專利名稱：一種定性檢測松材線蟲的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及松材線蟲的檢測方法，具體涉及一種定性檢測松材線蟲的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
松材線蟲病又稱松樹萎蔫病。是松樹的一種毀滅性流行病。在我國松褐天牛(Monochamus alternatus)是它的主要傳媒昆蟲。致病力強(qiáng)，寄主死亡速度快；一旦發(fā)生，治理難度大。松樹感染松材線蟲病40天即可死亡，受害林分從松樹發(fā)病到整片松林毀滅只需3-5年的時(shí)間，且傳播蔓延迅速。它不僅給國民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失，也破壞了自然景觀及生態(tài)環(huán)境，對我國豐富的松林資源構(gòu)成嚴(yán)重威脅。自1982年發(fā)現(xiàn)以來，快速擴(kuò)散，對我國南方數(shù)百萬公頃的松林構(gòu)成毀滅性威脅。目前仍無有效的防治辦法，被稱為松樹的“癌癥”。國內(nèi)外均將該病列為重要的植物檢疫對象。 目前松材線蟲的檢驗(yàn)方法主要是選取木片或木屑，加水浸泡24小時(shí)，取下部浸泡液離心，取其沉淀液置于解剖鏡下，對照松材線蟲的形態(tài)特征進(jìn)行檢查鑒定，該方法檢測時(shí)間長，對操作人員有一定專業(yè)要求。因此迫切需要種，快速、簡便、準(zhǔn)確檢測松材線蟲的方法。在中國專利申請200710092787. 9中，公開了一種松材線蟲分子檢測快速制樣方法，是專門針對對林業(yè)影響巨大的松材線蟲而建立起的快速制樣的方法。該方法直接提取疫木中松材線蟲DNA，配合PCR技術(shù)，可以檢測出I. 5g木屑中的I條松材線蟲，時(shí)間僅需要3h，效果穩(wěn)定可靠，但其儀器比較昂貴。在中國專利申請200810134583. I中，公開了一種交叉引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法及用于擴(kuò)增靶核酸序列的試劑盒及其應(yīng)用，其特點(diǎn)是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)6種(3對分別為I對交叉擴(kuò)整引物、I對剝離引物、I對檢測引物)特異引物，引物尾端交叉互換序列，利用鏈置換DNA聚合酶(如，但不限于，Gst DNA聚合酶)在恒溫條件即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。不需要模板的變性、多次溫度循環(huán)等過程。在中國專利申請200610003429. I中，公開了一種核酸薄膜層析快速檢測方法及其試紙條及其用途，將特異性抗體A吸附于有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；將另一種特異性抗體一無色抗B抗體固定于膜上形成檢測線；待測核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，將所使用的探針或是引物用A抗原或B抗原標(biāo)記，形成擴(kuò)增物、探針、引物、抗原A、抗原B的復(fù)合物，將該復(fù)合物與吸附有色顆粒的抗體A結(jié)合，得到的該有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)血管現(xiàn)象眼纖維膜向上流動只抗體B檢測條時(shí)，與線條上的抗體B結(jié)合，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條。在中國專利申請200610109620. 4中，公開了一種全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置，在其中使用了中國專利申請200610003429. I的試紙條，達(dá)到了全封閉檢測的效果
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種定性檢測松材線蟲的試劑盒，使其具有重復(fù)性好、快速、靈敏度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述試劑盒定性檢測松材線蟲的方法。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種定性檢測松材線蟲的試劑盒，試劑包括DNA提取液，松材線蟲核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，陽性對照和陰性對照；其中，陽性對照為含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質(zhì)粒，陰性對照為無菌雙蒸水；
所述的松材線蟲核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的組成為0. Γ0. 2ymol正向外圍引物，
O.Γ0. 2ymol反向外圍引物，O. Γθ. 5ymol正向交叉引物，O. Γθ. 5ymol反向交叉引物，O. I O. 5 μ mol 正向探針,O. I O. 5 μ mol 反向探針，I 6mmol MgSO4,0. 2 0. 4mmol dNTPs 溶液,6 10U Gst DNA聚合酶,2 μ L 10XThermol buffer,無菌雙蒸水補(bǔ)足到16 μ L。
所述的正向外圍引物序列為5 ’ -TCCTCACCTGGCTCTT-3 ’；反向外圍引物序列為’-CTAAACTCCCCATCTC-3’;兩條探針的序列分別為正向5’端Biotin標(biāo)記探針5_biotin-TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向 3’ 端異硫氰酸熒光素(FitC)標(biāo)記探針 5- AGGCGTTCACCAGT-FITC ;擴(kuò)增交叉引物分別為反向交叉引物5’ - GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC-3 ’，正向交叉弓丨物 5 ’ -GACGTCGCATGTAGC-3，。所述的IOXThermol buffer 的組分為20mM Tris-HClUOmM KClUOmM(NH4)2S04、2mM MgSO4、質(zhì)量濃度為 0. 1% 的 Triton Χ-100，ρΗ8· 8 ；
所述的含有松材線蟲BxSl基因的DNA片段為長193bp的基因序列，具體序列如SEQ IDNO: 7(TCCTCACCTGGCTCTTCGGCCGTTCCGCTTTGGCCTTATTCCGACGTCGCATGTAGCCGTGGATGGAATGCCGACCCCTGGCCGGTCTTTTCGGCCACACCACCTTCAACGAGGCGTTCACCAGTTGGCCGTCCCGGTTCTCGACCACAGAGTACGATGGAGGAGTAATGGTTGACTGAGATGGGGAGTTTAG)所示。所述的含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質(zhì)粒，由以下方法制備
(1)利用正向外圍引物和反向外圍引物，以松材線蟲的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
(2)純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
(3)將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒構(gòu)建質(zhì)粒；
(4)抽提質(zhì)粒，定量并稀釋至IO5拷貝，-20°C保存。試劑盒定性檢測松材線蟲的方法，包括以下步驟
a)用DNA提取液從待檢測的標(biāo)本中提取DNA；
b)以提取得到的DNA作為模板，加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，對照PCR管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)陽性模板和標(biāo)準(zhǔn)陰性模板，在60 65°C下擴(kuò)增反應(yīng)60 65min ；
c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測裝置中進(jìn)行檢測，15min以后判讀結(jié)果。步驟b)中，63°C下擴(kuò)增反應(yīng)60min。本發(fā)明提供了利用核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測松材線蟲的試劑盒，對不同的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，如引物和探針的濃度，Mg2+濃度，反應(yīng)溫度等的優(yōu)化，并將本發(fā)明與核酸檢測試紙條檢測系統(tǒng)相結(jié)合，建立了松材線蟲核酸恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測的方法。該試劑盒的靈敏度可在每個反應(yīng)體系中檢出100拷貝，可以滿足快速檢測松材線蟲的要求。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的定性檢測松材線蟲的試劑盒及其檢測方法，利用核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測松材線蟲，對不同的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使其靈敏度可在每個反應(yīng)體系中檢出100拷貝。并通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)檢測結(jié)果無顯著性差異，具有良好的重復(fù)性。且對樣本的檢測僅僅需要2h就能完成，大大縮短檢測時(shí)間。同時(shí)本試劑盒只需要I人就可以完成所有的操作過程，可一次性檢測一個到數(shù)百個樣本，這樣也減少了人力的浪費(fèi)?？梢詽M足快速檢測松材線蟲的要求，具有很好的實(shí)用性。


圖I是利用實(shí)施例I試劑盒檢測松材線蟲的特異性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖中，1、2、3、4依次為擬松材線蟲、松材線蟲、陽性對照、陰性對照。圖2是利用實(shí)施例I試劑盒檢測松材線蟲的靈敏度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖中，1-6依次為松材線蟲質(zhì)粒IO4拷貝、IO3拷貝、IO2拷貝、10拷貝、陽性對照(IO5拷貝)、陰性對照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例I
定性檢測松材線蟲的試劑盒,組成如下
(I)DNA提取試劑可以為常規(guī)的市售DNA提取試劑，優(yōu)選使用杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司的無儀器核酸提取試劑盒。(2)松材線蟲核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液兩條外圍引物(各O. I μ mol)，兩條探針(各
O.5 μ mol)，兩條交叉引物(各 O. 5 μ mol)，10 X Thermol buffer, MgSO4 (6mmol)，dNTPs 溶液(O. 4mmol)，Bst DNA聚合酶(IOU)，無菌雙蒸水補(bǔ)足16 μ L。 其中正向外圍引物序列為5 ’ -TCCTCACCTGGCTCTT-3 ’ ；反向外圍引物序列為’-CTAAACTCCCCATCTC-3’;兩條探針的序列分別為正向5’端Biotin標(biāo)記探針5_biotin-TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向 3’ 端異硫氰酸熒光素(FitC)標(biāo)記探針 5- AGGCGTTCACCAGT-FITC ;擴(kuò)增交叉引物分別為反向交叉引物5 ’ - GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC-3 ’，正向交叉弓丨物 5 ’ -GACGTCGCATGTAGC-3，。IOXThermol buffer 的組成20mM Tris-HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4,0. l%Triton X-IOO0以上所有的引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。(3)陽性對照含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質(zhì)粒。BxSl基因DNA片段序列如 SEQ ID NO:7 所示。陽性對照的制備步驟利用兩條外圍引物和以松材線蟲的基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因；用Promega公司的PCR純化試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過Promega公司的T_easy質(zhì)粒試劑盒,構(gòu)建含有目的基因片段的質(zhì)粒；用分光光度計(jì)測A28tl定量并稀釋至IO5拷貝，_20°C保存。(4)陰性對照無菌雙蒸水。實(shí)施例2
用實(shí)施例I的試劑盒定性檢測松材線蟲，具體方法為
(I)用DNA提取試劑盒從待檢測的標(biāo)本中提取DNA。其具體方案參見DNA提取試劑盒使用說明。(2)取4 μ L標(biāo)本DNA作為模板加入到裝有16 μ L松材線蟲核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，對照PCR管中分別加入等體積的陽性對照模板和陰性對照模板，在63°C進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)60min。(3)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測裝置(試紙條，參見CN1888902A或者CN1811447A)中進(jìn)行檢測，15min以后判讀結(jié)果。當(dāng)樣本中含有松材線蟲核酸時(shí)，試紙條的檢測線上呈陽性。反復(fù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，檢測結(jié)果無顯著性差異，說明本試劑盒的不同批次間的檢測結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。上述實(shí)施例說明，用本發(fā)明的試劑盒來檢測重復(fù)性好’且對樣本的檢測僅僅需要2h就能完成，大大縮短檢測時(shí)間。同時(shí)本試劑盒只需要I人就可以完成所有的操作過程，可一次性檢測一個到數(shù)百個樣本，這樣也減少了人力的浪費(fèi)。
實(shí)施例3
用實(shí)施例I的試劑盒檢測松材線蟲的專一性。按照實(shí)施例2的方法檢測松材線蟲、擬松材線蟲和陽性對照品；結(jié)果如圖I。從圖I測試結(jié)果可見，用本發(fā)明試劑盒檢測松材線蟲核酸具有很強(qiáng)的專一性。實(shí)施例4
用實(shí)施例I試劑盒檢測松材線蟲核酸的靈敏度。先提取含松材線蟲基因組DNA，然后用兩條外圍擴(kuò)增引物利用PCR擴(kuò)增目的基因片段(具體序列如SEQ ID NO: 7所示);再將擴(kuò)增出來的基因片段用V-easy載體構(gòu)建含有目的片段的質(zhì)粒，對其進(jìn)行定量。并對定量后的質(zhì)粒，按照濃度梯度稀釋至濃度為IO4拷貝、IO3拷貝、IO2拷貝、10拷貝，采用實(shí)施例2的方法來確定實(shí)施例I試劑盒用于檢測松材線蟲核酸的靈敏度。結(jié)果如圖2所示，圖中1-6分別表示IO4拷貝、IO3拷貝、IO2拷貝、10拷貝、陽性對照和陰性對照，可以發(fā)現(xiàn)該試劑盒可在反應(yīng)體系中檢出IO2拷貝的質(zhì)粒稀釋液，具有很高的靈敏度，可以滿足快速檢測松材線蟲的要求。
權(quán)利要求
1.一種定性檢測松材線蟲的試劑盒，其特征在于，試劑包括DNA提取液，松材線蟲核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，陽性對照和陰性對照；其中，陽性對照為含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質(zhì)粒，陰性對照為無菌雙蒸水； 所述的松材線蟲核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的組成為0. Γ0. 2ymol正向外圍引物，·O. Γ0. 2ymol反向外圍引物，O. Γθ. 5ymol正向交叉引物，O. Γθ. 5ymol反向交叉引物，·O.I O. 5 μ mol 正向探針,O. I O. 5 μ mol 反向探針，I 6mmol MgSO4,0. 2 O. 4mmol dNTPs 溶液,6 IOU Gst DNA聚合酶,2 μ L 10XThermol buffer,無菌雙蒸水補(bǔ)足到16 μ L ; 所述的正向外圍引物序列為5’ -TCCTCACCTGGCTCTT-3’ ；反向外圍引物序列為’-CTAAACTCCCCATCTC-3’;兩條探針的序列分別為正向5’端Biotin標(biāo)記探針5_biotin-TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向 3’ 端異硫氰酸熒光素(FitC)標(biāo)記探針 5- AGGCGTTCACCAGT-FITC ;擴(kuò)增交叉引物分別為反向交叉引物5’ - GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC-3 ’，正向交叉弓丨物 5 ’ -GACGTCGCATGTAGC-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定性檢測松材線蟲的試劑盒，其特征在于所述的IOXThermol buffer 的組分為20mM Tris-HClUOmM KCl UOmM (NH4) 2S04、2mM MgS04、質(zhì)量濃度為 O. 1% 的 Triton Χ-100，ρΗ8· 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定性檢測松材線蟲的試劑盒，其特征在于所述的含有松材線蟲BxSl基因的DNA片段為長193bp的基因序列，具體序列如下SEQ ID N0:7所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的松材線蟲檢測試劑盒，其特征在于所述的含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質(zhì)粒，由以下方法制備 (1)利用正向外圍引物和反向外圍引物，以松材線蟲的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (2)純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒構(gòu)建質(zhì)粒； (4)抽提質(zhì)粒，定量并稀釋至IO5拷貝，-20°C保存。
5.權(quán)利要求I所述的試劑盒定性檢測松材線蟲的方法，其特征在于，包括以下步驟 a)用DNA提取液從待檢測的標(biāo)本中提取DNA； b)以提取得到的DNA作為模板，加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，對照PCR管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)陽性模板和標(biāo)準(zhǔn)陰性模板，在60 65°C下擴(kuò)增反應(yīng)60 65min ； c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測裝置中進(jìn)行檢測，15min以后判讀結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒定性檢測松材線蟲的方法，其特征在于步驟b)中，·63 °C下擴(kuò)增反應(yīng)60min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定性檢測松材線蟲的試劑盒及其檢測方法；試劑盒的試劑包括DNA提取液，松材線蟲核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，陽性對照和陰性對照；其中，陽性對照為含有松材線蟲BxS1基因DNA片段的質(zhì)粒，陰性對照為無菌雙蒸水。該試劑盒利用核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測松材線蟲，靈敏度可在每個反應(yīng)體系中檢出100拷貝；經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果無顯著性差異，具有良好的重復(fù)性；且對樣本的檢測僅僅需要2h就能完成，大大縮短檢測時(shí)間；同時(shí)本試劑盒只需要1人就可以完成所有的操作過程，可一次性檢測一個到數(shù)百個樣本，這樣也減少了人力的浪費(fèi)；可以滿足快速檢測松材線蟲的要求，具有很好的實(shí)用性。
文檔編號C12Q1/68GK102827933SQ20121030353
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者葉建仁, 胡林, 陳鳳毛, 侯建華, 吳小芹, 孫波, 黃麟, 詹國輝, 徐高連, 賀君麗, 范椰, 吳芳 申請人:南京林業(yè)大學(xué), 杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司