專利名稱：一種?？芗?xì)胞素及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種?？芗?xì)胞素的編碼基因、氨基酸序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海洋生物中，很多可以產(chǎn)生毒素，如海蛇、水母、?？?、芋螺等。這些毒素性質(zhì)獨特， 具有廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)活性、心血管系統(tǒng)活性和細(xì)胞活性等多種生物學(xué)活性，在生物醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)以及藥學(xué)的研究和應(yīng)用方面有廣闊的前景。?？挠|手及身體均含有大量的刺細(xì)胞，每個刺細(xì)胞里都有一個特殊囊狀的細(xì)胞器，名為刺絲囊，內(nèi)儲存著毒液，刺絲管盤曲在刺絲囊內(nèi)，刺絲尖端為刺針，當(dāng)受到機(jī)械或化學(xué)刺激時，會釋放刺絲刺入獵物身體并通過刺絲管將毒素注入獵物體內(nèi)。對?？舅氐难芯孔?0世紀(jì)70年代開始，目前已經(jīng)從約40種海葵中分離到超過300種毒素，根據(jù)分子量以及生物學(xué)功能的不同，可以分為海葵溶細(xì)胞毒素以及?？嚯念惿窠?jīng)毒素兩大類。?？芗?xì)胞素(actinoporin)是一類分子量在20KD左右，對膜上鞘磷脂有特異性偏好的一類的蛋白家族。目前，已經(jīng)從20多種?？蟹蛛x鑒定了 30多種溶細(xì)胞素。從海奏Actinia equina 中分離的Equinatoxin—2禾口從海奏Stichodactylahelianthus 中分離的 Micholysins-2是目前研究的最深入的兩種actinoporin。它們的氨基酸序列已測定，并且作了基因克隆、表達(dá)和功能研究以及晶體結(jié)構(gòu)的測定(Lani0，M.E. ,Morera,V. ,Alvarez, C. , Tejuca, Μ. , Gomez, Τ. , Pazos, F. , Besada, V. , Martinez, D. , Huerta, V. , Padron, G. , de Ios Angeles Chavez, M. ,2001. Purificationand characterization of two hemolysins from Stichodactyla helianthus. Toxicon 39,187—194 ；Macek, P. , Lebez, D. , 1988. Isolation and characterization of three lethaland hemolytic toxins from the sea anemone Actinia equina L. Toxicon 26,441-451·)。?？芗?xì)胞素是研究真核生物成孔類毒素與膜相互作用的最常用的模式蛋白。目前研究認(rèn)為膜孔形成的機(jī)制過程如下毒素的正電荷與磷脂雙分子層表面的負(fù)電荷相互吸引而靠近，為可逆過程；然后，可變換構(gòu)象的N端雙親性螺旋區(qū)插入膜內(nèi)，一定濃度的毒素蛋白聚合形成三或四聚體形成陽離子通道，該過程為不可逆過程。?？芗?xì)胞素具有十分廣泛的生理活性，包括心肌毒性、溶細(xì)胞作用、引起肺水腫、抗菌、抗腫瘤等，其中最典型的是在細(xì)胞膜上形成穿孔，使細(xì)胞破碎、溶解，在抗菌、殺蟲、抗腫瘤方面有應(yīng)用價值。Micholysins-2對紅細(xì)胞的半數(shù)溶解濃度為30ng/ml。對老鼠離體心臟的研究表明，Equinatoxin-2降低左心室血壓，引起心律失常以及乳酸脫氫酶 (LDH)的釋放，最終導(dǎo)致心力衰竭(Bunc，Μ.，Drevensek, G.，Budihna, Μ.，Suput, D.，1999. Effects of equinatoxin II from Actiniaequina(L. )on isolated rat heart :the role of direct cardiotoxic effects in equinatoxin IIlethality. Toxicon 37,109-123·)。隨著對海洋資源的日益關(guān)注，新發(fā)現(xiàn)的?？芗?xì)胞素會不斷增多，對海葵溶細(xì)胞素的結(jié)構(gòu)和功能研究也將不斷深入。對?？窠?jīng)毒素廣泛而深入的研究有助于合理而充分的利用我國豐富的?？Y源，為新藥研制以及?？U傷的救治措施都具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種新的?？芗?xì)胞素編碼基因、氨基酸序列，載體，以及在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明中所用海葵為地毯?？?Heteractis magnifica)，采自南海海域。其形態(tài)特征如下地毯?？址Q巨大異輻?？w為紅色，觸手呈褐色。觸手自基部到末端的直徑相當(dāng)，呈直筒狀。整株?？闹睆綖镮m左右。經(jīng)過對該地毯?？挠|手進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，獲得了分子量約19KD的溶細(xì)胞毒素 Cytolysin-4,對Cytolysin-4進(jìn)行N端測序，得到N端的20個氨基酸序列。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計引物，從?？|手總RNA中擴(kuò)增Cytolysin-4的cDNA序列，獲得了 Cytolysin-4的cDNA 全長序列，其cDNA全長為629bp，將序列遞交Genbank進(jìn)行同源序列比對，結(jié)果顯示與已報道的?？芗?xì)胞素核酸序列不完全相同，是一個新的毒素蛋白。CLUSTLW氨基酸序列比對結(jié)果表明，Cytolysin-4與已報道的海葵溶細(xì)胞素Cytolysin-3、RTX-A, Sticholysin-I和 Micholysin-2，有較高的同源性，相似性分別為90%、88%、83%、87%。本發(fā)明提供了一種?？芗?xì)胞素Cytolysin-4的編碼基因，其核苷酸序列如下CTCATCGTCTTATTTCTGATCGTTACCATGATATGTGCGACCATCGCTGTGCCATCTGGAAAGGAATTCCAAGGCAGAAAAGAGGACAAGAAGAGTGCAGCACTCGCTGGCACAATTATCGAAGGGGCAAGTCTAGGTTTCCAAATCCTTGACAAAGTACTCACAGAACTTGGTAAAGTGTCTCGGAAGATTGCTATCGGTATCGACAACGAGTCAGGAGGGTCATGGACAGCAATGAATGCATATTTCCGTTCTGGTACTACAGACGTCATTCTACCAGAGTTTGTCCCAAACCAAAAAGCGCTACTCTACAGCGGTCGGAAGGACACAGGCCCTGTTGCAACGGGCGCTGTGGGTGCCCTTGCCTATTACATGAGCGATGGAAACACTCTTGCCGTTATGTTCAGCGTTCCCTTTGACTACAACCTGTACAGCAACTGGTGGGATGTCAGAGTCTAT
AGTGGGAAGAGGAGAGCCGACCAAAAGATGTACGAAGACCTCTATAATGGCTCTCCATTTCGAGGGGACAATGGATGGCACCAGAAGAATCTTGGATATGGACTGAGGATGAAGGGAATCATGACAAGTGCTGGCGAAGCAAAACTGCAAATTAGGATTTCACGCTAATA (SEQ ID NO :1，劃線部分不翻譯)本發(fā)明還提供了一種?？芗?xì)胞素Cytolysin-4的氨基酸序列如下LIVLFLIVTMICATIAVPSGKEFQGRKEDKKSAALAGTIIEGASLGFQILDKVLTELGKVSRKIAIGIDNESGGSffTAMNAYFRSGTTDVILPEFVPNQKALLYSGRKDTGPYATGAYGALAYYMSDGNTLAYMFSYPFDYNLYSNffffDYRYYSGKRRADQKMYEDLYNGSPFRGDNGffHQKNLGYGLRMKGIMTSAGEAKLQIRISR(SEQ ID NO :2，劃線部分為成熟蛋白)本發(fā)明還提供了?？芗?xì)胞素Cytolysin-4在制備治療?？U傷藥物、溶血藥物、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對?？芗?xì)胞素Cytolysin-4的性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)其有很強(qiáng)的溶血活性，且具有鞘磷脂酶的活性，可以特異性地水解各種細(xì)胞膜及脂質(zhì)體上的鞘磷脂。
本發(fā)明提供了一種新的溶細(xì)胞毒素蛋白Cytolysin-4的序列信息及作用機(jī)制，可為治療海葵蟄傷提供新的思路，同時，Cytolysin-4能特異性地水解細(xì)胞膜上的鞘磷脂從而破壞細(xì)胞膜的完整性，可輔助藥物的穿膜吸收，有可能在腫瘤治療中發(fā)揮一定的作用。


圖1是本發(fā)明的?？芗?xì)胞素Cytolysin-4的鞘磷脂酶活性實驗結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實施例不應(yīng)看作對本發(fā)明范圍的限制。實施例1 海葵溶細(xì)胞素Cytolysin-4的分離純化取地毯?？?采自南海海域，北緯17. 3° N，東經(jīng)113° E)觸手組織5g剪碎，加入20ml冷的去離子水勻漿，15000rpm離心20分鐘去除殘渣。0. 45 μ m的濾器過濾即得到?？舅氐拇侄?，保存于_75°C。取Iml粗毒樣品上HitrapCapto S陽離子交換柱，該柱預(yù)先用0. 05mol/L的醋酸銨緩沖液(pH 5.5)平衡。上樣完畢后用0 %，11 %，21 %，30 %和 100% lmol/L氯化鈉緩沖液(含0. 05mol/L的醋酸銨，pH 5. 5)梯度洗脫，每個梯度洗脫時間為5min，流速為lml/min。收集洗脫時間為Il-Hmin的組分并冷凍干燥。將凍干樣品用 0. 15mol/L 醋酸銨緩沖液(pH 5.5)復(fù)溶，取 2ml 過 HiLoad 16/60Superdex 75prep grade 凝膠層析柱，以同樣的緩沖液平衡和洗脫，流速為lml/min。收集洗脫體積為83_88ml的組分并冷凍干燥，即得到Cytolysin-4的純品，將Cytolysin-4保存在-75V。另取少量進(jìn)行 SDS-PAGE (十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)，顯示其分子量約為19KD。實施例2 地毯海葵觸手總RNA提取和cDNA合成準(zhǔn)備無RNA酶的器具，地毯海葵觸手總RNA的提取按照TaKaRa公司RNAiso Plus 的說明書操作；cDNA合成按照Fermentas RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit 的說明書操作。提取的總RNA經(jīng)電泳檢測可見18S和28S兩條帶，說明總RNA的完整性較好。實施例3 :Cytolysin-4基因的克隆、序列測定和分析根據(jù)與Cytolysin-4同源性較高的?？芗?xì)胞素Hmg III的⑶S序列設(shè)計兩條引物，上游引物為5，CGTCTCATCGTCTTATTT3，(SEQ ID NO 3)；下游引物為5，TGTCTTCTTATTAGCGTG3，(SEQ ID NO :4)。以實施例2得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測，在630bp附近有特異性擴(kuò)增條帶?；厥沾藯l帶送至上海英駿生物技術(shù)有限公司(Irwitrogen)進(jìn)行核酸序列測定，得到的序列進(jìn)行blast同源分析，結(jié)果顯示與已報道的?？芗?xì)胞素核酸序列不完全相同，是一種新的毒素蛋白。CLUSTLW氨基酸序列比對結(jié)果表明，Cytolysin-4與已報道的海葵溶細(xì)胞素Cytolysin-3、RTX-A, Sticholysin-I和Micholysin-2，有較高的同源性，相似性分別為90%、88%、83%、87%。實施例4 本發(fā)明的?？芗?xì)胞素Cytolysin-4的溶血活性將成熟人血用PBS漂洗幾次至上清清亮，棄上清。紅細(xì)胞與PBS按1 50稀釋， 反應(yīng)總體積1. 5ml，其中紅細(xì)胞懸液0. 5ml,PBS與Cytolysin-4共1ml。每組另設(shè)陰性對照(不加毒素)、陽性對照(0.5% Triton X-100)。加樣后37°C振蕩30min，然后3000 X g離心5min，取上清檢測420nm吸光度值，重復(fù)3次，計算溶血分?jǐn)?shù)。溶血分?jǐn)?shù)=[(樣品管吸光度值-陰性對照管吸光度值)/陽性對照管吸光度值]X100%o結(jié)果表明CytoIysin-4的濃度為40ng/ml時，即可引起50 %的紅細(xì)胞溶血，說明該溶細(xì)胞素具有很強(qiáng)的溶血活性。其溶血活性與來自?？麃V化110(1￡1(^71￡11161化11讓118中分離的Micholysins-I和Micholysins_2基本一致，它們引起50%的紅細(xì)胞溶血的濃度約是 30-45ng/mlo實施例5 本發(fā)明的?？芗?xì)胞素Cytolysin-4的鞘磷脂酶活性TNPAL-sphingomyelin (三硝基苯氨基月桂酰基鞘磷脂，購自Sigma公司)是人工合成的帶有顯色基團(tuán)的鞘磷脂衍生物，是鞘磷脂酶的特異性底物。該底物與鞘磷脂酶反應(yīng)后，水解產(chǎn)生TNPAL顯色基團(tuán)，該基團(tuán)在330nm處有吸收值。將不同濃度(0. 15yg,0. 3yg, 0· 6μ g、l. 2μ g、2. 4μ g)的 Cytolysin-4 與 TNPAL-sphingomyelin 在 37°C反應(yīng) 2min，然后終止反應(yīng)，在330nm檢測吸光度值。陽性對照是商品化的來自金黃色葡萄球菌的鞘磷脂酶。 結(jié)果表明0. 3 μ g的Cytolysin-4就能水解3nmol的底物，表現(xiàn)出了比較顯著的鞘磷脂酶活性，如圖1所示。
權(quán)利要求
1.一種?？芗?xì)胞素，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.—種?？芗?xì)胞素，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的海葵溶細(xì)胞素在制備治療?？U傷藥物、溶血藥物或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種?？芗?xì)胞素的編碼基因、氨基酸序列及其應(yīng)用。?？芗?xì)胞素(actinoporin)是一類分子量在20KD左右，對膜上鞘磷脂有特異性偏好的一類的蛋白家族，具有十分廣泛的生理活性，包括心肌毒性、溶細(xì)胞作用、引起肺水腫、抗菌、抗腫瘤等。本發(fā)明目的是提供一種新的?？芗?xì)胞素，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明的?？芗?xì)胞素有很強(qiáng)的溶血活性和鞘磷脂酶的活性。
文檔編號C12N15/12GK102174097SQ201110027250
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者劉軍華, 劉小宇, 盧小玲, 焦炳華, 王國祥, 胡波, 高云 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)