專利名稱：鼠李糖乳桿菌pcr檢測(cè)、鑒定特異引物對(duì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，提供了利用PCR技術(shù)快速檢測(cè)、鑒定鼠李糖 乳桿菌的引物對(duì)，適合于微生物肥料質(zhì)檢機(jī)構(gòu)、菌種鑒定機(jī)構(gòu)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)是從健康人腸道分離出的一株乳桿 菌，是目前最受全球關(guān)注的益生菌之一，在食品、保健、醫(yī)療等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。研究人員將其 應(yīng)用于微生物肥料領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)其在腐解有機(jī)物料、凈化水體、促生及抑制病原菌等方面均具 有良好的使用效果。鑒于鼠李糖乳桿菌的多功能性，已有很多企業(yè)將其用于微生物肥料生產(chǎn)，鼠李糖 乳桿菌作為有效菌的微生物肥料產(chǎn)品日益增多；另一方面，在產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，乳 桿菌種類(lèi)多，表型相似，很難快速準(zhǔn)確區(qū)分，而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要是以形態(tài)特征和各項(xiàng)生 理生化方法為主，存在著檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，費(fèi)用高，準(zhǔn)確性差等缺點(diǎn)。因此，迫切需要 研究建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)新方法，以滿足以鼠李糖乳桿菌為有效菌的微生物肥料產(chǎn) 品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和時(shí)效性。PCR方法有著快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，使用種特異引物對(duì)菌株進(jìn)行特異PCR擴(kuò) 增用于微生物快速鑒定技術(shù)已經(jīng)廣泛用于食品安全、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域如對(duì)各種病毒和病 源體-乙肝病毒、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等病源菌已建立了 PCR檢測(cè)方法；在微生物 肥料領(lǐng)域也得到了應(yīng)用，關(guān)大偉等人曾建立了的特異PCR法用于沼澤紅假單胞菌的鑒定和 檢測(cè)，曹鳳明等人建立了一種鑒定微生物肥料中側(cè)孢短芽孢桿菌的特異PCR方法，都取得 了良好的應(yīng)用效果。這都表明了隨著技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)將在微生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā) 揮著越來(lái)越重要的作用。為將PCR技術(shù)更廣泛應(yīng)用于微生物肥料檢測(cè)和菌種鑒定領(lǐng)域，本 發(fā)明人利用NCBI中I^rimer-BLAST(引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具)，以Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中 某個(gè)鼠李糖乳桿菌的gyrB基因(促旋酶基因)為目標(biāo)模板序列設(shè)計(jì)出一對(duì)鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)種特異性引物。并通過(guò)反復(fù)摸索實(shí)踐建立了基于PCR技術(shù)的、 能夠快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)微生物肥料中鼠李糖乳桿菌的方法。該方法適用于鼠李糖乳桿 菌的檢測(cè)和鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明內(nèi)容的關(guān)鍵是提供用于檢測(cè)、鑒定鼠李糖乳桿菌的特異引物對(duì)。另一內(nèi)容 是提供利用這對(duì)引物對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增鑒定鼠李糖乳桿菌的方法。具體而言，本發(fā)明利用已公布的鼠李糖乳桿菌gyrB核酸序列為目標(biāo)模板序列， 利用NCBI中ft~imer-BLAST(引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具)設(shè)計(jì)出-對(duì)鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillusrhamnosus)種特異性引物。通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)中的鎂離子濃度和退火溫度 等條件來(lái)提高PCR方法的特異性，并根據(jù)優(yōu)化結(jié)果建立了鼠李糖乳桿菌的特異PCR鑒定方 法，用于微生物肥料中鼠李糖乳桿菌的檢測(cè)和鑒定。
本發(fā)明用于檢測(cè)、鑒定鼠李糖乳桿菌的引物對(duì)序列為上游引物(F)5' -GACGCAGCCGGTTGACCCAA-3‘；下游引物(R)5' -GGCGGCAGTTGCCCCAGAAT-3‘。本發(fā)明用于鑒定鼠李糖乳桿菌的PCR方法為PCR反應(yīng)體系10X buffer2. 0μ L
Mg2+(25mmol/L)1. 6μ L
dNTPS(10mmol/L)1. 6μ L
上游引物(20μπιΟ1/7L)0. 5μ L
下游引物OOymol/7L)0. 5μ L
Taq E (2. 5U/ μ L)0. 2μ L
模板DNALOyL
補(bǔ)足ddH20至20 μ L
PCR擴(kuò)增參數(shù)-MV 3min94 "C60s
67 "C45 s L 30個(gè)循環(huán)72 0C60 s -J
72 0C IOmin。


圖1為應(yīng)用鼠李糖乳桿菌特異引物對(duì)鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及乳桿菌屬其它菌 株進(jìn)行PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，各泳道的具體說(shuō)明如下
鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus ACCC10534T) 鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus CGMCC 1. 104) ^糖乳桿菌(L. rhamnosus CGMCC 1. 552) 鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus CGMCC 1. 26) 直物乳桿菌(L. ρlantarum CGMCC 1. 2437τ) 耆酸乳桿菌(L. acidophilus CGMCC 1. 1878τ)泳道1 :Ι
泳道2:1
泳道3:丨
泳道4 I
泳道5 I
泳道
泳道7 :P
泳道8 1. 1480)
泳道9 -J
泳道101. 2624τ)
泳道11
泳道12
泳道13
泳道14
泳道15
泳道16
德氏乳桿菌德氏亞種(L. deIbrueckii
1. 13)
；tis CGMCC 1. 2625τ) subsp.delbruekii CGMCC
1. 2435)
2626τ) 1. 2623)
1. 6)
泳道17 發(fā)酵乳桿菌(L. fermentium CGMCC 1. 1880τ)泳道18 玉米乳桿菌(L. zeae CICC20290)泳道19 戊糖乳桿菌(L. pentosus CICC20301)泳道20 高加索酸奶乳桿菌(L. kefiri CICC6080)泳道21 類(lèi)植物乳桿菌(L. paraplantarum CICC 22192)圖2為應(yīng)用鼠李糖乳桿菌特異引物對(duì)鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及微生物肥料常見(jiàn) 非乳桿菌屬菌株進(jìn)行PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，各泳道的具體說(shuō)明如下泳道1
泳道2
泳道3
泳道4
泳道5
泳道6
泳道7
泳道8
泳道9
泳道10
泳道1具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方案進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例用鼠李糖乳桿菌特異性引物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)。(1)材料測(cè)試菌下面表1所列標(biāo)準(zhǔn)菌株為測(cè)試菌。表 權(quán)利要求
1. 一種用于檢測(cè)、鑒定鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)的特異性擴(kuò)增引物 對(duì)，其特征在于，其序列為上游引物(F) 5' -GACGCAGCCGGTTGACCCAA-3‘； 下游引物(R) 5' -GGCGGCAGTTGCCCCAGAAT-3‘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一對(duì)鼠李糖乳桿菌的特異引物，這對(duì)引物可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出鼠李糖乳桿菌。同時(shí)建立了鼠李糖乳桿菌的PCR鑒定方法，可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物是否產(chǎn)生特異的鼠李糖乳桿菌條帶(大小為376bp)，對(duì)微生物肥料中的鼠李糖乳桿菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102146458SQ20111002767
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者關(guān)大偉, 馮瑞華, 姜昕, 曹鳳明, 李俊, 李力, 楊小紅, 沈德龍, 葛一凡, 邴曉會(huì), 陳慧君 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所