專(zhuān)利名稱：一種利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。
背景技術(shù)：
乳酸作為世界上公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，廣泛應(yīng)用于食品及與食品相關(guān)的行業(yè)。由于人體和動(dòng)物體內(nèi)只含有L-乳酸分解酶，只能代謝自身產(chǎn)生或攝入的L-乳酸，因此L-乳酸在食品、飼料和醫(yī)藥行業(yè)中備受重視。研究還發(fā)現(xiàn)以L-乳酸為原料制得的生物可降解材料一聚乳酸具有良好的初期機(jī)械性能，透明性、抗菌性和防霉性；其膜材具有良好的透氧性和透水蒸汽性，使用壽命可達(dá)2年 3年。聚乳酸可用來(lái)制造塑料食品器具和食品包
目前，L-乳酸的生產(chǎn)方法主要為發(fā)酵法。利用根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸存在轉(zhuǎn)化率低，副產(chǎn)物多，發(fā)酵過(guò)程中需要通氣攪拌使生產(chǎn)成本上升等不足?；谏鲜鲈?，近年來(lái)人們逐漸將目光轉(zhuǎn)向同型發(fā)酵的乳酸菌。其中，鼠李糖乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品光學(xué)純度高，已成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)之一。在乳酸分批發(fā)酵中，提高底物濃度可以有效提高發(fā)酵液中乳酸濃度，降低下游過(guò)程的成本。因此，研究耐糖鼠李糖乳桿菌發(fā)酵特性不僅對(duì)L-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)將起到重要的作用，而且還將有助于推動(dòng)聚乳酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，本發(fā)明以鼠李糖乳桿菌為出發(fā)菌株，在高濃度葡萄糖條件下發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸進(jìn)行研究。本發(fā)明考察了接種量、發(fā)酵溫度、PH和中和劑對(duì)乳酸發(fā)酵的影響。I. 一種利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于發(fā)酵時(shí)，在16 L發(fā)酵罐中加入12 L發(fā)酵培養(yǎng)基，以一定量的接種量接入種子液。在一定的發(fā)酵溫度下發(fā)酵，pH由25%的中和劑控制在一定值，轉(zhuǎn)速為200 r/min。2.其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法為葡萄糖120.0 g，糖蜜37.0 mL，玉米漿43.0
g,Tween 80 15 mL, MnSO4 0.3 g,蒸懼水1000 mL。葡萄糖、糖蜜和玉米衆(zhòng)分別滅菌,調(diào)節(jié)合適pH值,115°C滅菌20 min。3.種子液的培養(yǎng)方法為將保存菌種傳代活化后，以12%的接種量接入種子培養(yǎng)基，在37°C恒溫培養(yǎng)振蕩器(200 r/min)中培養(yǎng)20 h。4.種子培養(yǎng)基的配制方法為酵母粉12 g，葡萄糖80 g，蒸餾水1000 mL，酵母粉和葡萄糖分別滅菌，121°C滅菌20 min，冷卻后混合。5.最佳接種量為6%。6 發(fā)酵溫度最佳為40°C。7.最佳發(fā)酵pH為6. O。8.最佳中和劑為氨水。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明以一株鼠李糖乳桿菌為研究對(duì)象，考察了在發(fā)酵罐中的分批發(fā)酵條件，并且在較高的初糖濃度條件下得到了滿意的結(jié)果。


圖I接種量對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。 圖2發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。圖3 pH對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。圖4不同中和劑對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但對(duì)本發(fā)明沒(méi)有限制。本發(fā)明所用的菌株為鼠李糖乳桿菌，購(gòu)買(mǎi)于ACCC，編號(hào)為ACCC10534。實(shí)施例I
本實(shí)施案例說(shuō)明接種量對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，通常采用較大的接種量可縮短細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的合成提前。但是接種量過(guò)大，會(huì)使菌種生長(zhǎng)過(guò)快，培養(yǎng)液粘度增加，菌體早衰，造成發(fā)酵后勁不足，影響產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率。反之，接種量過(guò)少，菌體增長(zhǎng)緩慢，會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期，不利于菌株高產(chǎn)。為此，確定最適接種量是十分必要的。選擇接種量分別為
3、6、9、12、15%進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖I。如圖I所示，當(dāng)接種量超過(guò)6%時(shí)，乳酸的產(chǎn)量變化不明顯。大多細(xì)菌由于接種量增加會(huì)引起營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，導(dǎo)致氧氣消耗抑制生長(zhǎng)，而這情況對(duì)該厭氧鼠李糖乳桿菌可能影響不大。從減小由種子液帶入到發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)菌體有抑制作用的代謝產(chǎn)物角度考慮選取最小的接種量，即6%接種量用于鼠李糖乳桿菌的乳酸發(fā)酵。實(shí)施例2
本實(shí)施案例說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，溫度不僅會(huì)影響各種酶反應(yīng)的速率，還會(huì)影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。發(fā)酵溫度升高酶反應(yīng)速率增大，生長(zhǎng)代謝加快，產(chǎn)物生成提前。但是溫度過(guò)高，酶本身容易失活，菌體加快衰老，最終影響產(chǎn)量。因此，發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)該維持適當(dāng)?shù)臏囟龋庞欣谌樗嵘a(chǎn)的順利進(jìn)行。分別采用36、40、441三個(gè)不同培養(yǎng)溫度，對(duì)發(fā)酵乳酸的影響進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為40°C時(shí)，乳酸產(chǎn)量最多，可是與在36°C發(fā)酵溫度下相比，乳酸產(chǎn)量提高不十分顯著。但考慮到40°C時(shí)乳酸產(chǎn)量有少許提高，并且較高的溫度在實(shí)際生產(chǎn)中也有利于減少冷卻水循環(huán)量和降低污染雜菌的機(jī)會(huì)，因此將發(fā)酵溫度選為400C。而溫度為44°C時(shí)，乳酸產(chǎn)量有較大減少，可能是溫度太高導(dǎo)致菌體提前進(jìn)入衰老期所至。實(shí)施例3
本實(shí)施案例說(shuō)明PH對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，在乳酸發(fā)酵過(guò)程中隨著乳酸的不斷積累，會(huì)使發(fā)酵液中的pH下降。pH的下降往往會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成。Goncalves等研究了 pH在5-6. 8之間時(shí)對(duì)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵乳酸的影響，發(fā)現(xiàn)pH對(duì)乳酸發(fā)酵速率的影響比最大比生長(zhǎng)速率對(duì)乳酸發(fā)酵速率的影響大，所以在發(fā)酵時(shí)為得到較高產(chǎn)量需要調(diào)控發(fā)酵液的pH。分別采用pH5. 0,5. 5,6. 0和6. 5對(duì)發(fā)酵乳酸的影響進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖3。
如圖3所示，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的pH為6.0時(shí)，乳酸產(chǎn)量最高。而當(dāng)pH高于5. 5時(shí)乳酸的產(chǎn)量差別不大，這表明耐糖乳桿菌適合PH范圍相對(duì)較寬。值得注意的是，當(dāng)pH為5.0時(shí)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的乳酸產(chǎn)量有較大下降。這可能是由于pH低于5. 5以下，乳酸以解離和非解離兩種狀態(tài)存在，非解離的乳酸分子可通過(guò)細(xì)胞膜使細(xì)胞內(nèi)部乳酸濃度增力口，從而降低了與代謝相關(guān)的酶活性，抑制了菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。實(shí)施例4
本實(shí)施案例說(shuō)明不同中和劑對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵過(guò)程中采用CaCO3作為中和劑，以維持最適PH值。但是乳酸鈣結(jié)晶細(xì)小，結(jié)晶過(guò)程不易控制，30%乳酸鈣殘留在結(jié)晶母液中，不能結(jié)晶出來(lái)，大量的副產(chǎn)物膏澮造成環(huán)境污染。因此，現(xiàn)在的乳酸發(fā)酵研究大都傾向采用NaOH或NH4OH作為中和劑，見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，用氨水作中和劑調(diào)節(jié)pH無(wú)論是在菌體生長(zhǎng)、生產(chǎn)L 一乳酸還是 部分被菌體作為氮源利用，促進(jìn)其快速增長(zhǎng)，而Na+的積累對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的抑制作用。同時(shí)，加入NH OH作為來(lái)中和劑乳酸的產(chǎn)量是NaOH的I. 6倍，這個(gè)差別可能是由于NaOH對(duì)乳桿菌乳酸生產(chǎn)存在較大抑制作用，并且NaOH的濃度較大進(jìn)入罐中對(duì)接觸的菌體有毒害作用。如果采用低濃度的NaOH會(huì)使發(fā)酵液稀釋效果加強(qiáng)，不利于后處理過(guò)程；而采用NH40H有利于用酯化法分離乳酸，因此本實(shí)驗(yàn)采用NH4OH作中和劑。
權(quán)利要求
1.一種利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于發(fā)酵時(shí)，在16 L發(fā)酵罐中加入12 L發(fā)酵培養(yǎng)基，以一定量的接種量接入種子液；在一定的發(fā)酵溫度下發(fā)酵，PH由25%的中和劑控制在一定值，轉(zhuǎn)速為200 r/min。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法為葡萄糖120.0g，糖蜜 37.0 mL,玉米衆(zhòng) 43. 0 g, Tween 80 15 mL, MnSO4 0. 3 g,蒸懼水 1000 mL ;葡萄糖、糖蜜和玉米漿分別滅菌，調(diào)節(jié)合適pH值，115°C滅菌20 min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，種子液的培養(yǎng)方法為將保存菌種傳代活化后，以12%的接種量接入種子培養(yǎng)基，在37°C恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)20 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，種子培養(yǎng)基的配制方法為酵母粉12g，葡萄糖80 g，蒸餾水1000 mL，酵母粉和葡萄糖分別滅菌，121°C滅菌20 min，冷卻后混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，接種量為6%。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵溫度為40°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵pH為6.O。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于中和劑為氨水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，本發(fā)明以鼠李糖乳桿菌為出發(fā)菌株，在高濃度葡萄糖條件下發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸進(jìn)行研究。本發(fā)明考察了接種量、發(fā)酵溫度、pH和中和劑對(duì)乳酸發(fā)酵的影響。
文檔編號(hào)C12P7/56GK102747112SQ201210253039
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月21日
發(fā)明者金雅新 申請(qǐng)人:太倉(cāng)市茂通化建有限公司