專(zhuān)利名稱(chēng)：一種安全快速提取茶樹(shù)老葉片基因組dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是ー種安全快速提取茶樹(shù)老葉片基因組DNA的方法。
背景技術(shù)：
DNA分子標(biāo)記技術(shù)是研究茶樹(shù)起源、分子演化、遺傳多祥性、品種鑒定的ー個(gè)重要工具。而進(jìn)行這些研究的先決條件是高質(zhì)量基因組DNA的提取。由于茶樹(shù)葉片富含酚類(lèi)物質(zhì)，鮮葉中酚類(lèi)物質(zhì)含量可達(dá)干物質(zhì)總量的18% 36%，且含有大量的生物堿及其它多種次生物質(zhì)，這就給為DNA的提取帶來(lái)了極大困難，如酚類(lèi)物質(zhì)可引起DNA降解、變色并影響后續(xù)分析，殘存的多糖能抑制PCR反應(yīng)。目前常見(jiàn)的茶樹(shù)基因組DNA提取方法有SDS法及CTAB法，雖然這些方法可以成功 地從茶樹(shù)幼葉、成熟葉片提取基因組DNA，但是這些提取方法通常使用有毒試劑氯仿/苯酚去除DNA上殘留蛋白質(zhì)及其他污染物，而且這些方法的操作步驟繁瑣，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，通常在3小時(shí)以上。另外，由于茶樹(shù)不同葉齡間次生代謝產(chǎn)物的異質(zhì)程度都較高，導(dǎo)致了上述這些提取方法往往不能很好地應(yīng)用于茶樹(shù)老葉片基因組DNA提取，而且目前現(xiàn)有技術(shù)還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)茶樹(shù)老葉片基因組DNA提取的方法的報(bào)道。因此，我們迫切地需要構(gòu)建ー個(gè)安全快速提取茶樹(shù)老葉片基因組DNA的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在不適合老葉片、使用有毒試劑及耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)和不足，針對(duì)茶樹(shù)老葉富含多酚、多糖的特點(diǎn)，提供ー種安全快速提取茶樹(shù)老葉片基因組DNA的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下ー種安全快速提取茶樹(shù)老葉片基因組DNA的方法，包括以下步驟(I)將O. 3g茶樹(shù)葉片于液氮研磨至粉末狀，再加入800 μ L預(yù)熱DNA提取緩沖液，搖勻后于65°C水浴30min ;所述DNA提取緩沖液由I. 5% (w/v) SDS (pH 5. 5), IOOmmol/LTris-HCl (ρΗ8· O)，40mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)，lmol/L NaCl，2· 5% PVP, IOmmoI/L β -巰基こ醇組成；所述茶樹(shù)葉片為新鮮的茶樹(shù)老葉片；(2)加入 125 μ L 5mol/LKAC,搖勻后冰浴 20min ；(3)待反應(yīng)充分后，I. 2 X 10Vmin離心3min，將上清液加入吸附柱中并裝入收集管，I. 2X 104r/min 離心 Imin ；(4)將上述收集管中濾液再次加入吸附柱中并裝入收集管，1.2X104r/min離心lmin，棄廢液；(5)向吸附柱加入800 μ L的70%こ醇，I. 2X 104r/min離心lmin,棄廢液;(6)再次加入800 μ L的70%こ醇，I. 2 X 104r/min離心lmin,棄廢液；(7)重新將吸附柱裝入收集管中，I. 2X 104r/min離心3min，除去剩余こ醇；(8)取出吸附柱，于50°C放置5min ；
(9)將吸附柱放入新離心管中，加入60 μ L TE，于40°C放置5min，l. 2X104r/min離心3min ;離心管中液體為提取的茶樹(shù)基因組DNA。所述的方法，步驟(I)中，液氮研磨后迅速加入DNA提取緩沖液。茶樹(shù)老葉富含次生代謝物質(zhì)，如酚類(lèi)物質(zhì)可引起DNA降解、變色并影響后續(xù)分析，殘存的多糖能抑制PCR反應(yīng)。為了消除這些影響，采取以下做法①改變DNA提取緩沖液組成，加入2. 5% PVPUOmmoI/L β -巰基こ醇來(lái)防止茶樹(shù)葉片中的多酚化合物氧化褐變，カロΛ lmol/L NaCl來(lái)增加提取液中DNA的含量；②在裂解后，加入5mol/L KAC去除大量多糖；③采用吸附柱特異結(jié)合DNA來(lái)純化所提DNA，進(jìn)ー步控制了所提DNA溶液中的多糖含量及防止酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入所提DNA溶液。因此，本發(fā)明的方法可以從茶樹(shù)老葉片提取高質(zhì)量的基因組DNA，滿足后續(xù)的PCR分析。(I)本發(fā)明可以從新鮮茶樹(shù)老葉片提取高質(zhì)量的基因組DNA。(2)與已有的SDS、CTAB法相比，本發(fā)明可以通過(guò)特異性結(jié)合DNA的吸附柱純化
DNA,消除有毒有害試劑酚/氯仿的使用，保護(hù)操作人員的身體安全。(3)與已有的SDS、CTAB法相比，本發(fā)明可以快速提取茶樹(shù)葉片基因組DNA，用時(shí)短，在2小時(shí)內(nèi)可以完成，而已有方法用時(shí)3 4小吋。


圖I為采用本發(fā)明方法提取茶樹(shù)老葉片DNA的電泳圖。圖2為采用本發(fā)明方法提取茶樹(shù)老葉片DNA的RAPD電泳圖。圖3為采用本發(fā)明方法提取的茶樹(shù)老葉片DNA的ISSR電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。I材料與方法I)材料新鮮的茶樹(shù)老葉片采自種植在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)、省級(jí)名山良種場(chǎng)內(nèi)12個(gè)茶樹(shù)栽培品種(系)，分別為安吉白茶、青心烏龍、古藺牛皮茶、烏牛早、蜀永307、南江4號(hào)、福鼎大白茶、黔湄502、龍井43、蒙山11號(hào)、鐵觀音及英紅2號(hào)。2) DNA提取方法取將O. 3g茶樹(shù)老葉片，加液氮沒(méi)過(guò)葉片表面，研磨至粉末狀，置于I. 5mL離心管中，再立即加入800 μ L預(yù)熱DNA提取緩沖液(DNA提取緩沖液由1.5% (W/V) SDS (ρΗ5. 5)，IOOmmoI/L Tris-HCl(ρΗ8. O),40mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，lmol/L NaCl,2. 5 % PVP，IOmmol/L β-巰基こ醇組成)，搖勻后于65°C水浴30min ;加入125yL 5mol/LKAC，搖勻后冰浴20min ;待反應(yīng)充分后，I. 2X 104r/min離心3min，將上清液加入吸附柱中并裝入收集管，I. 2X104r/min離心Imin ;將上述收集管中濾液再次加入吸附柱中并裝入收集管，
I.2 X 104r/min 離心 lmin,棄廢液;向吸附柱加入 800 μ L 的 70% (V/V)こ醇，I. 2 X 104r/min離心lmin,棄廢液。;再次加入800 μ L的70% (V/V)こ醇,I. 2X 104r/min離心lmin,棄廢液；重新將吸附柱裝入收集管中，12000r/min離心3min，除去剰余こ醇；取出吸附柱，于50°C放置5min ;將吸附柱放入I. 5mL新離心管中，加入60 μ L TE，于40°C放置5min，I. 2X104r/min離心3min。離心管中液體為提取的茶樹(shù)老葉片基因組DNA。 3) DNA純度、得率及電泳分析測(cè)定茶樹(shù)老葉片DNA在260nm、280nm的光密度值，并分別通過(guò)A26tl、A26(I/A28(I來(lái)計(jì)算所提DNA的純度及得率。所提取DNA在O. 8%瓊脂糖凝膠上電泳。4) PCR擴(kuò)增及電泳分析(I) RAPD-PCR 擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25yL，其中包括2ng/yL DNA，O. 2 μ mol/L引物(引物序列為ACCGCGAAGG)，2 X Taq PCR MasterMix(TIANGEN) PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min，然后41個(gè)循環(huán)(94°C變性50s，36°C退火40s，72°C延伸90s)，最后72°C延伸7min。(2) ISSR-PCR 擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25 μ L，其中包括IOng DNA, O. 6 μ mol/L引物(引物序列為CTCTCTCTCTCTCTCTCTGG)，2 X Taq PCR MasterMix (TIANGEN)。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后41個(gè)循環(huán)(94°C變性45s，45°C退火lmin，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸7min。RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物、ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物在2. 5%瓊脂糖凝膠上電泳。2、結(jié)果與分析I)茶樹(shù)老葉片DNA純度及得率采用本發(fā)明方法提取的茶樹(shù)老葉片DNA的A260ZA280比值在I. 61 I. 86之間，得率在34. 18 μ g/g 59. 98 μ g/g之間，表明所提取DNA純度及產(chǎn)量較高，見(jiàn)表I。采用本發(fā)明方法提取的茶樹(shù)老葉片DNA的的分子量大小約為23kb，條帶清晰、完整，而且無(wú)可見(jiàn)DNA降解或RNA污染，見(jiàn)圖I。表I 12個(gè)茶樹(shù)品種(系)老葉片DNA的得率及純度
權(quán)利要求
1.ー種安全快速提取茶樹(shù)老葉片基因組DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將茶樹(shù)葉片于液氮研磨至粉末狀，再加入800μ L預(yù)熱DNA提取緩沖液，搖勻后于 65 °C 水浴 30min ;所述 DNA 提取緩沖液由 I. 5 % (w/v) SDS (pH 5. 5)，IOOmmoI/LTris-HCl (pH8. O), 40mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，lmol/L NaCl,2. 5% PVP, lOmmol/L β-巰基こ醇組成；所述茶樹(shù)葉片為新鮮的茶樹(shù)老葉片；(2)加入125 μ L 5mol/LKAC，搖勻后冰浴 20min ； (3)待反應(yīng)充分后，I.2X 10Vmin離心3min，將上清液加入吸附柱中并裝入收集管，I. 2 X 104r/min 離心 Imin ； (4)將上述收集管中濾液再次加入吸附柱中并裝入收集管，I.2XlOVmin離心lmin，棄廢液； (5)向吸附柱加入800μ L的70%こ醇，I. 2Χ 104r/min離心lmin,棄廢液； (6)再次加入800μ L的70%こ醇，I. 2 X 104r/min離心lmin,棄廢液； (7)重新將吸附柱裝入收集管中，I.2XlOVmin離心3min，除去剰余こ醇； (8)取出吸附柱，于50°C放置5min； (9)將吸附柱放入新離心管中，加入60μ L TE，于4(rC放置5min，1.2X104r/min離心3min ;離心管中液體為提取的茶樹(shù)基因組DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，液氮研磨后迅速加入DNA提取緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種安全快速提取茶樹(shù)老葉片基因組DNA的方法，包括以下步驟將茶樹(shù)葉片于液氮研磨至粉末狀，再加入800μL預(yù)熱DNA提取緩沖液，搖勻后于65℃水浴30min；加入125μL 5mol/LKAC，搖勻后冰浴20min；待反應(yīng)充分后，離心3min，將上清液加入吸附柱中并裝入收集管，離心1min；將上述收集管中濾液再次加入吸附柱中并裝入收集管，離心1min，棄廢液；向吸附柱加入800μL的70％乙醇，離心1min，棄廢液；再次加入800μL的70％乙醇，離心1min，棄廢液；重新將吸附柱裝入收集管中，離心3min，除去剩余乙醇；取出吸附柱，于50℃放置5min；將吸附柱放入新離心管中，加入60μL TE，于40℃放置5min，離心3min；離心管中液體為提取的茶樹(shù)基因組DNA。安全、快速提取茶樹(shù)葉片基因組DNA。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102796733SQ20121030375
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者齊桂年, 陳盛相, 李成磊 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 齊桂年