專利名稱：一種微小rna用于調(diào)控b7-h4基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微小RNA用于調(diào)控B7-H4基因表達(dá)。
背景技術(shù)：
腫瘤一直嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命，傳統(tǒng)的治療方法不盡如人意。免疫治療通過提高腫瘤的免疫原性，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，達(dá)到治療腫瘤的目的，是一種變被動為主動的生物治療方法。由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是抗腫瘤免疫的主要形式，機體通過對腫瘤抗原的特異性識別，激活T細(xì)胞，產(chǎn)生相應(yīng)的免疫殺傷作用。業(yè)已證實，T細(xì)胞的有效活化和功能介導(dǎo)需要雙重信號的協(xié)同作用一是抗原 肽-MHC復(fù)合物，由T細(xì)胞抗原受體(TCR)識別；二是協(xié)同刺激信號，由抗原遞呈細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞表面的協(xié)同刺激分子配體和受體對提供。其中，B7-CD28是迄今為止公認(rèn)的最基本的協(xié)同刺激信號，由表達(dá)在T細(xì)胞上的⑶28和表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞表面的⑶80和⑶86相互作用產(chǎn)生Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Tmmunol2002，2 (2) : 116-126.。經(jīng)過多年的研究，B7-⑶28協(xié)同刺激信號的內(nèi)容得到了極大的豐富，包括數(shù)個結(jié)構(gòu)和功能相似的配體和受體組成的B7-CD28家族，其中B7分子的主要成員有0)80、0)86、87-0(、87-!11、10)51^、87-!13 和87_!14等，受體包括0)28、(1'1^-4、10)5、？0-1和 BTLA 等Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH. The B7 family revisited. AnnuRev Immunol 2005, 23: 515-548.。這些協(xié)同刺激信號分子不僅提供促進(jìn)T細(xì)胞生長、分化和產(chǎn)生細(xì)胞因子的正性信號，同時還能通過提供負(fù)性信號來限制、終止和/或減弱T細(xì)胞應(yīng)答。T細(xì)胞的活化正是這種正性信號和負(fù)性信號相互平衡的結(jié)果Carreno BM, CollinsM. The B7 family of ligands and its receptors: new pathways for costimulationand inhibition of immune responses. Annu Rev Tmmunol 2002, 20: 29-53.。其中，負(fù)性信號主要是由B7家族的新成員B7-H1、B7-H3和B7-H4提供。如果這些負(fù)性協(xié)同刺激分子表達(dá)異?；蚬δ苷系K，就將導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展，如惡性腫瘤和自身免疫性疾病等。(B7S1、B7x、VTCNl)是2003年被發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激信號B7-CD28家族中的最新成員Sica GL, et al. B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulatesT cell immunity. Immunity 2003，18 (6) : 849-61.,主要通過抑制 T 細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞周期的進(jìn)程等方式來負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，同時它還可以促進(jìn)人體正常上皮細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，防止惡變表皮細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡，從而有利于腫瘤的發(fā)生和生長。目前，B7-H4已被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、肺癌和骨髓瘤等多種惡性腫瘤組織中存在高表達(dá)，且與患者預(yù)后及臨床病理參數(shù)密切相關(guān)Zou W，Chen L.Inhibitory B7-family molecules in the tumour microenvironment. Nat Rev Tmmunol2008，8(6) : 467-77。在腫瘤組織中B7-H4主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤性巨噬細(xì)胞。高表達(dá)B7-H4的前列腺癌更容易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，患者死亡率也更高Zang X，et al. B7-H3 andB7x are highly expressed in human prostate cancer and associated with diseasespread and poor outcome. Proc Natl Acad Sci USA 2007, 104 (49) : 19458-19463.，而高表達(dá)B7-H4的胃癌、卵巢癌和腎癌患者預(yù)后更差Jiang J, et al. Tumor expressionof B7—H4 predicts poor survival of patients suffering from gastric cancer.Cancer Tmmunol Immunother 2010, 59(11): 1707-1714·。目前對B7-H4在腫瘤組織中表達(dá)的調(diào)控機制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的某些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)對B7-H4的表達(dá)存在調(diào)節(jié)作用。IL-6和IL-IO能誘導(dǎo)B7-H4在單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓DC細(xì)胞上表達(dá)。DC細(xì)胞分化因子GM-CSF(粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子)和IL-4能降低IL-6和IL-IO對B7-H4表達(dá)的誘導(dǎo)作用Kryczek I, Zou L, Rodriguez P, et al. B7-H4 expression identifies anovel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. J ExpMed, 2006，203(4) :871-881.。與B7-H1不同，IFN-γ對B7-H4表達(dá)的影響卻很小。在人卵巢癌中，腫瘤相關(guān)Treg細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-6和IL-10，進(jìn)而刺激Β7-Η4以自分泌和/或旁分泌方式在APC上表達(dá)。然而，IL-4、IL-6、IL-IO和GM-CSF都不能誘導(dǎo)Β7-Η4在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)Kryczek I, Wei S，Zhu G, et al. Relationship between B7-H4, regulatory T cells, and patient outcome in human ovarian carcinoma. Cancer Res,2007， 67 (18):8900-8905.。廣泛表達(dá)于淋巴樣及非淋巴樣組織，但其蛋白質(zhì)在各種組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞表面誘導(dǎo)性表達(dá)Choi IH, et al.Genomic organization and expression analysis of B7—H4, an immune inhibitorymolecule of the B7 family. J Tmmunol 2003，171 (9) :4650-4654.。正常人類組織不表達(dá)或極低表達(dá)B7-H4，但在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)B7-H4高表達(dá)。由此提示，這種負(fù)性協(xié)同刺激分子蛋白在正常組織中的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，而這種調(diào)控機制在腫瘤中存在異常。因此，調(diào)控B7-H4表達(dá)有望成為一種新的抗腫瘤治療途徑，具有潛在應(yīng)用價值He C，et al.The inhibitory role of b7_h4 in antitumor immunity: association with cancerprogression and survival. Clin Dev Tmmunol 2011:695834.。是近年來發(fā)現(xiàn)于真核細(xì)胞中的一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3’ -UTR互補結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。越來越多的研究證實，miRNA在腫瘤組織中表達(dá)異常，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及患者治療反應(yīng)密切相關(guān)；如hsa-miR-21在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，與結(jié)直腸癌 M分期及患者預(yù)后密切相關(guān)SchetterAJ, Leung SY, Sohn JJ, et al. MicroRNA expression profiles associated withprognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 2008, 299(4):425-36.。最近，這種在腫瘤組織中表達(dá)異常的miRNA有的已被證實具有顯著的抗腫瘤活性[Thorsen SB, et al. The Therapeutic Potential of MicroRNAs in Cancer. CancerJ 2012, 18(3) :275-84.，如miR-145和miR_33a能抑制HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞移植瘤的生長Ibrahim AF, et al. MicroRNA replacement therapy for miR-145 and miR_33a isefficacious in a model of colon carcinoma. Cancer Res 2011,71:5214-5224.。另夕卜，miR-122由于能調(diào)控丙型肝炎病毒RNA的豐度，其互補序列用于治療丙型肝炎病毒感染患者已經(jīng)進(jìn)入 II 期臨床試驗Janssen HL, ReesinkHW, Zeuzem S，et al. A randomized,double-blind, placebo (plb) controlled safety and anti-viral proof of conceptstudy of miravirsen (MIR), an oligonucleotide targeting miR-122, in treatmentnaBve patients with genotype I (gtl) chronic HCV infection. Hepatology.2011:1430A.，顯示出miRNA作為一種極其重要的基因表達(dá)調(diào)控因子和作用靶標(biāo)，具有潛在的治療作用和實際應(yīng)用價值。雖然本領(lǐng)域中已知某些微小RNA與腫瘤具有一定的相關(guān)性，但本領(lǐng)域中已知的miRNA種類繁多，功能各異，要從中篩選出與腫瘤相關(guān)且可作為發(fā)病、治療方案的選擇及預(yù)后的特定miRNA存在較大難度。目前，本領(lǐng)域中尚無miR-143和B7-H4基因相關(guān)性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種微小RNA對B7-H4基因表達(dá)的調(diào)控，特別是miR-143用于調(diào)控B7-H4基因表達(dá)。
本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的一種微小RNA用于調(diào)控B7-H4基因表達(dá)，其特征在于，所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體5， -UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3，。優(yōu)選地，所述微小RNA能與B7-H4基因3’ -UTR結(jié)合，抑制B7-H4基因表達(dá)。優(yōu)選地，所述微小RNA為miR-143。優(yōu)選地，所述微小RNA通過化學(xué)合成得到。優(yōu)選地，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細(xì)胞和外周血。本發(fā)明微小RNA的獲取來源可以是來自化學(xué)合成和/或存在該基因序列的細(xì)胞、組織，組織可以選自外周血、體液、腔道的脫落物、病變組織，以及用這些組織制成的石蠟塊、石蠟切片。在本文中，術(shù)語“樣本”指的是潛在可能含有微小RNAmiR-143的離體循環(huán)血樣品，優(yōu)選是來自人的樣品。盡管用抽提出血總RNA的純化樣品也能夠在本發(fā)明中使用，但是，本發(fā)明的樣品優(yōu)選是未經(jīng)提純的、含有血總RNA的裂解液體樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉將固體的有核血細(xì)胞裂解或抽提、純化并保持其中miRNA成分不被降解的細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)。本發(fā)明的樣品可以是經(jīng)過處理的樣品，如稀釋處理、血細(xì)胞裂解處理以及PCR擴增等，也可以是未經(jīng)處理的樣品。經(jīng)過處理的樣品可以進(jìn)一步純化，以富集miRNA。在本文中，術(shù)語“miR-143”指的是指的是包含序列“UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC”或其同源序列的微小RNA。本領(lǐng)域中已知各種來源的miR-143，例如人、黑猩猩、馬、雞等，這些同源序列均包含在本發(fā)明的術(shù)語“miR-143”中。本發(fā)明的術(shù)語中還包含上述天然存在的miR-143序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸，或經(jīng)過生物化學(xué)修飾，且仍然具有生物學(xué)活性的衍生RNA。本發(fā)明人采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定了 6例結(jié)直腸癌組織和正常組織中miRNA的表達(dá)；統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-143在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織，結(jié)果如圖I所示。本發(fā)明人采用生物信息學(xué)軟件miRanda預(yù)測發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-143可能與B7-H4基因3’-UTR結(jié)合，結(jié)果如圖2所示。隨后，本發(fā)明人采用體外生物學(xué)功能實驗證實，hsa-miR-143可與B7-H4基因3’ -UTR結(jié)合，從而抑制B7-H4分子表達(dá)；可通過調(diào)控B7-H4信號通路和/或miR-143表達(dá)及功能以發(fā)揮抗腫瘤作用。


下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述
圖I為結(jié)直腸癌組織中和正常組織miR-143表達(dá)量測定結(jié)果；
圖2為miRanda軟件預(yù)測結(jié)果；
圖3 B7-H4基因3’ -UTR的PCR擴增結(jié)果；
圖4 B7-H4/3’ -UTR/pGEM-T重組載體酶切驗證結(jié)果；圖5 B7-H4/3’ -UTR/pGEM-T重組載體測序驗證結(jié)果；
圖6 B7-H4/3’ -UTR/ pGL-3重組載體酶切驗證結(jié)果；
圖7 B7-H4/3’ -UTR/ pGL-3重組載體測序驗證結(jié)果；
圖8 hsa-miR-143對B7-H4/3’ -UTR/pGL-3重組載體表達(dá)活性的抑制作用。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。一、試劑與材料 I、試劑
胎牛血清(Hyclone，美國)；完全培養(yǎng)基每升RPMI1640 (Hyclone，美國)中，添加胎牛血清100ml、L-谷氨酰胺O. 15g、2-巰基乙醇10.0 ml (5X l(T3mol/L);脂質(zhì)體2000(Invitrogen,美國);青霉素、鏈霉素(上海生工生物技術(shù)有限公司);TRIzol (Invitrogen,美國);瓊脂糖(LP0028A，Oxoid Ltd,英國);凝膠電泳加樣液和溴化乙錠(EtBr)(上海生工生物技術(shù)有限公司);膠回收DNA試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒(Axygen,美國);鹿糖、Triton-100、MgCl2*6H20、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、鹽酸、EDTA、NaCl、苯酚、氯仿、異戊醇、十二烷基磺酸鈉(SDS)和無水乙醇等實驗所用試劑均為分析純或優(yōu)級純；雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega,美國Xhsa-miR-HS及其實時突光定量試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);TaqDNA聚合酶、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、油a I限制性內(nèi)切酶(MBI，美國)；T4 DNA連接酶(Takar a，日本)；PCR 引物(Invitrogen, PAGE 級)。pGEM-T、pGL-3> pRL-TK 載體(Promega,美國)。2、組織樣本
收集6例結(jié)直腸癌患者的新鮮手術(shù)組織樣本，包括癌組織和遠(yuǎn)端正常腸組織(離癌邊沿5cm)。所有患者經(jīng)HE染色、病理診斷確認(rèn)為結(jié)直腸癌；術(shù)前未接受化療或放療。3、細(xì)胞株
中國倉鼠卵巢細(xì)胞株CHO (ATCC，美國);大腸桿菌TPlO (Novagen，美國)。細(xì)胞株經(jīng)檢測，無支原體污染。4、儀器
CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機、常速離心機(Thermo,德國)；倒置顯微鏡(Olympus,日本)；微弱發(fā)光測量儀(BPCL-K，中科院生物物理研究所)；PCR儀(S1000，Bio-Rad，美國)；電泳儀(Bio-Rad,美國)；微量定量分光光度計(Alpha Innotech,美國)；凝膠成像系統(tǒng)(GeneGenius, SYNGENE,英國)。
二、實驗方法
I、細(xì)胞培養(yǎng)
采用含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有100kU/L青霉素、IOOmg/L鏈霉素，培養(yǎng)條件為37° C、5% CO2、飽和濕度。CHO細(xì)胞株貼壁生長，傳代時用O. 25%胰酶消化。間隔2-3天更換新鮮培養(yǎng)基。2、實時熒光定量分析hsa-miR-143表達(dá)量
采用Trizol試劑按照使用說明書從6對結(jié)直腸癌和正常組織樣本中提取總RNA。實時熒光定量PCR試劑盒測定RNA樣本中hsa-miR-143的表達(dá)量；以U6 RNA為內(nèi)對照。取5μΜRT引物工作液lPL，加入79μ RNsae-free水，配置成62. 5nM RT引物工作液。50μ RT反應(yīng)體系，加入2μ RNA樣品，引物工作液各4μ ，加RNsae-free水至19μ 。以上體系混勻后，瞬時離心，70° C放置lOmin，冰育2min，再加入以下試劑進(jìn)行RT反應(yīng)1XRT buffer，WL dNTP (10mM),40U RNase inhibitor, 200U RT 酶，加 RNsae-free 水至 50μ 。RT 反應(yīng)程序42° C 60min，70° C lOmin。RT反應(yīng)結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置冰上冷卻，后續(xù)所有步驟都在冰上進(jìn)行。接著進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)定量測定hsa-miR-143表達(dá)量，20μ 反應(yīng)體系10μ SYBR Green Μ χ,2μ RT反應(yīng)產(chǎn)物，Bulge-Loop miR-143正向引物和反向引物(5μΜ)各2μ ，加RNsae-free水至20μ 。反應(yīng)程序95° C預(yù)變性20sec ;接著進(jìn)行40個循環(huán)(95。C 變性 10sec;60。C 退火 20sec;70。C 延伸 5sec)。3、miRNA作用靶位點的預(yù)測
采用生物信息學(xué)軟件miRanda (www. microRNA. org)預(yù)測可能與B7-H4基因3’-UTR結(jié)合的miRNA。4、構(gòu)建含B7-H4基因3’ -UTR片段的熒光素酶表達(dá)載體
采用Trizol試劑按照使用說明書從MDA-MB-435細(xì)胞中提取總RNA，以O(shè)ligo (dT)為逆轉(zhuǎn)錄引物，用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。μ L PCR反應(yīng)體系中含有2 μ L cDNA模板，I. 25U Taq DNA聚合酶，I X緩沖液，O. 2mmol/L dNTPs，O. 4Mmol/L正向引物5’- GGC TAG TCT AGA ACT CAG CTG GGG TGA TTT CG-3’和反向引物5’- GGC TAG TCT AGA TGT AAT ACA GTC ACC GTG GC-3’(下劃線堿基為內(nèi)切酶油<31識別序列)。熱循環(huán)條件為94° C預(yù)變性5min ;然后以94° C變性20sec，60° C退火30sec，72° C延伸lmin，擴增35個循環(huán)；最后72° C延伸7min使反應(yīng)完全。反應(yīng)完成后，取反應(yīng)產(chǎn)物3PL在I. 5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(I X TAE電泳緩沖液，電壓200V，恒壓電泳5min)，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。擴增成功的產(chǎn)物采用Sanger’ s測序法測定DNA序列(Invitrogen);另取30μ 反應(yīng)產(chǎn)物在2. 0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(I XTAE電泳緩沖液，電壓100V，恒壓電泳lOmin)，然后采用膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段，并用微量紫外分光光度計測定其濃度。參考產(chǎn)品說明書，將純化的B7-H4基因3’ -UTR片段克隆到pGEM_T載體；熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑搖菌，抽提質(zhì)粒；PCR擴增及酶切鑒定后再進(jìn)行測序驗證。將測序正確的重組子用油al酶切后，回收3’ -UTR片段。用PGL-3和pRL-TK載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行大量擴增；試劑盒抽提法大量制備PGL-3和pRL-TK質(zhì)粒，電泳檢測質(zhì)粒的純度和含量。用限制性內(nèi)切酶對提取的PGL-3質(zhì)粒進(jìn)行酶切，試劑盒直接回收大片段的酶切產(chǎn)物。參考產(chǎn)品說明書，將酶切回收純化后的B7-H4基因3 ’ -UTR片段按適當(dāng)比例與pGL_3載體的Xba I酶切片段進(jìn)行連接反應(yīng)，16° C酶連過夜。取10 μ L連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化100 μ L大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB平板固體培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化子的平板上隨機挑取10個菌落，經(jīng)過含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)；經(jīng)PCR擴增、酶切和測序鑒定后，用試劑盒抽提質(zhì)粒備用。5、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
首先，將培養(yǎng)于含有10% FCS、100kU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中細(xì)胞株，按I X IO4個細(xì)胞/孔的量在24孔板中接種指數(shù)生長期的細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，直到細(xì)胞80%匯片。然后，將一定量的hsa-miR-143、B7-H4/3 ' _UTR/pGL3重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK稀釋至50 μ L不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養(yǎng)基中，用移液槍混合均勻；然后將I μ L脂質(zhì)體2000懸液加入50 μ L不含血清和抗生素的Opti-MEMsI培養(yǎng)基中，在室溫孵育5min ;最后將兩者混合在一起，充分混勻，靜置20min，使hsa-miR-143、重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒與脂質(zhì)體充分結(jié)合。將只加脂質(zhì)體的孔作為陰性對照。最后，吸去接種到24孔板中的培養(yǎng)液，用不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養(yǎng)基洗一次，在每個孔中加入100 μ L上述混合物，培養(yǎng)3h ;吸棄培養(yǎng)板中的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，向各孔加入100 μ L有血清無抗生素的Opti-MEMsI培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行檢測。6、雙熒光素酶報告系統(tǒng)基因活性測定
將轉(zhuǎn)染有PGL-3和pRL-TK的CHO細(xì)胞經(jīng)過24h培養(yǎng)后收集，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗I次。加入裂解液20 μ L/孔，室溫?fù)u動15 min0按照雙熒光素酶檢測試劑盒的操作說明書，取100 μ L突光素酶分析緩沖液II于I. 5ml離心管中，設(shè)定化學(xué)發(fā)光儀延遲2sec,發(fā)光儀測讀IOsec ;將全部細(xì)胞裂解液加入到離心管中，用移液槍輕輕抽吸2-3次混勻(不要旋渦振動)；將離心管放入化學(xué)發(fā)光儀中測讀螢火蟲熒光素酶發(fā)光值Fl ;將離心管移出發(fā)光儀，力口AlOOuL Stop&Glo試劑，快速旋渦混勻后，將離心管重放回發(fā)光儀中測讀海腎熒光素酶發(fā)光值F2。應(yīng)用SPSS. 10統(tǒng)計軟件的卡方檢驗分析受試組與空白對照組的F1/F2比值差異，以判斷hsa-miR-143的調(diào)控作用。三、結(jié)果
I.hsa-miR-143在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定了 6例結(jié)直腸癌組織和正常組織中miRNA的表達(dá)；統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-143在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織，結(jié)果如圖I所示。與B7-H4 基因 3’ -UTR 結(jié)合
我們采用生物信息學(xué)軟件miRanda預(yù)測發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-143可能與B7-H4基因3’ -UTR結(jié)合，結(jié)果如圖2所示。構(gòu)建B7-H4/3’ -UTR/pGL-3熒光素酶表達(dá)載體
PCR擴增得到長度為700bp的B7-H4基因3’ -UTR序列(圖3)，切膠純化回收后，將片段插入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。隨機挑克隆擴增后提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)過油al酶切鑒定，證實酶切后得到的基因片段與預(yù)期大小758bp相符(圖4)。測序結(jié)果表明，插入PGEM-T載體的B7-H4基因3’ -UTR片段序列正確，如圖5所示。抽提pGEM_T載體，酶切獲得B7-H4基因3’ -UTR片段；將其插入pGL_3載體，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。酶切后得到的基因片段與預(yù)期大小758bp相符(圖6);測序結(jié)果證實插入序列正確(圖7)。2、hsa-miR-143抑制重組熒光素酶表達(dá)活性
將200ng重組B7-H4/3’-UTR/pGL-3熒光素酶表達(dá)載體、20ng內(nèi)參質(zhì)粒pRL_TK與IOpmol hsa-miR-143共同轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后CHO細(xì)胞中熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，在CHO細(xì)胞中加入hsa-miR-143后，熒光素酶的活性比值(pGL-3/pRL-TK)顯著低于不加hsa-miR-143的細(xì)胞(圖8)。由此表明，hsa-miR-143通過與B7-H4基因3’ -UTR上靶序列結(jié)合，抑制了熒光素酶的表達(dá)。
上述實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種微小RNA用于調(diào)控B7-H4基因表達(dá),其特征在于,所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體5’ -UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA能與B7-H4基因3’_UTR結(jié)合，抑制B7-H4基因表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA為miR-143。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA通過化學(xué)合成而得。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細(xì)胞和外周血。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微小RNA用于調(diào)控B7-H4基因表達(dá)，所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體:5’-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3’。所述微小RNA為miR-143。本發(fā)明人采用體外生物學(xué)功能實驗證實，hsa-miR-143可與B7-H4基因3’-UTR結(jié)合，從而抑制B7-H4分子表達(dá)；可通過調(diào)控B7-H4信號通路和/或miR-143表達(dá)及功能以發(fā)揮抗腫瘤作用。
文檔編號C12N15/113GK102776192SQ20121025261
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者張學(xué)光, 朱健潔, 汪維鵬 申請人:蘇州大學(xué)