專利名稱：雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達的調(diào)控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因調(diào)控方法，具體而言涉及調(diào)控雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達的方法。
背景技術(shù)：
vasa是動物細胞中特異性表達基因，其編碼的蛋白為DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)家族中的一種解旋酶，首先于果蠅中發(fā)現(xiàn)。隨后在水螅、渦蟲、線蟲、尼羅羅非魚、虹鱒、黃鱔、 鯉魚、斑馬魚、爪蟾、雞[11]、小鼠和人等物種中克隆獲得了同源基因。系統(tǒng)進化分析表明從低等無脊椎動物到高等哺乳動物中vasa均保持高度保守?；虮磉_分析表明在絕大多數(shù)物種中，vasa僅表達于生殖細胞中。已經(jīng)證明，vasa基因敲除小鼠生殖細胞不能完成減數(shù)分裂，精子發(fā)生受阻。在雌性果蠅中vasa突變體中卵子有缺陷，即使受精，個體發(fā)育后則會缺少生殖細胞。對斑馬魚和果蠅的研究表明，vasa在卵細胞中為母源性基因，在早期胚胎發(fā)育中起重要作用。另外，vasa可以和諸如0skar、TudOr以及Maufen等蛋白一起參與生殖質(zhì)的形成。有研究表明vasa的表達可引起其它基因的表達下降。進一步的研究表明， vasa和翻譯因子eIF5B可對翻譯過程起調(diào)控作用。目前，vasa已經(jīng)被認為是生殖細胞的特異性標記分子，針對vasa開發(fā)的抗體以及GFP載體等分子標記已經(jīng)運用于多項研究中。vasa最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，在脊椎動物中作為生殖細胞高度特異表達基因，是生殖細胞中公認的分子標志。后來的實驗證明，在不同動物中vasa均為 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)家族中的一種解旋酶。迄今為止，魚類中vasa基因已經(jīng)被廣泛克隆，而且在不同物種中有不同結(jié)構(gòu)。在南方鯰中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有兩種vasa基因，且有很高的同源性。在尼羅羅非魚中，也發(fā)現(xiàn)了兩種 vasa基因片段，這可能是魚類在多倍化的過程中演化而來。本發(fā)明克隆得到的vasa與尼羅羅非魚兩種vasa相似性最高，達到96. 3%和96. 1%，而與其它物種vasa基因的同源性則較低。進化樹分析結(jié)果與奧利亞羅非魚的分類學地位相一致。然而在奧利亞羅非魚中是否也存在著其它形式的vasa基因還有待研究。vasa在脊椎動物中僅僅于生殖細胞中表達，在奧利亞羅非魚中也得到印證。在 vasa基因敲除小鼠中，精子發(fā)生阻滯于第一次減數(shù)分裂的偶線期，從而導致精細胞凋亡，最終引起雄性小鼠不育。在魚類中vasa主要于精原細胞和還未進入減數(shù)第一次分裂的精母細胞中，但在未成熟的精子中表達下降，而在成熟精子中則不表達。本文結(jié)合原代細胞培養(yǎng)技術(shù)，在培養(yǎng)過程中加入不同濃度的LHRH-A后分析原代精巢細胞中vasa mRNA的表達差異。結(jié)果顯示在LHRH-A刺激后vasa mRNA的表達水平明顯降低。在性腺發(fā)育調(diào)控中，下丘腦-垂體-性腺軸在激素水平扮演者重要角色。在適應的環(huán)境刺激下，如溫度、光照等，下丘腦分泌&iRH刺激垂體，垂體LH隨之表達升高，LH進入血液循環(huán)，最終在魚類性腺成熟以及排卵排精過程中起重要作用。奧禾Ij亞羅非魚(Oreochromis aurea)屬于鱸形目(Perciformes),鱺魚科 (Cichlidae)，羅非魚屬(Oreochromis)。奧利亞羅非魚對溫度和鹽度的耐受能力比尼羅羅非魚強，因此在越冬保種時較尼羅羅非魚有優(yōu)勢。在實際生產(chǎn)中，雄性奧利亞羅非魚主要作為奧尼羅非魚的雜交親本在繁殖育種中廣泛使用。生產(chǎn)得到的奧尼雜交羅非魚雄性率很高 (可達95%以上)，不但具有母本尼羅羅非魚生長速度快的優(yōu)勢，而且還具有父本奧里亞羅非魚抗逆性強的優(yōu)勢，是我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)養(yǎng)殖的主要品種之一。隨著我國大規(guī)模羅非魚尤其是雜交羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，必須對其親本的生殖生理調(diào)控進行深入研究，以便指導育種工作。vasa是生殖細胞發(fā)育分化的重要基因，對其進行研究不僅能了解其在奧利亞羅非魚中的作用，而且對今后在奧利亞羅非魚生殖細胞的定位研究開發(fā)分子標記有意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了對雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達進行調(diào)控，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達進行調(diào)控的方法，其特征在于使用 LHRH-A進行調(diào)控。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，其特征在于對奧利亞羅非魚精巢進行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)時使用LHRH-A處理。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，其特征在于LHRH-A的濃度為1(Γ9Μ以上，優(yōu)選為 10、及其以上。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，特征在于所述的羅非魚為奧利亞羅非魚。本發(fā)明另外一方面還涉及一種羅非魚人工繁殖時進行催產(chǎn)的方法，其特征在于給予一定量的LHRH-A。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，其特征在于LHRH-A的濃度為1(Γ9Μ以上，優(yōu)選為 10、及其以上。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，其特征在于所述的羅非魚為奧利亞羅非魚。本發(fā)明另外一方面還涉及LHRH-A在調(diào)控雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達中的應用。
具體實施例方式奧尼亞羅非魚精巢細胞原代培養(yǎng)參照文獻進行，具體方法如下取3條成體奧尼亞羅非魚精巢組織約4g剪碎后PBS清洗3次，5min/次。500U/ml膠原酶25°C消化池后， 用M199 (sigma)培養(yǎng)基稀釋后種入M孔板，每條魚的精巢細胞種12孔，一共36孔。每孔中包含Iml M199培養(yǎng)基。5% CO2, 25°C培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)后的細胞分為4組對照組，低濃度LHRH-A (Sigma) (10_12M)處理組、中濃度LHRH-A(KTkiM)處理組和高濃度LHRH-A (10_8M)處理組，每組3孔作為平行孔。分別在各孔中加入相應濃度的LHRH-A進行處理。2小時后收集細胞提取RNA。提取的RNA進行DNase I消化后，以Iyl RNA進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)獲得的序列設計引物進行實時定量PCR(表1)。將樣本cDNA進行5倍稀釋，反應體系為SOyLdXSTOR Premix Ex Taq (ABI) 10 μ L，上下游引物各 2 μ L(10 μ mol/L)，稀釋后的 cDNA 模板 4 μ L， ddH20 16μ L，95°C IOs預變性，95°C 5s,60°C 34s,40個循環(huán)。擴增完成后進行熔解曲線分析以確定反應是否特異。最后以β-actin為內(nèi)參通過2_“CT計算不同組的相對含量。
用實時定量PCR對不同處理組樣品的vasa mRNA進行檢測。結(jié)果顯示，對照組vasa 表達量最高(P < 0. 05)，設對照組表達量為1。LHRH-A 10_1組表達量最低為0.四士0. 097， (P < 0. 05)。LHRH-A(KTiqM)和 LHRH-A(KT12M)組表達量居中，分別為 0. 43士0. 213 和 0. 39 士 0. 106，但這兩組之間無顯著性差異(P > 0. 05)。實驗結(jié)果顯示LHRH-A對精巢細胞的vasa表達起抑制作用。提示在奧利亞羅非魚生殖細胞最終成熟時，垂體中LH分泌上調(diào)，從而抑制了 vasa的表達。應當理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達量進行調(diào)控的方法，其特征在于使用 LHRH-A進行調(diào)控。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控方法，其特征在于對奧利亞羅非魚精巢進行原代培養(yǎng)， 培養(yǎng)時使用LHRH-A處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控方法，其特征在于LHRH-A的濃度為KT9M以上，優(yōu)選為 10、及其以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的調(diào)控方法，其特征在于所述的羅非魚為奧利亞羅非魚。
5.一種羅非魚人工繁殖時進行催產(chǎn)的方法，其特征在于給予一定量的LHRH-A。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的催產(chǎn)方法，其特征在于LHRH-A的濃度為1(Γ9Μ以上，優(yōu)選為 10、及其以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的催產(chǎn)方法，其特征在于所述的羅非魚為奧利亞羅非魚。
8.LHRH-A在調(diào)控雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種LHRH-A對雄性奧利亞羅非魚精巢細胞vasa基因進行調(diào)控的方法，通過適宜濃度的LHRH-A調(diào)控vasa基因的表達，能夠?qū)崿F(xiàn)在人工繁殖時達到催產(chǎn)的目的。
文檔編號C12N15/63GK102286507SQ201110165008
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者嚴欣, 余高云, 張明, 曹謹玲, 楊麗, 楊軍, 楊弘, 王玉, 甘西, 羅永巨, 肖俊, 郭忠寶, 郭恩彥, 陳麗兵 申請人:廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所