法能大大提高熒光檢測的靈敏度，不需要通過改變儀器的結(jié)構(gòu)來提高檢測性能，巧妙地提高了檢測能力。此種探針的合成及修飾方法成熟，熒光增強液廉價易得，兩者的聯(lián)合使用可以得到驚人的結(jié)果。為蛋白質(zhì)的熒光分析檢測提供了一種極好的方法。本發(fā)明利用生物素鏈霉親和素的特異性結(jié)合實現(xiàn)對鏈霉親和素的分析檢測，對鏈霉親和素的分析范圍為31. 2 u g/ml-1000 u g/ml。納米銀簇對兩種熒光分子Cy3和Cy5均有很好的熒光增強效果，此種熒光增強液獨一無二，商品化的銀增強溶液雖然能形成銀納米簇，但是沒有熒光增強的作用。對于生物分析、熒光示蹤、細胞成像和基于銀納米粒子的藥物輸送與治療中的金屬熒光增強研究，本發(fā)明提供了一個堅實的有前景的平臺。


圖I為納米銀銀簇熒光增強用于SA的分析檢測示意圖。圖2為熒光增強溶液與Sigma的顯色劑對熒光分子Cy5熒光增強效應的比較。圖3為掃描電鏡顯微鏡表征圖。其中，Ca)納米銀探針，(b)納米銀探針與熒光增強液反應8分鐘后的圖像，(c)納米銀探針與Sigma顯色劑反應8分鐘后的粒子形貌圖。圖4為納米銀簇對染料分子Cy3的熒光增強作用。圖5為納米銀簇對SA的分析檢測。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例I :納米銀探針的制備。(I)在冰浴的條件下，將2mmol/L的硝酸銀以一定的速度滴加至3mmol/L的硼氫化鈉溶液中(兩者反應摩爾比為1:3)，不斷攪拌至反應完全，反應完成后補加7%摩爾量的硼氫化鈉溶液并加熱得到黃色溶液，納米銀的濃度為2. 6nM。
(2)將熒光分子鏈和寡核苷酸鏈按摩爾比3:1加入步驟(I)得到的納米銀溶液中，靜置18小時。熒光分子鏈和寡核苷酸量的總摩爾量與納米銀摩爾量之比為288。所述的熒光分子鏈，其核苷酸序列為5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巰基修飾，3’端由突光分子修飾,所述的突光分子為Cy3或Cy5 ；所述的寡核苷酸鏈，其核苷酸序列為5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巰基修飾，3’端由生物素標記。(3)向步驟(2)得到的混合體系中加入IXPBS (137mM NaCl, 2. 7mMKCl, IOmM, Na2HP04. 12H20, 2mM KH2P04)溶液，使 PBS 的濃度為 0. I X，靜置 6 小時。(4)向步驟(3)得到的混合體系中加入2mol/L氯化鈉溶液，每隔3小時加一次氯化鈉，靜置，使氯化鈉的終濃度為0. 2mol/L。
(5)將步驟⑷得到的混合體系靜置48小時，取上清液。(6)將步驟(5)得到的上清液經(jīng)離心去除上清，沉淀加入IXPBS溶液重懸，重復離心與重懸的步驟3次，PBS緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的I倍；最后離心得到的沉淀經(jīng)IXPBS重懸即得熒光分子修飾的納米銀探針。所述的熒光分子為Cy3時，制得相應的探針l_Cy3。所述的熒光分子為Cy5時，制得相應的探針l_Cy5。實施例2 :納米銀探針的制備。(I)在冰浴的條件下，將20mmol/L的硝酸銀以一定的速度滴加至30mmol/L的硼氫化鈉溶液中(兩者反應摩爾比為1:3)，不斷攪拌至反應完全，反應完成后補加7%摩爾量的硼氫化鈉溶液并加熱得到黃色溶液，納米銀的濃度為2. 6nmol/L。(2)將熒光分子鏈和寡核苷酸鏈按摩爾比I: I加入步驟(I)得到的納米銀溶液中，靜置10小時。熒光分子鏈和寡核苷酸量的總摩爾量與納米銀摩爾量之比為100。所述的熒光分子鏈，其核苷酸序列為5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巰基修飾，3’端由突光分子修飾,所述的突光分子為Cy3或Cy5 ；所述的寡核苷酸鏈，其核苷酸序列為5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巰基修飾，3’端由生物素標記。(3)向步驟(2)得到的混合體系中加入IXPBS (137mM NaCl, 2. 7mMKCl, IOmM, Na2HPO4. 12H20, 2mM KH2PO4)溶液，使 PBS 的濃度為 0. I X，靜置 3 小時。(4)向步驟(3)得到的混合體系中加入lmol/L氯化鈉溶液，靜置2小時，重復加入氯化鈉溶液與靜置的步驟I次，使氯化鈉的終濃度為0. lmol/L。(5)將步驟⑷得到的混合體系靜置24小時，取上清液。(6)將步驟(5)得到的上清液經(jīng)離心去除上清，沉淀加入IXPBS溶液重懸，重復離心與重懸的步驟2次，PBS緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的0. I倍；最后離心得到的沉淀經(jīng)IXPBS重懸即得熒光分子修飾的納米銀探針。所述的熒光分子為Cy3時，制得相應的探針l_Cy3。所述的熒光分子為Cy5時，制得相應的探針l_Cy5。實施例3 :納米銀探針的制備。(I)在冰浴的條件下，將10mmol/L的硝酸銀以一定的速度滴加至20mmol/L的硼氫化鈉溶液中(兩者反應摩爾比為1:3)，不斷攪拌至反應完全，反應完成后補加7%摩爾量的硼氫化鈉溶液并加熱得到黃色溶液，納米銀的濃度為2. 6nmol/L。(2)將熒光分子鏈和寡核苷酸鏈按摩爾比99:9加入步驟(I)得到的納米銀溶液中，靜置24小時。熒光分子鏈和寡核苷酸量的總摩爾量與納米銀摩爾量之比為1000。所述的熒光分子鏈，其核苷酸序列為5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巰基修飾，3’端由突光分子修飾,所述的突光分子為Cy3或Cy5 ；所述的寡核苷酸鏈，其核苷酸序列為5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巰基修飾，3’端由生物素標記。(3)向步驟(2)得到的混合體系中加入IXPBS (137mM NaCl, 2. 7mMKCl, IOmM, Na2HP04. 12H20, 2mM KH2P04)溶液，使 PBS 的濃度為 0. I X，靜置 10 小時。(4)向步驟(3)得到的混合體系中加入5mol/L氯化鈉溶液，靜置4小時，重復加入氯化鈉溶液與靜置的步驟4次,使氯化鈉的終濃度為0. 3mol/L0 (5)將步驟(4)得到的混合體系靜置72小時，取上清液。(6)將步驟(5)得到的上清液經(jīng)離心去除上清，沉淀加入IXPBS溶液重懸，重復離心與重懸的步驟4次，PBS緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的5倍；最后離心得到的沉淀經(jīng)IXPBS重懸即得熒光分子修飾的納米銀探針。所述的熒光分子為Cy3時，制得相應的探針l_Cy3。所述的熒光分子為Cy5時，制得相應的探針l_Cy5。實施例4 :用于檢測SA的試劑盒。熒光分子修飾的納米銀探針實施例f 3的方法合成；PBS (購自上海生工生物工程有限公司)及Tween-20 (購自天津科美有限公司)用于配制洗滌液；牛血清白蛋白、鏈霉親和素(標準品)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；硝酸銀購自于Sigma ；氫醌購自于(南京試劑有限公司)；醛基片基購自于(上海百傲科技有限公司)。所有溶液均用高純水配制。實施例5 :檢測SA的方法。利用實施例4的試劑盒檢測鏈霉親和素含量的具體方法，依次順序包括如下步驟(I)配制溶液稀釋液將20 X PBS用二次水稀釋20倍至IXPBS ;洗滌液I X PBS溶液按0. 05%的體積比加入吐溫_20溶液；陰性對照將0. Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl X PBS溶液中，得lmg/mlBSA溶液；封閉液將Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封閉液；熒光增強液18. 2mmol/L硝酸銀和I. 82mmol/L氫醌等體積混合；鏈霉親和素標準溶液配制不同濃度的鏈霉親和素標準樣品溶液；探針用IXPBS溶液配制I. 3nmol/L的熒光分子修飾的納米銀探針；(2)將不同濃度的鏈霉親和素標準溶液，待測樣品和陰性對照在醛基片上點樣，分別為25iU，4°C條件下固定過夜；(3)每孔加入30i! L封閉液，在37°C條件下封閉2小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3次，拍干；(4)每孔加入I. 3nmol/L探針1-Cy3或探針1-Cy5 30 y L，在37°C條件下反應I小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3次，拍干；(5)每孔加入30 L熒光增強液，避光反應8min，去離子水沖洗3遍，拍干；(6)用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片掃描儀掃描,不同濃度的鏈霉親和素標準樣品溶液對應不同的熒光信號強度，得到鏈霉親和素的標準曲線，由標準曲線計算得到樣品中鏈霉親和素的濃度。
實施例6:本發(fā)明首次報導構(gòu)建了由熒光分子修飾的銀納米粒子和熒光增強液(由18.2mM的硝酸銀和I. 82mM的氫醌組成的混合溶液)形成的具有熒光增強能力的銀納米簇。通過兩端修飾有巰基及生物素的寡核苷酸(含15個堿基A)和兩端修飾有巰基及熒光分子的寡核苷酸(含24個堿基A)使得銀納米粒子表面修飾有生物素和熒光分子。生物素可以使得納米銀探針固定在鏈霉親和素修飾的芯片上。納米銀探針溶液可以催化熒光增強溶液中的銀離子形成銀納米簇進一步增強熒光分子的熒光強度(圖I)。圖2為熒光增強溶液與Sigma的顯色劑對熒光分子Cy5熒光增強效應的比較。實驗方法與實施例5相同，所不同的是步驟(2)，將lmg/ml SA標準溶液，陰性對照在醛基片上點樣，分別為25 yl，4°C條件下固定過夜；步驟(4)，每孔加入1.3nmol/L探針1-Cy5 30 y L，在37°C條件下反應I小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3次，拍干；步驟(5)，每孔分別加入30 y L本發(fā)明的熒光增強液和Sigma購買的銀增強溶液，分別避光反應Omin, 0. 5min, lmin, 2min, 4min, 8min,去離子水沖洗3遍,拍干；步驟(6),用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner生物芯片掃描儀掃描,不同時間對應不同的突光信號強度，時間與突光信號強度的柱狀圖。從圖2可以發(fā)現(xiàn)熒光增強液可以大大提高熒光信號強度，延長探針和熒光增強溶液的反應時間可以加強熒光增強的效果(圖la，lb)。通過微陣列芯片掃描儀(激發(fā)波長635nm)采集得到的數(shù)據(jù)，表明納米銀簇對于Cy5，最佳的熒光增強倍數(shù)達到25倍。而購買的Sigma的銀增強溶液，其主要成分也是銀離子溶液和相應的還原劑，在納米銀探針的催化作用下，同樣可以生成納米銀團簇，但是其熒光增強的效果很差(圖lc，ld)。圖3掃描電鏡顯微鏡表征圖(熒光分子為Cy5)。其中，Ca)納米銀探針，(b)納米銀探針與熒光增強液反應8分鐘后的圖像，(c)納米銀探針與Sigma顯色劑反應8分鐘后的粒子形貌圖。實驗方法與實施例5相同，所不同的是步驟(2)，將lmg/ml SA標準溶液，陰性對照在醛基片上點樣，分別為25 yl，4°C條件下固定過夜；步驟(4)，每孔加入1.3nmol/L探針1-Cy5 30 y L，在37°C條件下反應I小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3次，拍干；步驟(5)，每孔分別加入30 y L本發(fā)明的熒光增強液和Sigma購買的銀增強溶液，分別避光反應8min，去離子水沖洗3遍，拍干；步驟(6)，噴金，采集掃描電子顯微鏡圖片。掃描電鏡顯微鏡顯示(圖3)，納米銀探針與熒光增強液及Sigma顯色劑后，粒子的形貌和粒徑發(fā)生很大的變化。粒子形貌和粒徑的不同決定了熒光增強的效應也不一樣，只有形成(b)圖形貌的顯色劑才具有熒光增強的作用，而(C)顯示的粒子其熒光增強作用很弱。同時也觀察到通過熒光增強液和購自Sigma的銀增強溶液所產(chǎn)生的銀納米簇的顏色是不同的前者產(chǎn)生的銀納米簇顯銀灰色，而后者產(chǎn)生的銀納米簇則是黑色的。這種差別表明銀增強溶液的其他組分不僅影響到生成的銀納米簇顏色(吸收性質(zhì))，還阻礙了銀納米簇的局域表面等離子體與熒光分子之間的共振耦合。圖4為納米銀簇對染料分子Cy3的熒光增強作用。實驗方法與實施例5相同，所不同的是步驟(2)，將lmg/ml SA標準溶液，陰性對照在醛基片上點樣，分別為25 yl，4°C條·件下固定過夜；步驟(4)，每孔加入1.3nmol/L探針1-Cy3 30 y L，在37°C條件下反應I小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3次，拍干；步驟(5)，每孔分別加入30 UL本發(fā)明的熒光增強液，分別避光反應Omin, 0. 5min, lmin, 2min, 4min, 8min,去離子水沖洗 3 遍,拍干；步驟(6),用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner生物芯片掃描儀掃描,不同時間對應不同的突光信號強度，時間與突光信號強度的柱狀圖。為進一步拓展熒光增強溶液生成的銀納米簇的應用，本發(fā)明研究了納米銀簇對另外一種熒光染料Cy3 (激發(fā)波長為532nm)的金屬熒光增強效應。結(jié)果表明，Cy3的熒光信號增強了 46倍。與Cy5的結(jié)果相似，Cy3的熒光增強效應也隨著反應時間的延長得到加強(圖4)。納米銀簇對Cy3具有更好的熒光增強效應。圖5為納米銀簇對SA的分析檢測。實驗方法同實施例5，所不同的是步驟(2)，將不同濃度31.210001! g/ml SA標準溶液，陰性對照在醛基片上點樣，分別為25iU，4°C條件下固定過夜；步驟(4)，每孔加入1.3nmol/L探針1-Cy5 30 ii L，在37°C條件下反應I小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3次，拍干；步驟(5)，每孔分別加入30 y L本發(fā)明的熒光增強液，分別避光反應lmin，留一半的孔不加任何試劑作為對照，去離子水沖洗3遍，拍干；步驟(6),用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner 生物芯片掃描儀掃描，SA 濃度對應不同的熒光信號強度，得到濃度與熒光信號強度的圖。本發(fā)明將納米銀簇用于SA蛋白的分析檢測中，發(fā)現(xiàn)當SA濃度在31. 2-1000 u g/ml之間，熒光增強液形成的納米銀簇與濃度的對數(shù)值具有很好的線性關(guān)系，而且納米銀簇的熒光信號遠遠大于納米銀探針的熒光信號。
權(quán)利要求
1.一種熒光分子修飾的納米銀探針，其特征在于，它以直徑為l(T30nm的納米銀球為內(nèi)核，銀球外表面鍵合有突光分子鏈和寡核苷酸鏈； 其中，所述的熒光分子鏈為5’ -SH-AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-熒光分子；所述的熒光分子為Cy3或Cy5 ； 其中，所述的寡核苷酸鏈為5’ -SH-AAAAAAAAAAAAAAA-生物素。
2.權(quán)利要求I所述的熒光分子修飾的納米銀探針的制備方法，其特征在于，它包括如下步驟 (1)在冰浴條件下，將2-20mmol/L硝酸銀溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氫化鈉溶液中，硝酸銀與硼氫化鈉的反應摩爾比為I :3，不斷攪拌至反應完全，然后補加硼氫化鈉溶液，補加的硼氫化鈉的摩爾量為上述參與反應的硼氫化鈉的摩爾量的7%，繼續(xù)攪拌至室溫，得到納米銀溶液； (2)將熒光分子鏈和寡核苷酸鏈按摩爾比(1 99):(1 9)加入步驟(I)得到的納米銀溶液中，靜置10 24小時，熒光分子鏈和寡核苷酸鏈的總摩爾量與納米銀摩爾量之比為(100-1000):1 ； 所述的熒光分子鏈，其核苷酸序列為5，AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其5，端由巰基修飾，3’端由熒光分子修飾，所述的熒光分子為Cy3或Cy5 ； 所述的寡核苷酸鏈，其核苷酸序列為5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巰基修飾，3’端由生物素標記； (3)向步驟(2)得到的混合體系中加入IXPBS緩沖溶液，使得混合體系中的PBS緩沖溶液的濃度為0. 1XPBS，靜置3 10小時； (4)向步驟(3)得到的混合體系中加入f5mol/L氯化鈉溶液，靜置2 4小時，重復加入氯化鈉溶液與靜置的步驟廣4次，使得氯化鈉的終濃度為0. ro. 3mol/L ； (5)將步驟(4)得到的混合體系靜置24 72小時，取上清液； (6)將步驟(5)得到的上清液經(jīng)離心去除上清，取沉淀加入IXPBS緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟2 4次，IXPBS緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的0. I飛倍；最后離心得到的沉淀用IXPBS緩沖溶液重懸即得備用探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光分子修飾的納米銀探針的制備方法，其特征在于，步驟(6)中，所述的離心條件為10000 20000rpm條件下離心10 30分鐘。
4.權(quán)利要求I所述的熒光分子修飾的納米銀探針在制備檢測鏈霉親和素的試劑中的應用。
5.一種用于檢測鏈霉親和素的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含如下試劑熒光分子修飾的納米銀探針、磷酸鹽緩沖液、Tween-20、鏈霉親和素、硝酸銀、氫醌、牛血清白蛋白溶液、醛基片基。
6.權(quán)利要求5所述的用于檢測鏈霉親和素的試劑盒在檢測鏈霉親和素中的應用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，利用檢測鏈霉親和素的試劑盒檢測鏈霉親和素含量的具體方法，依次順序包括如下步驟 (I)配制溶液 稀釋液將20 X PBS用二次水稀釋20倍至IXPBS ； 洗滌液1 XPBS溶液按0. 05%的體積比加入吐溫-20溶液；陰性對照將0. Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中，得lmg/ml BSA溶液； 封閉液將Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中即得10mg/ml BSA封閉液； 熒光增強液18. 2mmol/L硝酸銀和I. 82mmol/L氫醌等體積混合； 鏈霉親和素標準溶液配制不同濃度的鏈霉親和素標準樣品溶液； 探針用I XPBS溶液配制I. 3nmol/L的熒光分子修飾的納米銀探針； (2)將不同濃度的鏈霉親和素標準溶液，待測樣品和陰性對照在醛基片上點樣，分別為25iU，4°C條件下固定過夜； (3)每孔加入10 2001^封閉液，在371條件下封閉廣3小時，用洗滌液蕩洗5 151^11，洗滌3 4次，拍干； (4)每孔加入I.3nmol/L熒光分子修飾的納米銀探針30 y L，在37°C條件下反應3小時，用洗滌液蕩洗5 15min，洗滌3 4次，拍干； (5)每孔加入30y L熒光增強液，避光反應f 8min，去離子水沖洗3 4遍，拍干； (6)用Luxscan-10K/AMicroarray Scanner生物芯片掃描儀掃描,不同濃度的鏈霉親和素標準樣品溶液對應不同的熒光信號強度，得到鏈霉親和素的標準曲線，由標準曲線計算得到樣品中鏈霉親和素的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熒光分子修飾的納米銀探針。納米銀探針以直徑為10~30nm的納米銀球為內(nèi)核，銀球外表面鍵合有熒光分子鏈和寡核苷酸鏈。本發(fā)明還公開了包含上述探針的試劑盒與在檢測鏈霉親和素中的應用。本發(fā)明的納米銀探針耦合熒光增強液的方法能大大提高熒光檢測的靈敏度，不需要通過改變儀器的結(jié)構(gòu)來提高檢測性能，巧妙地提高了檢測能力。此種探針的合成及修飾方法成熟，熒光增強液廉價易得，兩者的聯(lián)合使用可以得到驚人的結(jié)果。為蛋白質(zhì)的熒光分析檢測提供了一種極好的信號放大的方法。
文檔編號C12N15/11GK102796737SQ201210303189
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者許丹科, 李慧, 魏霞, 羌維兵, 李鐘卉 申請人:南京大學