專利名稱：一種微小rna用于調(diào)控cd86的基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微小RNA用于調(diào)控⑶86基因表達(dá)。
背景技術(shù)：
腫瘤一直嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命，傳統(tǒng)的治療方法不盡如人意。免疫治療通過提高腫瘤的免疫原性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，達(dá)到治療腫瘤的目的，是一種變被動(dòng)為主動(dòng)的生物治療方法。由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是抗腫瘤免疫的主要形式，機(jī)體通過對(duì)腫瘤抗原的特異性識(shí)別，激活T細(xì)胞，產(chǎn)生相應(yīng)的免疫殺傷作用。細(xì)胞的有效活化不僅需要T細(xì)胞與抗原肽-MHC復(fù)合物的特異性結(jié)合提供第I信號(hào)，還需要抗原提呈細(xì)胞(APC)表面的共刺激分子與其受體結(jié)合提供第2信號(hào)。最基本的 共刺激信號(hào)是由抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)的⑶80 (B7-1)、⑶86 (B7-2)分子與T細(xì)胞上表達(dá)的相應(yīng)受體提供。CD86只有與靜止型T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合后，才能使T細(xì)胞活化，刺激T細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，在機(jī)體抗腫瘤中起著關(guān)鍵作用(David MS, ClaireNM, Zheng Y. What’s the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology,2003，24 (6) :313-318)。如果缺乏這種共刺激信號(hào)，T細(xì)胞將失能，導(dǎo)致免疫無應(yīng)答，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。分子以單體形式表達(dá)于APC表面。未受抗原刺激的APC中幾乎不表達(dá)⑶86分子，但經(jīng)活化后其表達(dá)顯著上調(diào)。激活的B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞上均表達(dá)高水平⑶86。⑶86還可在靜止的單核細(xì)胞和B細(xì)胞上呈低水平表達(dá)。B細(xì)胞在激活后24 h內(nèi)，CD86分子表達(dá)至高峰，說明CD86可能在T細(xì)胞共刺激早期起關(guān)鍵作用，決定T細(xì)胞是激活還是無反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞是目前已知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，具有獨(dú)特的免疫學(xué)功能，能在體內(nèi)外直接激活靜息期T細(xì)胞，促進(jìn)T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的生成，在誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)中起關(guān)鍵的調(diào)控作用(Jacques B, Ralph MS. Dendriticcells and the control of immunity. Nature, 1998, 392 (6673) : 245-252)。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織及區(qū)域淋巴結(jié)內(nèi)樹突細(xì)胞上CD86的表達(dá)低于正常組織、癌周組織及炎性組織，正是由于腫瘤組織內(nèi)CD86的表達(dá)下降，使樹突細(xì)胞不能有效的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。因此，調(diào)控樹突細(xì)胞上CD86表達(dá)將成為一種新的抗腫瘤治療途徑，具有潛在應(yīng)用價(jià)值(Le TT, Gardner J, Hoang-Le D. Immunostimulatory cancer chemotherapyusing local ingenoI-3-angelate and synergy with immunotherapies. Vaccine2009，27(23):3053-62)。是近年來發(fā)現(xiàn)于真核細(xì)胞中的一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3’ -UTR互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解，或者與之不完全互補(bǔ)結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。越來越多的研究證實(shí)，miRNA在腫瘤組織中表達(dá)異常，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及患者治療反應(yīng)密切相關(guān)；如hsa-miR-21在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，與結(jié)直腸癌 M分期及患者預(yù)后密切相關(guān)(SchetterAJj Leung SYj Sohn JJj et al. MicroRNA expression profiles associated withprognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 2008， 299(4):425-36)。這種在腫瘤組織中表達(dá)異常的miRNA有的已被證實(shí)具有顯著的抗腫瘤活性[Thorsen SB, et al. The Therapeutic Potential of MicroRNAs in Cancer. Cancer J2012，18(3) :275-84.，如miR-145和miR_33a能抑制HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)Ibrahim AF, et al. MicroRNA replacement therapy for miR-145 and miR_33a isefficacious in a model of colon carcinoma. Cancer Res 2011,71:5214-5224.。另夕卜，miR-122由于能調(diào)控丙型肝炎病毒RNA的豐度，其互補(bǔ)序列用于治療丙型肝炎病毒感染患者已經(jīng)進(jìn)入 II 期臨床試驗(yàn)Janssen HL, ReesinkHW, Zeuzem S，et al. A randomized,double-blind, placebo (plb) controlled safety and anti-viral proof of conceptstudy of miravirsen (MIR), an oligonucleotide targeting miR-122, in treatmentnaBve patients with genotype I (gtl) chronic HCV infection. Hepatology.2011:1430A.，顯示出miRNA作為一種極其重要的基因表達(dá)調(diào)控因子和作用靶標(biāo)，具有潛 在的治療作用和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。雖然本領(lǐng)域中已知某些微小RNA與腫瘤具有一定的相關(guān)性，但本領(lǐng)域中已知的miRNA種類繁多，功能各異，要從中篩選出與腫瘤相關(guān)且可作為發(fā)病、治療方案的選擇及預(yù)后的特定miRNA存在較大難度。目前，本領(lǐng)域中尚無miR-31和⑶86基因相關(guān)性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種微小RNA用于調(diào)控CD86基因表達(dá)。本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的一種微小RNA用于調(diào)控⑶86的基因表達(dá)，其特征在于，所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體5’ -aggcaagaugcuggcauagcu - 3’。優(yōu)選地，所述微小RNA能與CD86基因3’ -UTR結(jié)合，抑制CD86基因表達(dá)。 優(yōu)選地，所述微小RNA為miR-31。優(yōu)選地，所述微小RNA通過化學(xué)合成得到。優(yōu)選地，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細(xì)胞和外周血。本發(fā)明微小RNA的獲取來源可以是來自化學(xué)合成和存在該基因序列的細(xì)胞、組織，組織可以選自外周血、體液、腔道的脫落物、病變組織，以及用這些組織制成的石蠟塊、石蠟切片。在本文中，術(shù)語(yǔ)“樣本”指的是潛在可能含有微小RNAmiR-31的離體循環(huán)血樣品，優(yōu)選是來自人的樣品。盡管用抽提出血總RNA的純化樣品也能夠在本發(fā)明中使用，但是，本發(fā)明的樣品優(yōu)選是未經(jīng)提純的、含有血總RNA的裂解液體樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉將固體的有核血細(xì)胞裂解或抽提、純化并保持其中miRNA成分不被降解的細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)。本發(fā)明的樣品可以是經(jīng)過處理的樣品，如稀釋處理、血細(xì)胞裂解處理以及PCR擴(kuò)增等，也可以是未經(jīng)處理的樣品。經(jīng)過處理的樣品可以進(jìn)一步純化，以富集miRNA。在本文中，術(shù)語(yǔ)“miR-31”指的是指的是包含序列“aggcaagaugcuggcauagcu”或其同源序列的微小RNA。本領(lǐng)域中已知各種來源的miR-31，例如人、黑猩猩、馬、雞等，這些同源序列均包含在本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“miR-31”中。本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)中還包含上述天然存在的miR-31序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，或經(jīng)過生物化學(xué)修飾，且仍然具有生物學(xué)活性的衍生RNA。本發(fā)明人采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定了 6例結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中miRNA的表達(dá)；統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果證實(shí)，hsa-miR-31在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織,結(jié)果如圖I所示。本發(fā)明人采用生物信息學(xué)軟件miRanda預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),hsa-miR-31可能與CD86基因3’ -UTR結(jié)合，結(jié)果如圖2所示。隨后，本發(fā)明人采用體外生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hsa-miR-31可與⑶86基因3’ -UTR結(jié)合，從而抑制⑶86分子表達(dá)，可通過調(diào)控⑶86信號(hào)通路和/或miR-31表達(dá)及功能以發(fā)揮抗腫瘤作用。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
圖I結(jié)直腸癌組織中和正常組織中miR-31表達(dá)量測(cè)定結(jié)果；
圖2 miRanda軟件預(yù)測(cè)結(jié)果；
圖3 CD86基因3’ -UTR的PCR擴(kuò)增結(jié)果；
圖4 CD86/3’ -UTR/pGEM-T重組載體酶切驗(yàn)證結(jié)果；
圖5 CD86/3’ -UTR/pGEM-T重組載體測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果；
圖6 CD86/3’ -UTR/ pGL-3重組載體酶切驗(yàn)證結(jié)果；
圖7 CD86/3’ -UTR/ pGL-3重組載體測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果；
圖8 hsa-miR-31對(duì)CD86/3’ -UTR/pGL-3重組載體表達(dá)活性的抑制作用。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。一、試劑與材料 I、試劑
胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；完全培養(yǎng)基每升RPMI1640 (Hyclone，美國(guó))中，添加胎牛血清100ml、L-谷氨酰胺O. 15g、2-巰基乙醇10.0 ml (5X l(T3mol/L);脂質(zhì)體2000(Invitrogen,美國(guó));青霉素、鏈霉素(上海生工生物技術(shù)有限公司);TRIzol (Invitrogen,美國(guó));瓊脂糖(LP0028A，Oxoid Ltd,英國(guó));凝膠電泳加樣液和溴化乙錠(EtBr)(上海生工生物技術(shù)有限公司);膠回收DNA試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒(Axygen,美國(guó));鹿糖、Triton-100、MgCl2*6H20、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、鹽酸、EDTA、NaCl、苯酚、氯仿、異戊醇、十二烷基磺酸鈉(SDS)和無水乙醇等實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega,美國(guó))。hsa-miR-31及其實(shí)時(shí)突光定量試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);TaqDNA聚合酶、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、油a I限制性內(nèi)切酶(MBI，美國(guó))；T4 DNA連接酶(Takar a，日本)；PCR 引物(Invitrogen, PAGE 級(jí))。pGEM-T、pGL-3> pRL-TK 載體(Promega,美國(guó))。、組織樣本
收集6例結(jié)直腸癌患者的新鮮手術(shù)組織樣本，包括癌組織和遠(yuǎn)端正常腸組織(離癌邊沿5cm)。所有患者經(jīng)HE染色、病理診斷確認(rèn)為結(jié)直腸癌；術(shù)前未接受化療或放療。、細(xì)胞株
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株CHO (ATCC，美國(guó));大腸桿菌TPlO (Novagen，美國(guó))。細(xì)胞株經(jīng)檢測(cè)，無支原體污染。、儀器
CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)、常速離心機(jī)(Thermo,德國(guó))；倒置顯微鏡(Olympus,日本)；微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x(BPCL-K，中科院生物物理研究所)；PCR儀(S1000，Bio-Rad，美國(guó))；電泳儀(Bio-Rad,美國(guó))；微量定量分光光度計(jì)(Alpha Innotech,美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)(GeneGenius, SYNGENE,英國(guó))。二、實(shí)驗(yàn)方法· I、細(xì)胞培養(yǎng)
采用含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有100kU/L青霉素、IOOmg/L鏈霉素，培養(yǎng)條件為37° C、5% CO2、飽和濕度。CHO細(xì)胞株貼壁生長(zhǎng)，傳代時(shí)用0. 25%胰酶消化。間隔2-3天更換新鮮培養(yǎng)基。、實(shí)時(shí)熒光定量分析hsa-miR-31表達(dá)量
采用Trizol試劑按照使用說明書從6對(duì)結(jié)直腸癌和正常組織樣本中提取總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒測(cè)定RNA樣本中hsa-miR-31的表達(dá)量；以U6 RNA為內(nèi)對(duì)照。取5μΜRT引物工作液lPL，加入79μ RNsae-free水，配置成62. 5nM RT引物工作液。50μ RT反應(yīng)體系，加入2PL RNA樣品，引物工作液各4μ ，加RNsae-free水至19μ 。以上體系混勻后，瞬時(shí)離心，70° C放置lOmin，冰育2min，再加入以下試劑進(jìn)行RT反應(yīng)1XRT buffer，WLdNTP (10mM),40U RNase inhibitor, 200U RT 酶，加 RNsae-free 水至 50μ 。RT 反應(yīng)程序42° C 60min，70° C lOmin。RT反應(yīng)結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置冰上冷卻，后續(xù)所有步驟都在冰上進(jìn)行。接著進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)定量測(cè)定hsa-miR-31表達(dá)量，20μ 反應(yīng)體系10μ SYBR Green Μ χ,2μ RT反應(yīng)產(chǎn)物，Bulge-Loop miR-31正向引物和反向引物(5μΜ)各2μ ，加RNsae-free水至20μ 。反應(yīng)程序95° C預(yù)變性20sec ;接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(95。C 變性 10sec;60。C 退火 20sec;70。C 延伸 5sec)。、miRNA作用靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)
采用生物信息學(xué)軟件miRanda (www. microRNA. org)預(yù)測(cè)可能與⑶86基因3’ -UTR結(jié)合的miRNA。、構(gòu)建含⑶86基因3’-UTR片段的熒光素酶表達(dá)載體
采用Trizol試劑按照使用說明書從MDA-MB-435細(xì)胞中提取總RNA，以O(shè)ligo (dT)為逆轉(zhuǎn)錄引物，用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。μ L PCR反應(yīng)體系中含有2 μ L cDNA模板，I. 25U Taq DNA聚合酶，I X緩沖液，O. 2mmol/L (1見1^，0.4_01/1正向引物5’-66〇 TAG TCT AGA TAA GGA GTT CTC ATC CCT CTG-3’和反向引物5’-GGC TAG TCT AGA AAG CTT GTC TAG CAT GGC AG-3’(下劃線堿基為內(nèi)切酶Xbal識(shí)別序列)。熱循環(huán)條件為94° C預(yù)變性5min ;然后以94° C變性20sec，60° C退火30sec，72° C延伸I. 5min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72° C延伸7min使反應(yīng)完全。反應(yīng)完成后，取反應(yīng)產(chǎn)物3PL在I. 5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(I X TAE電泳緩沖液，電壓200V，恒壓電泳5min)，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。擴(kuò)增成功的產(chǎn)物采用Sanger’ s測(cè)序法測(cè)定DNA序列(Invitrogen);另取30μ 反應(yīng)產(chǎn)物在2. 0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(I XTAE電泳緩沖液，電壓100V，恒壓電泳lOmin)，然后采用膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段，并用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。參考產(chǎn)品說明書，將純化的⑶86基因3’ -UTR片段克隆到pGEM_T載體；熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑搖菌，抽提質(zhì)粒；PCR擴(kuò)增及酶切鑒定后再進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的重組子用油al酶切后，回收3’ -UTR片段。用PGL-3和pRL-TK載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行大量擴(kuò)增；試劑盒抽提法大量制備PGL-3和pRL-TK質(zhì)粒，電泳檢測(cè)質(zhì)粒的純度和含量。用限制性內(nèi)切酶對(duì)提取的PGL-3質(zhì)粒進(jìn)行酶切，試劑盒直接回收大片段的酶切產(chǎn)物。參考產(chǎn)品說明書，將酶切回收純化后的⑶86基因3’-UTR片段按適當(dāng)比例與pGL-3載體的油al酶切片段進(jìn)行連接反應(yīng)，16° C酶連過夜。取10 μ L連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化100 μ L大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB平板固體培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化子的平板上隨機(jī)挑取10個(gè)菌落，經(jīng)過含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)；經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切和測(cè)序鑒定后，用試劑盒抽提質(zhì)粒備用。 、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
首先，將培養(yǎng)于含有10% FCS、100kU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中細(xì)胞株，按I X IO4個(gè)細(xì)胞/孔的量在24孔板中接種指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，直到細(xì)胞80%匯片。然后，將一定量的hsa-miR-31、CD86/3' _UTR/pGL3重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK稀釋至50 μ L不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養(yǎng)基中，用移液槍混合均勻；然后將I μ L脂質(zhì)體2000懸液加入50 μ L不含血清和抗生素的Opti-MEMsI培養(yǎng)基中，在室溫孵育5min ；最后將兩者混合在一起，充分混勻，靜置20min，使hsa-miR-31、重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒與脂質(zhì)體充分結(jié)合。將只加脂質(zhì)體的孔作為陰性對(duì)照。最后，吸去接種到24孔板中的培養(yǎng)液，用不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養(yǎng)基洗一次，在每個(gè)孔中加入100 μ L上述混合物，培養(yǎng)3h ;吸棄培養(yǎng)板中的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，向各孔加入100 μ L有血清無抗生素的Opti-MEMsI培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行檢測(cè)。、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)基因活性測(cè)定
將轉(zhuǎn)染有PGL-3和pRL-TK的CHO細(xì)胞經(jīng)過24h培養(yǎng)后收集，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗I次。加入裂解液20 μ L/孔，室溫?fù)u動(dòng)15 min0按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒的操作說明書，取100 μ L突光素酶分析緩沖液II于I. 5ml離心管中，設(shè)定化學(xué)發(fā)光儀延遲2sec,發(fā)光儀測(cè)讀IOsec ;將全部細(xì)胞裂解液加入到離心管中，用移液槍輕輕抽吸2-3次混勻(不要旋渦振動(dòng))；將離心管放入化學(xué)發(fā)光儀中測(cè)讀螢火蟲熒光素酶發(fā)光值Fl ;將離心管移出發(fā)光儀，力口AlOOuL Stop&Glo試劑，快速旋渦混勻后，將離心管重放回發(fā)光儀中測(cè)讀海腎熒光素酶發(fā)光值F2。應(yīng)用SPSS. 10統(tǒng)計(jì)軟件的卡方檢驗(yàn)分析受試組與空白對(duì)照組的F1/F2比值差異，以判斷hsa-miR-31的調(diào)控作用。三、結(jié)果
I.hsa-miR-31在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定了 6例結(jié)直腸癌組織和正常組織中miRNA的表達(dá)；統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-31在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，結(jié)果如圖I所示。
與CD86 基因 3’ -UTR 結(jié)合
我們采用生物信息學(xué)軟件miRanda預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-31可能與⑶86基因3’_UTR結(jié)合，結(jié)果如圖2所不。構(gòu)建CD86/3’ -UTR/pGL-3熒光素酶表達(dá)載體
PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為949bp的⑶86基因3’_UTR序列(圖3)，切膠純化回收后，將片段插入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。隨機(jī)挑克隆擴(kuò)增后提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)過油a I酶切鑒定，證實(shí)酶切后得到的基因片段與預(yù)期大小937bp相符(圖4)。測(cè)序結(jié)果表明，插入pGEM-T載體的⑶86基因3’ -UTR片段序列正確，如圖5所示。抽提pGEM-T載體，酶切獲得⑶86基因3’ -UTR片段；將其插入pGL-3載體，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。酶切后 得到的基因片段與預(yù)期大小937bp相符(圖6);測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入序列正確(圖7)。、hsa-miR-31抑制重組熒光素酶表達(dá)活性
將200ng重組CD86/3’ -UTR/pGL-3熒光素酶表達(dá)載體、20ng內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK與IOpmolhsa-miR-31共同轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，采用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后CHO細(xì)胞中熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，在CHO細(xì)胞中加入hsa-miR-31后，熒光素酶的活性比值(pGL-3/pRL-TK)顯著低于不加hsa-miR-31的細(xì)胞(圖8)。由此表明，hsa-miR-31通過與⑶86基因3’ -UTR上靶序列結(jié)合，抑制了熒光素酶的表達(dá)。上述實(shí)例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種微小RNA用于調(diào)控⑶86的基因表達(dá),所述微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體5’ - aggcaagaugcuggcauagcu - 3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA能與CD86基因3’-UTR結(jié)合，抑制⑶86基因表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA為miR-31。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA通過化學(xué)合成得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細(xì)胞和外周血。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微小RNA用于調(diào)控CD86的基因表達(dá)，所述微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體:5’-aggcaagaugcuggcauagcu-3’，所述微小RNA能與CD86基因3’-UTR結(jié)合，抑制CD86基因表達(dá)。本發(fā)明人采用體外生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hsa-miR-31可與CD86基因3’-UTR結(jié)合，從而抑制CD86分子表達(dá)，可通過調(diào)控CD86信號(hào)通路和/或miR-31表達(dá)及功能以發(fā)揮抗腫瘤作用。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102776191SQ20121025261
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者張學(xué)光, 朱健潔, 汪維鵬 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)