專利名稱：植物乳桿菌pcr檢測、鑒定特異引物對(duì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，提供了利用PCR技術(shù)快速檢測、鑒定植物乳 桿菌的引物對(duì)，適合于微生物肥料質(zhì)檢機(jī)構(gòu)、菌種鑒定機(jī)構(gòu)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物乳桿菌與人類的生活關(guān)系密切，是一種常見于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制 品中的乳酸菌。在食品、青貯飼料、美容、水產(chǎn)養(yǎng)殖、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物防腐劑、益生菌制劑、 以及醫(yī)療保健等領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注并都有著廣泛的應(yīng)用。在微生物肥料行業(yè)，研究 發(fā)現(xiàn)其在腐解有機(jī)物料、凈化水體、促生及抑制病原菌等方面均具有良好的使用效果。鑒于植物乳桿菌的多功能性，已有很多企業(yè)將其用于微生物肥料生產(chǎn)，植物乳桿 菌作為有效菌的微生物肥料產(chǎn)品日益增多；另一方面，在產(chǎn)品質(zhì)量檢測過程中發(fā)現(xiàn)，乳桿菌 種類多，表型相似，很難快速準(zhǔn)確區(qū)分，而傳統(tǒng)的檢測方法主要是以形態(tài)特征和各項(xiàng)生理生 化方法為主，存在著檢驗(yàn)周期長，操作繁瑣，費(fèi)用高，準(zhǔn)確性差等缺點(diǎn)。因此，迫切需要研究 建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測新方法，以滿足以植物乳桿菌為有效菌的微生物肥料產(chǎn)品檢測 的準(zhǔn)確性和時(shí)效性。PCR方法有著快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，使用種特異引物對(duì)菌株進(jìn)行特異PCR擴(kuò) 增用于微生物快速鑒定技術(shù)已經(jīng)廣泛用于食品安全、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域如對(duì)各種病毒和病 源體-乙肝病毒、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病源菌已建立了 PCR檢測方法；在微生物 肥料領(lǐng)域也得到了應(yīng)用，關(guān)大偉等人曾建立了的特異PCR法用于沼澤紅假單胞菌的鑒定和 檢測，曹鳳明等人建立了一種鑒定微生物肥料中側(cè)孢短芽孢桿菌的特異PCR方法，都取得 了良好的應(yīng)用效果。這都表明了隨著技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)將在微生物檢測領(lǐng)域發(fā) 揮著越來越重要的作用。為將PCR技術(shù)更廣泛應(yīng)用于微生物肥料檢測和菌種鑒定領(lǐng)域，本 發(fā)明人利用NCBI中I^rimer-BLAST(引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具)，以Genbank數(shù)據(jù)庫中 某個(gè)植物乳桿菌的recA基因(重組蛋白基因)為目標(biāo)模板序列設(shè)計(jì)出一對(duì)植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)種特異性引物。并通過反復(fù)摸索實(shí)踐建立了基于PCR技術(shù)的、 能夠快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測微生物肥料中植物乳桿菌的方法。該方法適用于植物乳桿菌的 檢測和鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明內(nèi)容的關(guān)鍵是提供用于檢測、鑒定植物乳桿菌的特異弓丨物對(duì)。另一內(nèi)容是 提供利用這對(duì)引物對(duì)待測菌株進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增鑒定植物乳桿菌的方法。具體而言，本發(fā)明利用已公布的植物乳桿菌recA核酸序列為目標(biāo)模板序列， 利用NCBI中I^rimer-BLAST (引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具)設(shè)計(jì)出一對(duì)植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum)種特異性引物。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)中的鎂離子濃度和退火溫度 等條件來提高PCR方法的特異性，并根據(jù)優(yōu)化結(jié)果建立了植物乳桿菌的特異PCR鑒定方法， 用于微生物肥料中植物乳桿菌的檢測和鑒定。
本發(fā)明用于檢測、鑒定植物乳桿菌的引物對(duì)序列為上游引物(F)5' -GTTGACTCGGTGGCGGCCTT-3‘；下游引物(R)5' -GGAGCGCTTGTGACATCAGCCG-3‘。本發(fā)明用于鑒定植物乳桿菌的PCR方法為PCR反應(yīng)體系10X buffer2. 0μ L
Mg2+(25mmol/L)1. 6μ L
dNTPS(10mmol/L)1. 6μ L
上游引物(20μπιΟ1/7L)0. 5μ L
下游引物OOymol/7L)0. 5μ L
Taq E (2. 5U/ μ L)0. 2μ L
模板DNALOyL
補(bǔ)足ddH20至20 μ L
PCR擴(kuò)增參數(shù)-MV 3min94 0C60s
67 0C45 s L 30個(gè)循環(huán)72 0C60 s J
72 0C IOmin。


圖1為應(yīng)用植物乳桿菌特異引物對(duì)植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及乳桿菌屬其它菌株進(jìn) 行PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，各泳道的具體說明如下 1. 1480)
1. 2624τ)
泳道1 :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp標(biāo)準(zhǔn)分子量
泳道 2 植物乳桿菌(Lactobacillus ρlantarum CGMCC 1. 2437τ)
泳道 3 植物乳桿菌(L. ρ lantarum CGMCC 1. 2158)
泳道 4 植物乳桿菌(L. ρ lantarum CGMCC 1. 555)
泳道 5 植物乳桿菌(L. ρ lantarum ACCC 10533)
泳道 6 植物乳桿菌(L. ρ lantarum ACCC 10644)
泳道 7 鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus ACCC10534T)
泳道 8 嗜酸乳桿菌(L. acidophilus CGMCC 1. 1878τ)
泳道9 德氏乳桿菌保加利亞亞種(L. delbrueckii subsp. bulgaricus CGMCC
泳道 10 德氏乳桿菌乳亞種(L. delbrueckii subsp. Iactis CGMCC 1. 2625τ) 泳道 11 德氏乳桿菌德氏亞種(L. delbrueckiisubsp. delbruekii CGMCC
泳道 12 布氏乳桿菌(L.buchneri CGMCC 1. 13)
泳道 13 干酪乳桿菌干酪亞種(L. casei subsp. casei CGMCC 1. 2435)
泳道 14 鼠乳桿菌(L. murinus CGMCC 1. 2626τ)
泳道 15 動(dòng)物乳桿菌(L. animal is CGMCC 1. 2623)
泳道16 清酒乳桿菌(L. sake CGMCC 1. 6)泳道 17 瑞士乳桿菌(L. helveticus ACCC10532T)
泳道 18 發(fā)酵乳桿菌(L. fermentium CGMCC 1. 1880τ)
泳道19 玉米乳桿菌(L. zeae CICC20290)
泳道 20 戊糖乳桿菌(L. pentosus CICC20301)
泳道21 高加索酸奶乳桿菌(L. kefiri CICC6080)
泳道 22 類植物乳桿菌(L. paraplantarum CICC 22192)
圖2為應(yīng)用植物乳桿菌特異引物對(duì)植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及微生物肥料常見非乳 桿菌屬菌株進(jìn)行PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，各泳道的具體說明如下泳道1 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)100bp標(biāo)準(zhǔn)分子量
泳道2 植物乳桿菌(Lactobacillus planrum CGMCC 1.2437T)
泳道3 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CCTCCAB92068T)
泳道4 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis CCTCCAB92069T)
泳道5 膠東樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus VKPM B-7519T)
泳道6 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium CCTCCAB92075T)
泳道7 多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa CCTCCAB92076T)
泳道8 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida CGMCC 1.1839)
泳道9 側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus lateterosporus CGMCC 1.2829)
泳道10戊糖乳桿菌(Pediococcus pentotosaceus 1.2695)
泳道11乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis1.2829)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方案進(jìn)一步說明。實(shí)施例用植物乳桿菌特異性引物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行PCR檢測。(1)材料測試菌下面表1所列標(biāo)準(zhǔn)菌株為測試菌。表 權(quán)利要求
1. 一種用于檢測、鑒定植物乳桿菌(LactcAacillus plantarum)的特異性擴(kuò)增引物 對(duì)，其特征在于，序列為上游引物(F) 5' -GTTGACTCGGTGGCGGCCTT-3‘； 下游引物(R) 5' -GGAGCGCTTGTGACATCAGCCG-3‘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一對(duì)植物乳桿菌的特異引物，這對(duì)引物可以快速、準(zhǔn)確地檢測出植物乳桿菌。同時(shí)建立了植物乳桿菌的PCR鑒定方法，可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物是否產(chǎn)生特異的植物乳桿菌條帶(大小為100bp)，對(duì)微生物肥料中的植物乳桿菌進(jìn)行檢測和鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102146457SQ20111002766
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者關(guān)大偉, 馮瑞華, 姜昕, 曹鳳明, 李俊, 李力, 楊小紅, 沈德龍, 葛一凡, 邴曉會(huì), 陳慧君 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所