專利名稱：一種生產(chǎn)α淀粉酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建微生物工程菌生產(chǎn)重組蛋白。具體是應(yīng)用微生物工程菌生產(chǎn)混合α淀粉酶。
背景技術(shù)：
α淀粉酶(a-amylase, EC 3. 2. I. I)廣泛存在于生物界。α淀粉酶能夠催化隨機(jī)水解淀粉的α-l，4-糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、麥芽三糖和α糊精。α淀粉酶廣泛應(yīng)用于飴糖、啤酒、黃酒、葡萄糖、酒精、白酒、味精和醫(yī)藥等行業(yè)。當(dāng)前市場(chǎng)上的α淀粉酶產(chǎn)品是來源于天然菌株生產(chǎn)的α淀粉酶。但是，由于天然的產(chǎn)α淀粉酶菌株的生長緩慢，營養(yǎng)要求較高，使酶的生產(chǎn)成本較高；另之，當(dāng)前的α淀粉酶產(chǎn)品的適合反應(yīng)溫度范圍和適合反應(yīng) pH范圍窄，不能滿足當(dāng)前市場(chǎng)的需求。由于α淀粉酶有多種來源，那么，不同來源的α淀粉酶的基因序列可不相同，不同來源的ct淀粉酶的理化特性可不相同。畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)都是常用于生產(chǎn)重組蛋白的宿主菌，但各具有特征。畢赤酵母的主要特征是分泌極少自身蛋白有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化的特點(diǎn)，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有兼性需氧的特性，適合于固態(tài)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)重組酶。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)α淀粉酶有多種來源，不同來源的α淀粉酶的基因序列可不相同，不同來源的α淀粉酶的理化特性可不相同，如果將某些不同理化特性的α淀粉酶基因重組于同一個(gè)細(xì)胞的基因組進(jìn)行表達(dá)，那么，所表達(dá)的混合α淀粉酶將具有理化特性多祥性，即具有多個(gè)最適溫度和最適pH。這種混合酶將比其中單種酶的使用價(jià)值高。來源于大麥(Hordeumvulgare)的α淀粉酶最適合pH 5,最適溫度70°C,在pH5_6和35至73°C的溫度下有>60%的酶活性；來源于地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)的α淀粉酶最適pH 8. 5,最適溫度80°C，在ρΗ5-9· 5和55-90°C有>60%的酶活性；來自于曲霉(Aspergillus)的α淀粉酶最適合pH 4，最適溫度是70°C，在pH 3-6和50-75°C有>60%的酶活性。由于這三種酶的功能相同，所以，這三種在畢赤酵母或釀酒酵母或枯草芽孢桿菌中表達(dá)的混合α淀粉酶適合于在酸性、中性、堿性、常溫、中溫和較高溫度的條件下使用。即這種混合酶的用途將比其中的単獨(dú)酶廣。若分別用不同的菌株來表達(dá)這三種酶，其生產(chǎn)成本將高于用ー個(gè)菌株同時(shí)生產(chǎn)這三種酶的混合酶。本發(fā)明構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌，生產(chǎn)重組混合大麥的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是I.克隆酶基因應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，分別從大麥基因組、地衣芽孢桿菌基因組和曲霉基因組中擴(kuò)增α淀粉酶基因。2.獲得應(yīng)用于表達(dá)載體構(gòu)建所需的啟動(dòng)子，重組序列，信號(hào)肽，轉(zhuǎn)錄終止子和抗性基因。3.構(gòu)建如附圖I、附圖2和附圖3的含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體、釀酒酵母表達(dá)載體和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體。4.將含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母；將含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母；將含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 枯草芽孢桿菌。[說明.表達(dá)框架啟動(dòng)子-信號(hào)肽-基因-轉(zhuǎn)錄終止子]5.篩選高表達(dá)大麥的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶的畢赤酵母重組子作為含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌；篩選高表達(dá)大麥的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶的釀酒酵母重組子作為含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌；篩選高表達(dá)大麥的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶的枯草芽孢桿菌重組子作為含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌エ程菌。6.發(fā)酵含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產(chǎn)重組混合α淀粉酶。本發(fā)明構(gòu)建的含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產(chǎn)重組混合α淀粉酶的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于本發(fā)明通過構(gòu)建畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌，應(yīng)用工程菌生產(chǎn)三種重組α淀粉酶的混合酶產(chǎn)品，一方面提供適合于在酸性、中性和堿性多種溫度環(huán)境下使用的混合α淀粉酶新產(chǎn)品，另ー方面取代發(fā)酵分別含這三種酶基因的菌株生產(chǎn)大麥的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶。即用ー個(gè)發(fā)酵エ序生產(chǎn)三種α淀粉酶取代用三個(gè)エ序分別生產(chǎn)三種α淀粉酶。達(dá)到節(jié)省原材料、能耗和人力資源的作用。


附圖I.含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體。
p.畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S. α因子信號(hào)肽；H-amy.大麥的α淀粉酶基因；B_amy.地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因；A_amy.曲霉的α淀粉酶基因；Τ.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418抗性基因(應(yīng)用于篩選畢赤酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨節(jié)青霉素抗性基因(應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)；p. pastoris rDNA.畢赤酵母的rDNA序列。附圖2.含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母表達(dá)載體。p.釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S. α因子信號(hào)肽；H-amy.大麥的α淀粉酶基因；B_amy.地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因；A_amy.曲霉的α淀粉酶基因；Τ.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418抗性基因(應(yīng)用于篩選釀酒酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨節(jié)青霉素抗性基因(應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)；S. cerevisiae rDNA.釀酒酵母的rDNA序列。
附圖3.含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體。p.巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S. α因子信號(hào)肽；H-amy.大麥的α淀粉酶基因；B_amy.地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因；A_amy.曲霉的α淀粉酶基因；Τ.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418抗性基因(應(yīng)用于篩選枯草芽孢桿菌重組子)；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素抗性基因(應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)；B. Subtilis rDNA.枯草芽孢桿菌的rDNA序列。
具體實(shí)施例方式下面用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。實(shí)施例I :I. I構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體I. I. I構(gòu)建克隆載體由專業(yè)的DNA序列合成公司合成含氨芐青霉素(AMP)基因序列，多克隆接頭和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pPD。1.1.2獲取基因①用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增大麥的α淀粉酶基因引物I :5’ GGCGAATTCcaagtcctctttcaggggtt3' 3’ [說明5’ 的 8 個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]弓I 物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A 各 TGATGATGATGATGATG!
gctccgttgtagtgttgccgcggcaccgtJ[說明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]應(yīng)用植物RNA提取試劑盒提取大麥的總RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是大麥的α淀粉酶基因序列。②用PCR擴(kuò)增地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)的α淀粉酶基因(包括信號(hào)肽)引物I :5，GGTACGTAATGAAACAACAAAAACGGCT3，[說明引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]引物2:5，A A GCGGCCGCC T A ^TG ATGATGATGATGATG
TCTTTGAACATAAATTGAAACCGACCC3’ [說明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。] 提取地衣芽孢桿菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是地衣芽孢桿菌的含信號(hào)肽的α淀粉酶基因序列。[說明地衣芽孢桿菌基因組DNA提取方法將地衣芽孢桿菌細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]③用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增曲霉的α淀粉酶基因引物I :5’ gcgaattcgcaacgcctgcggactggcg3'[說明5’ 的 8 個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]弓I 物 2 : 5，a a gcggccgcC T A !ATGATGATGATGATGATG
gccgtaacagatcttgctacctgccaac3’ [說明5’端的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的8個(gè)堿基)]應(yīng)用真菌RNA提取試劑盒提取曲霉的總RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是曲霉的α淀粉酶基因序列。I. I. 3分別構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架。①用PCR擴(kuò)增畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列。提取畢赤酵母的基因組DNA，應(yīng)用以基因組DNA為模板，應(yīng)用如下引物(5’ CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTC3’，5’ GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAA 3’ )進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列[如下序列的5’端和3’端的有下劃線的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)出個(gè)堿基)，沒有下劃線的是三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列]:CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCGTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGTCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCCCTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAAAAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAAAGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAATTGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC
[說明畢赤酵母基因組DNA提取方法將畢赤酵母細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]②由專業(yè)的DNA序列合成公司合成α因子信號(hào)肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是α因子信號(hào)肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC
③由專業(yè)的DNA序列合成公司合成轉(zhuǎn)錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套疊PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤從畢赤酵母基因組中PCR擴(kuò)增rDNA序列PCR 引物引物I :5，CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3>引物2 :5， CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，說明引物的5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位(有下劃線的6個(gè)堿基)。
提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。⑥表達(dá)框架構(gòu)建過程A.大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pH)載體的多克隆位點(diǎn)；將α因子信號(hào)肽DNA序列重組于pH)載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得的大麥的α淀粉酶基因序列重組于pH)載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于pro載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PPD1。B.地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建 通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pH)載體的多克隆位點(diǎn)；將PCR擴(kuò)增獲得的地衣芽孢桿菌的包含信號(hào)肽的α淀粉酶基因序列重組于pH)載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于pro載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PPD2。C.曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pH)載體的多克隆位點(diǎn)；將α因子信號(hào)肽DNA序列重組于pH)載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得的曲霉的α淀粉酶基因序列重組于pH)載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于pro載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PPD3⑦完成畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建Α.將三套表達(dá)框架組裝于同一個(gè)克隆載體。通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，分別切下pPD2和pPD3載體的表達(dá)框架，并將其切下的兩個(gè)表達(dá)框架重組于PPDl的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為PPD123.B.通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用依次將畢赤酵母的rDNA序列(DNA重組序列)和G418基因重組于pPD123載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)成含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體(附圖I)。I. 2構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌用電轉(zhuǎn)化方法將以上構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體(見附圖I)轉(zhuǎn)化畢赤酵母，將經(jīng)過電轉(zhuǎn)化的畢赤酵母細(xì)胞涂布G418抗性平板。以重組子(在G418抗性平板上生長的克隆)基因組DNA為模板，分別用大麥的α淀粉酶基因的特異引物、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因的特異引物和曲霉的α淀粉酶基因的特異引物進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)増，將擴(kuò)增出符合目標(biāo)分子量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定而驗(yàn)證獲得了正確的重組子。將含以上含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的重組子在接種于YPD[2%蛋白胨，1% yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)兩天，將發(fā)酵液離心，收獲上清。應(yīng)用發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)，其結(jié)果表明出現(xiàn)新的符合這三個(gè)基因編碼的酶蛋白分子量的蛋白條帶。用His6融合蛋白純化試劑盒純化目標(biāo)蛋白，用His標(biāo)簽單克隆抗體對(duì)純化的三種目標(biāo)蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明這三種目標(biāo)蛋白都能與His標(biāo)簽單克隆抗體結(jié)合，證明大麥的α淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因和曲霉的α淀粉酶基因都能在含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌中表達(dá)和分泌到胞外。篩選高表達(dá)以上所述的三種混合α淀粉酶的重組子作為含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌。I. 3生產(chǎn)重組大麥的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶將含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和 曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌和不含α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母分別接種于YH)培養(yǎng)基中，30°C搖床發(fā)酵兩天；將天然的產(chǎn)α淀粉酶的地衣芽孢桿菌(應(yīng)用于I. I.2所述的PCR擴(kuò)增α淀粉酶基因的地衣芽孢桿菌菌株)接種于LB (I %胰蛋白胨，I %氯化鈉，O. 5%酵母提取物)培養(yǎng)基，37°C搖床發(fā)酵兩天；將曲霉(應(yīng)用于I. I. 2所述的PCR擴(kuò)增α淀粉酶基因的曲霉菌株)接種于常規(guī)的真菌培養(yǎng)基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，在30°C搖床發(fā)酵3天。以上所述的每個(gè)菌株的發(fā)酵都是一式三份。分別收集其發(fā)酵液上清于50°C、70°C和80°C條件分析其發(fā)酵液上清在酸性(pH4和pH5)、中性(pH7)和堿性(pH8. 5)環(huán)境下的α淀粉酶活性。結(jié)果表明，將含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在以上所述的溫度和PH的平均α淀粉酶活性分別是50°C和ρΗ4 (1862109單位)、50°C和 pH5 (2930226 單位)、50°C和 pH7 (3289090 單位)、50°C和 pH8. 5 (1504093 單位)、70°C 和 pH4 (2418659 單位)、70°C 和 pH5 (3761490 單位)、70°C 和 pH7 (4518382 單位)、70°C和 ρΗ8· 5(2151179單位)、80で和ロ!14(2432195單位)、80で和ロ冊(cè)(4346099 單位)、80°C和pH7(3266072單位)、80°C和ρΗ8·5(2729903單位)；含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在大麥的α淀粉酶的最適合的溫度和pH (ρΗ5和70°C )的平均α淀粉酶活性是2275490單位；含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在地衣芽孢桿菌的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ8. 5和80°C)的平均α淀粉酶活性是1490156單位；含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最適合的溫度和pH (70°C和pH4)的平均α淀粉酶活性是1500271單位；天然的產(chǎn)α淀粉酶的地衣芽孢桿菌的發(fā)酵液上清(每升)在地衣芽孢桿菌的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ8·5和80°C)的平均α淀粉酶活性是995486単位；曲霉的發(fā)酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ4和70°C )的平均α淀粉酶活性是1033457單位；不含α淀粉酶基因的畢赤酵母的發(fā)酵液上清(每升)在以上所述的各種溫度和PH都沒有測(cè)到α淀粉酶活性。以上發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物的酶活性分析的結(jié)果表明含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌表達(dá)的α淀粉酶在酸性、中性和堿性以及不同的試驗(yàn)溫度都具有良好的α淀粉酶活性，并且其α淀粉酶活性顯著高于(P <0.01)含單種α淀粉酶基因的畢赤酵母工程菌或產(chǎn)α淀粉酶的天然菌株的表達(dá)產(chǎn)物的α淀粉酶活性。說明a.含單種α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的構(gòu)建的方法與含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的構(gòu)建的方法的差別在于表達(dá)載體的構(gòu)建；含單種α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建方法與含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體構(gòu)建的方法的差別在于前者只含ー種α淀粉酶基因表達(dá)框架，而后·者含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架。c. α淀粉酶活性測(cè)定方法應(yīng)用可溶淀粉平板測(cè)定方法。制備含2%可溶淀粉的瓊脂平板，將牛津杯置于平板上，各取50 μ I不同濃度的α淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)溶液和不同菌株的發(fā)酵液加于不同的牛津杯中，并在每個(gè)杯中加入50 μ I磷酸鹽緩沖液。于50°C放置12小時(shí)，然后用碘-碘化鉀(I2-KI)溶液染色，計(jì)算透明圈直徑。對(duì)以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，結(jié)果分析取平均值。根據(jù)不同濃度的α淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)的透明圈繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)測(cè)試樣品的透明圈直徑和不同濃度的α淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)的透明圈標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)測(cè)試菌株的發(fā)酵液的α淀粉酶活性。實(shí)施例2 2. I構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母表達(dá)載體2. I. I構(gòu)建克隆載體由專業(yè)的DNA序列合成公司合成含氨芐青霉素(AMP)基因序列，多克隆接頭和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pSD。2. I. 2獲取基因①用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增大麥的α淀粉酶基因引物I :5’ GGCGAATTCcaagtcctctttcaggggtt3' 3’ [說明5’ 的 8 個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]弓I 物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A 色 TGATGATGATGATGATG;
gctccgttgtagtgttgccgcggcaccgtJ[說明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]應(yīng)用植物RNA提取試劑盒提取大麥的總RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是大麥的α淀粉酶基因序列。②用PCR擴(kuò)增地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)的α淀粉酶基因(包括信號(hào)肽)
引物I :5，GGTACGTAATGAAACAACAAAAACGGCT3，[說明引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]引物2:5，A A GCGGCCGCC T A ^JG ATGATG ATGATGATG
TCTTTGAACATAAATTGAAACCGACCC3’ [說明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]提取地衣芽孢桿菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是地衣芽孢桿菌的含 信號(hào)肽的α淀粉酶基因序列。[說明地衣芽孢桿菌基因組DNA提取方法將地衣芽孢桿菌細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]③用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增曲霉的α淀粉酶基因引物I :5’ gcgaattcgcaacgcctgcggactggcg3'[說明5’ 的 8 個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]弓I 物 2 : 5，a a gcggccgcC T A ^ATGATGATGATGATGATG
gccgtaacagatcttgctacctgccaac3’ [說明5’端的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的8個(gè)堿基)]應(yīng)用真菌RNA提取試劑盒提取曲霉的總RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是曲霉的α淀粉酶基因序列。2. I. 3分別構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架。①用PCR擴(kuò)增釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列。引物I:5’ CCTACGTATCGAGTTTATCATTATCAAT 3’[說明引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]引物2:5’ GGGCATGCTCGAAACTAAGTTCTTGGTG 3’[說明引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]提取釀酒酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)増，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列。[說明釀酒酵母基因組DNA提取方法將釀酒酵母細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]②由專業(yè)的DNA序列合成公司合成α因子信號(hào)肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是α因子信號(hào)肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由專業(yè)的DNA序列合成公司合成轉(zhuǎn)錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套疊PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤從釀酒酵母基因組中PCR擴(kuò)增rDNA序列引物I:5 ’ CCGGTACCTGAACTAACACCTTTTGTGG3’引物2:5 ’ CCTTCGAAGCTAATACATGCTTAAAATC3，[說明引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]提取釀酒酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是釀酒酵母基因組中的rDNA序列。、
⑥表達(dá)框架構(gòu)建過程A.含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pSD載體的多克隆位點(diǎn)；將α因子信號(hào)肽DNA序列重組于pSD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得的大麥的α淀粉酶基因序列重組于PSD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PSD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PSD1。B.含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pSD載體的多克隆位點(diǎn)；將PCR擴(kuò)增獲得的地衣芽孢桿菌的包含信號(hào)肽的α淀粉酶基因序列重組于PSD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下 游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PSD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PSD2。C.含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將釀酒酵母三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pSD載體的多克隆位點(diǎn)；將α因子信號(hào)肽DNA序列重組于pSD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得的曲霉的α淀粉酶基因序列重組于PSD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于pSD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PSD3⑦完成釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建Α.將三套表達(dá)框架組裝于同一個(gè)克隆載體。通過DNA限制性內(nèi)切酶和Τ4 DNA連接酶的作用，分別切下pSD2和pSD3載體的表達(dá)框架，并將其切下的兩個(gè)表達(dá)框架重組于PSDl的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為PSD123.B.通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用依次將釀酒酵母的rDNA序列(DNA重組序列)和G418基因重組于pSD123載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)成含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母表達(dá)載體(附圖2)。2. 2構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌用電轉(zhuǎn)化方法將以上構(gòu)建的釀酒酵母表達(dá)載體(見附圖2)轉(zhuǎn)化釀酒酵母，將經(jīng)過電轉(zhuǎn)化的釀酒酵母細(xì)胞涂布G418抗性平板。以重組子(在G418抗性平板上生長的克隆)基因組DNA為模板，分別用大麥的α淀粉酶基因的特異引物、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因的特異引物和曲霉的α淀粉酶基因的特異引物進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)増，將擴(kuò)增出符合目標(biāo)分子量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定而驗(yàn)證獲得了正確的重組子。將含以上含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的重組子在接種于YPD[2%蛋白胨，I % yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)兩天，將發(fā)酵液離心，收獲上清。應(yīng)用發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)，其結(jié)果表明出現(xiàn)新的符合這三個(gè)基因編碼的酶蛋白分子量的蛋白條帶。用His6融合蛋白純化試劑盒純化目標(biāo)蛋白，用Hi s標(biāo)簽單克隆抗體對(duì)純化的三種目標(biāo)蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明這三種目標(biāo)蛋白都能與His標(biāo)簽單克隆抗體結(jié)合，證明大麥的α淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因和曲霉的α淀粉酶基因都能在含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母中表達(dá)和分泌到胞外。篩選高表達(dá)以上所述的三種混合α淀粉酶的重組子作為含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌。2. 3生產(chǎn)重組大麥的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶將含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌、含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌、含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌、含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌和不含α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母分別接種于YH)培養(yǎng)基中，30°C搖床發(fā)酵兩天；將天然的產(chǎn)α淀粉酶的地衣芽孢桿菌(應(yīng)用于 I. I.2所述的PCR擴(kuò)增α淀粉酶基因的地衣芽孢桿菌菌株)接種于LB (I %胰蛋白胨，I %氯化鈉，O. 5%酵母提取物)培養(yǎng)基，37°C搖床發(fā)酵兩天；將曲霉(應(yīng)用于2. I. 2所述的PCR擴(kuò)增α淀粉酶基因的曲霉菌株)接種于常規(guī)的真菌培養(yǎng)基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，在30°C搖床發(fā)酵3天。以上所述的每個(gè)菌株的發(fā)酵都是一式三份。分別收集其發(fā)酵液上清于50°C、70°C和80°C條件分析其發(fā)酵液上清在酸性(pH4和pH5)、中性(pH7)和堿性(PH8.5)環(huán)境下的α淀粉酶活性。結(jié)果表明，將含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在以上所述的溫度和PH的平均α淀粉酶活性分別是50°C和ρΗ4(650760單位)、50°C 和 pH5 (976407 單位)、50°C 和 pH7 (1096364 單位)、50°C和 ρΗ8· 5 (495433 單位)、70°C和 pH4 (806217 單位)、70°C和 pH5 (1253830 單位)、70°C和 pH7 (1502794 單位)、70°C和 ρΗ8· 5(717058單位)、80で和ロ財(cái)(810731 單位)、80°C和 ρΗ5 (1448699 單位)、80°C和 !17(1752024單位)、80で和？!18.5(906641單位)；含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在大麥的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ5和70°C )的平均α淀粉酶活性是758495単位；含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在地衣芽孢桿菌的α淀粉酶的最適合的溫度和pH (ρΗ8. 5和80°C )的平均α淀粉酶活性是495685單位±62單位；含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最適合的溫度和pH(ρΗ4和70°C)的平均α淀粉酶活性是499690單位；天然的產(chǎn)α淀粉酶的地衣芽孢桿菌的發(fā)酵液上清(每升)在地衣芽孢桿菌的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ8·5和80°C)的平均α淀粉酶活性是78065単位；曲霉的發(fā)酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ4和70°C )的平均α淀粉酶活性是87089単位；不含α淀粉酶基因的釀酒酵母的發(fā)酵液上清(每升)在以上所述的各種溫度和PH都沒有測(cè)到α淀粉酶活性。以上發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物的酶活性分析的結(jié)果表明含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌表達(dá)產(chǎn)物在酸性、中性和堿性以及不同的試驗(yàn)溫度都顯示有良好的α淀粉酶活性，并且顯著高于(P<0.01)含單種α淀粉酶基因的釀酒酵母工程菌或產(chǎn)α淀粉酶的天然菌株的表達(dá)產(chǎn)物的α淀粉酶活性。 說明a.含單種α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建的方法與含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建的方法的差別在于表達(dá)載體的構(gòu)建；含單種α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建方法與含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母表達(dá)載體構(gòu)建的方法的差別在于前者只含ー種α淀粉酶基因表達(dá)框架，而后者含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架。c. α淀粉酶活性測(cè)定方法應(yīng)用可溶淀粉平板測(cè)定方法。制備含2%可溶淀粉的瓊脂平板，將牛津杯置于平板上，各取50 μ I不同濃度的α淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)溶液和不同菌株的發(fā)酵液加于不同的牛津杯中，并在每個(gè)杯中加入50 μ I磷酸鹽緩沖液。于50°C放置12小時(shí)，然后用碘-碘化鉀(I2-KI)溶液染色，計(jì)算透明圈直徑。對(duì)以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，結(jié)果分析取平均值。根據(jù)不同濃度的α淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)的透明圈繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)測(cè)試樣品的透明圈直徑和不同濃度的α淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)的透明圈標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)測(cè)試菌株的發(fā)酵液的α淀粉酶活性。實(shí)施例3:3. I構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3. I. I構(gòu)建克隆載體由專業(yè)的DNA序列合成公司合成含氨芐青霉素(AMP)基因序列，多克隆接頭和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pBD。3. I. 2獲取基因①用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增大麥的α淀粉酶基因引物I :5’ GGCGAATTCcaagtcctctttcaggggtt3' 3’ [說明5’ 的 8 個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]弓I 物 2 : 5 ’ C A GCGGCCGCC T A 色 TGATGATGATGATGATGI;
gctccgttgtagtgttgccgcggcaccgtJ[說明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]應(yīng)用植物RNA提取試劑盒提取大麥的總RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是大麥的α淀粉酶基因序列。②用PCR擴(kuò)增地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)的α淀粉酶基因(包括信號(hào)肽)引物I : 5 ’ GGTACGTAATGAAACAACAAAAACGGCT3，[說明引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]引物2:
5，A A GCGGCCGCC T A ^TGATGATG ATGATG ATG
TCTTTGAACATAAATTGAAACCGACCC3’ [說明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]提取地衣芽孢桿菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是地衣芽孢桿菌的含信號(hào)肽的α淀粉酶基因序列。[說明地衣芽孢桿菌基因組DNA提取方法將地衣芽孢桿菌細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]③用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增曲霉的α淀粉酶基因引物I :5’ gcgaattcgcaacgcctgcggactggcg3;[說明5’ 的 8 個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]弓I 物 2 : 5，a a gcggccgcC T A KtGATGATGATGATGATG|i
gccgtaacagatcttgctacctgccaac3’ [說明5’端的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的8個(gè)堿基)]應(yīng)用真菌RNA提取試劑盒提取曲霉的總RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是曲霉的α淀粉酶基因序列。3. I. 3分別構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體。 ①用PCR擴(kuò)增巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的三磷酸甘油醒脫氫酶啟動(dòng)子序列引物I :5’ CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA 3’引物2:5’ GGGCATGCGGGTATTTCCTCCTTGAATGT 3’[說明引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]提取巨大芽孢桿菌的基因組DNA[巨大枯草芽孢桿菌基因組DNA提取方法將枯草芽孢桿菌細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]，以巨大芽孢桿菌的基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是巨大芽孢桿菌三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列]:CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCATCTATTAAAGACATGCTTCATTTAATTAAGTCCGCTGGTATGGTTGTTCACGGAATAGGAGACGCTATGACAATGGCAGAACGCCGTAAAACACCACAAGCAGACTTAGAAAAAGTGAAAAATGGACATGCTGTAGGTGAGGCATTTGGATACTATTTTAATCATCAAGGCGAAGTTGTTCATAAAGTTAAAACAGTTGGCATACAACTCGATGATTTAAAGAACAATAAATGTGTTATTGCTGTTGCAGGAGGTTCATCAAAAGCAAAGGCAATTAAAGCGTTTATGCAACAAGCGCATGATTCGATTCTCATTACAGATGAAGGCGCCGCAAAAGAGTTAGTAAGGGATTTTAATTAATCCCTCATATAAAAAATACTTTTTACATTCAAGGAGGAAATACCCGCATGCCC
②由專業(yè)的DNA序列合成公司合成α因子信號(hào)肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是α因子信號(hào)肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由專業(yè)的DNA序列合成公司合成轉(zhuǎn)錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGC TGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套疊PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤用PCR從枯草芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增rDNA序列引物I.5，CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3 引物2.5，CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3 [說明引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]。提取枯草芽孢桿菌基因組DNA(基因組DNA提取方法同以上所述的巨大枯草芽孢桿菌的基因組DNA提取方法)，以基因組DNA為模板應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌基因組中的rDNA序列。⑥表達(dá)框架構(gòu)建過程A.含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和Τ4 DNA連接酶的作用，將巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pBD載體的多克隆位點(diǎn)；將α因子信號(hào)肽DNA序列重組于PBD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得的大麥的α淀粉酶基因序列重組于PBD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PBD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PBD1。B.含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建 通過DNA限制性內(nèi)切酶和Τ4 DNA連接酶的作用，將巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pBD載體的多克隆位點(diǎn)；將PCR擴(kuò)增獲得的地衣芽孢桿菌的包含信號(hào)肽的α淀粉酶基因序列重組于pBD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PBD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PBD2。C.含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和Τ4 DNA連接酶的作用，將巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pBD載體的多克隆位點(diǎn)；將α因子信號(hào)肽DNA序列重組于PBD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得的曲霉的α淀粉酶基因序列重組于PBD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于pBD載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PBD3⑦完成枯草芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建A.將三套表達(dá)框架組裝于同一個(gè)克隆載體。通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，分別切下pBD2和pBD3載體的表達(dá)框架，并將其切下的兩個(gè)表達(dá)框架重組于PPDl的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為PBD123.B.通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用依次將枯草芽孢桿菌的rDNA序列(DNA重組序列)和G418基因重組于pPD123載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)成含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(附圖3)。3. 2構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌用電轉(zhuǎn)化方法將以上構(gòu)建的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(見附圖3)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，將經(jīng)過電轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌細(xì)胞涂布G418抗性平板。以重組子(在G418抗性平板上生長的克隆)基因組DNA為模板，分別用大麥的α淀粉酶基因的特異引物、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因的特異引物和曲霉的α淀粉酶基因的特異引物進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增出符合目標(biāo)分子量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定而驗(yàn)證獲得了正確的重組子。將含以上含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的重組子在接種于YPD[2%蛋白胨，1% yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)兩天，將發(fā)酵液離心，收獲上清。應(yīng)用發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)，其結(jié)果表明出現(xiàn)新的符合這三個(gè)基因編碼的酶蛋白分子量的蛋白條帶。用Hi s6融合蛋白純化試劑盒純化目標(biāo)蛋白，用His標(biāo)簽單克隆抗體對(duì)純化的三種目標(biāo)蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明這三種目標(biāo)蛋白都能與His標(biāo)簽單克隆抗體結(jié)合，證明大麥的α淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因和曲霉的α淀粉酶基因都能在含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌中表達(dá)和分泌到胞外。篩選高表達(dá)以上所述的三種混合α淀粉酶的重組子作為含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌。3. 3生產(chǎn)重組大麥的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因編碼的α淀粉酶分別將含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、不含α淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌和天然的產(chǎn)α淀粉酶的地衣芽孢桿菌(應(yīng)用于I. I. 2所述的PCR擴(kuò)增α淀粉酶基因的地衣芽孢桿菌菌株)分別接種于LB培養(yǎng)基(I %胰蛋白胨，I %氯化鈉，O. 5%酵母提取物)中，30°C搖床發(fā)酵兩天；將曲霉(應(yīng)用于I. I. 2所述的PCR擴(kuò)增α淀粉酶基因的曲霉菌株)接種于常規(guī)的真菌培養(yǎng)基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，在30°C搖床發(fā)酵3天。以上所述的每個(gè)菌株的發(fā)酵都是一式三份。分別收集其發(fā)酵液上清于50°C、70°C和80°C條件分析其發(fā)酵液上清在酸性(pH4和pH5)、中性(pH7)和堿性(pH8. 5)環(huán)境下的α淀粉酶活性。結(jié)果表明，將含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在以上所述的溫度和PH的平均α淀粉酶活性分別是50°C和ρΗ4(175358單位)、50°C和 pH5 (285105 單位)、50°C和 pH7 (318814 單位)、50°C和 pH8. 5(142762 單位)、70 V 和 pH4 (233669 單位)、70°C 和 pH5 (367059 單位)、70°C 和 pH7 (445030 單位)、70 °C和 pH8. 5(210096 單位)、80°C 和 pH4 (239046 單位)、80°C 和 pH5 (426087 單位)、80°C 和PH7 (318690單位)、80°C和ρΗ8· 5 (260819單位)；含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在大麥的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ5和70°C)的平均α淀粉酶活性是218095単位；含地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在地衣芽孢桿菌的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ8. 5和80°C )的平均α淀粉酶活性是138990單位；含曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的發(fā)酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最適合的溫度和pH(70°C和ρΗ4)的平均α淀粉酶活性是103027單位；天然的產(chǎn)α淀粉酶的地衣芽孢桿菌的發(fā)酵液上清(每升)在地衣芽孢桿菌的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ8· 5和80°C )的平均α淀粉酶活性是82917単位；曲霉的發(fā)酵液上清(每升)在曲霉的α淀粉酶的最適合的溫度和ρΗ(ρΗ4和70°C )的平均α淀粉酶活性是7834単位；不含α淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液上清(每升)在以上所述的各種溫度和PH都沒有測(cè)到α淀粉酶活、性。以上發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物的酶活性分析的結(jié)果表明含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌表達(dá)的α淀粉酶在酸性、中性和堿性以及不同的試驗(yàn)溫度都具有良好的α淀粉酶活性，并且其α淀粉酶活性顯著高于(P <0.01)含單種α淀粉酶基因的工程菌或產(chǎn)α淀粉酶的天然菌株的表達(dá)產(chǎn)物的α淀粉酶活性。說明a.含單種α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建的方法與含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建的方法的差別在于表達(dá)載體的構(gòu)建；含單種α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建方法與含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體構(gòu)建的方法的差別在于前者只含ー種Ct淀粉酶基因表達(dá)框架，而后者含三種α淀粉酶基因表達(dá)框架。 c. α淀粉酶活性測(cè)定方法應(yīng)用可溶淀粉平板測(cè)定方法。制備含2%可溶淀粉的瓊脂平板，將牛津杯置于平板上，各取50 μ I不同濃度的α淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)溶液和不同菌株的發(fā)酵液加于不同的牛津杯中，并在每個(gè)杯中加入50 μ I磷酸鹽緩沖液。于50°C放置12小時(shí)，然后用碘-碘化鉀(I2-KI)溶液染色，計(jì)算透明圈直徑。對(duì)以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，結(jié)果分析取平均值。根據(jù)不同濃度的α淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)的透明圈繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)測(cè)試樣品的透明圈直徑和不同濃度的α淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)的透明圈標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)測(cè)試菌株的發(fā)酵液的α淀粉酶活性。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)α淀粉酶的方法，其特征在于，其具體步驟如下 1)、應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆大麥的α淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因和曲霉的α淀粉酶基因； 2)、分別構(gòu)建含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體、釀酒酵母表達(dá)載體和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體； 3)、將畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母從而獲得畢赤酵母重組子，將釀酒酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母從而獲得釀酒酵母重組子，將枯草芽孢桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌從而獲得枯草芽孢桿菌重組子； 4)、篩選高表達(dá)以上所述的三種α淀粉酶的畢赤酵母重組子作為含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌，篩選高表達(dá)以上所述的三種α淀粉酶的釀酒酵母重組子作為含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌，篩選高表達(dá)以上所述的三種α淀粉酶的枯草芽孢桿菌重組子作為含大麥的α淀粉酶基因表達(dá)框架、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因表達(dá)框架和曲霉的α淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌； 5)、分別發(fā)酵以上所述的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產(chǎn)重組混合α淀粉酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種生產(chǎn)α淀粉酶的方法，其特征在干利用權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)α淀粉酶的方法制備成重組混合α淀粉酶產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)α淀粉酶的方法。屬生物技術(shù)領(lǐng)域。首先分別克隆大麥、地衣芽孢桿菌和曲霉的α淀粉酶基因；構(gòu)建含以上三種α淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體、釀酒酵母表達(dá)載體和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體，并將載體分別轉(zhuǎn)化相對(duì)應(yīng)的宿主菌；分別篩選高表達(dá)α淀粉酶的重組子作為工程菌；發(fā)酵畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產(chǎn)重組混合α淀粉酶。與傳統(tǒng)的由單基因編碼的α淀粉酶不同，本發(fā)明生產(chǎn)的重組混合α淀粉酶的適合反應(yīng)的溫度和pH范圍廣，適合于多種用途；并且，含多基因表達(dá)框架的工程菌表達(dá)的α淀粉酶的產(chǎn)量明顯高于含單基因的工程菌表達(dá)的α淀粉酶的產(chǎn)量，起到降低生產(chǎn)成本作用。
文檔編號(hào)C12N9/30GK102747058SQ20121025184
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者劉振旺, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 符仙, 羅進(jìn)賢 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所