專利名稱：基于表面電極技術的高通量細胞電融合芯片裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞電融合技術，具體涉及一種基于表面電極的高通量細胞電融合芯片裝置，其主要使用范圍為動物、植物、微生物細胞的融合細胞制備，同時也可應用于電穿孔、電轉染等研究中，可廣泛應用于遺傳學、動植物遠緣雜交育種、發(fā)育生物學、藥物篩選、 單克隆抗體制備、哺乳動物克隆等領域。
背景技術：
細胞電融合技術自上世紀80年代起，因為其效率較高、操作簡便、對細胞無毒害， 便于觀察，適于儀器應用和規(guī)范操作等優(yōu)點，得到了快速發(fā)展和廣泛應用。細胞電融合可以分為兩個主要階段細胞排隊和細胞融合。細胞排隊的原理在于生物細胞處于非均勻電場中時，被電場極化形成偶極子，該偶極子在非均勻電場作用中會受到特定的力而發(fā)生運動，即介電電泳 (dielectrophoresis).利用介電電泳可以控制細胞的運動，在細胞電融合過程中，利用介電電泳現(xiàn)象使細胞排列成串，壓緊相互接觸的細胞，完成細胞電融合過程所需的排隊和融合后壓緊。細胞融合的原理在于強電場作用會導致細胞膜穿孔，這種效應稱為細胞膜電致穿孔效應(electroporation)。在細胞電融合過程中利用電致穿孔效應，使兩接觸的細胞膜穿孔，從而使細胞間進行膜內物質交換，使細胞質、膜融合，在一定強度的電場作用下的電穿孔是一種可逆穿孔，細胞膜會在減小或撤銷電場強度時回復原狀，產生細胞電融合過程的膜融合。傳統(tǒng)的細胞電融合系統(tǒng)通常都采用大型融合槽，其優(yōu)點在于(1)操作較為簡便， 采用大型融合槽降低了包括樣品進樣與出樣等步驟的難度；(2)加工簡便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量級，利用傳統(tǒng)的機械加工手段可以較為方便地加工出所需要的融合槽結構；(3)融合量大，傳統(tǒng)的融合槽可以容納數(shù)毫升樣品，一次實驗即可獲得足夠的細胞進行后期篩選、培養(yǎng)等工作。但傳統(tǒng)的細胞電融合設備也存在一些缺點(1)由于融合槽中的電極間距較大， 要達到夠強度的細胞排隊、融合及壓緊信號，需要很高的外界驅動電壓，往往高達幾百上千伏，對系統(tǒng)的電氣安全性要求高，系統(tǒng)的成本也因此大為提高；(2)電極間的較大間距不利于對細胞的精確控制等。為解決這一問題，研究者將細胞電融合技術與MEMS加工技術相結合。MEMS技術的加工范圍通常在1 50 μ m，這與細胞的直徑范圍相當，所產生的微結構能有效控制細胞。有多家研究機構開始研究利用微流控芯片技術或者微電極陣列技術構建生物芯片來實現(xiàn)細胞電融合操作。例如，美國MIT的研究人員提出了利用微流控芯片技術實現(xiàn)對細胞的精確控制， 達到高效的細胞配對和融合；國內趙志強等研究人員也提出了利用MEMS技術構建微電極陣列，通過構建微米量級間距的微電極陣列，實現(xiàn)在低電壓條件下的細胞電融合。日本研究者提出的利用一對微電極，通過流路控制細胞的流動，使細胞運動到微電極對位置區(qū)域后， 利用電場作用使兩個細胞形成配對，再借助于電脈沖實現(xiàn)電融合。但上述芯片仍然存在一定的問題，如美國MIT所研究的微流控芯片雖然較好的解決了細胞配對的問題，但該芯片兩電極間的間距較大，仍然需要較高的外界電壓才能夠實現(xiàn)電融合。而趙志強提出的芯片所集成的微電極數(shù)量較少，不能實現(xiàn)高通量融合；微電極所產生的電場強度和電場梯度也比較弱，難以實現(xiàn)細胞的精確控制；所選擇的加工材料的抗腐蝕、抗氧化能力也較差；同時，由于未集成進出樣裝置，操作也較為不便。日本研究者提出的方法效率較低，融合通量遠不能滿足融合后細胞研究的要求。重慶大學胡寧等研究人員在上述芯片的基礎上也提出了包括三維微電極陣列、柔性微電極陣列、基于微小室結構的細胞電融合芯片等結構，解決了一些問題；本發(fā)明的專利是對上述研究的進一步深入探索。國內外相關專利如下 200610054121. χ, 2006年，重慶大學，趙志強等； CN1482234，2003年，中國科學院上海技術物理研究所，張濤等； CN86210174,1995年，遼寧腫瘤研究所，梁偉；
4326934， April 27， 1982， Pohl; 441972， April 10， 1982， Pohl； 4578168， March 25， 1986， Hofman； 4695547， Sep 22， 1987， Hillard; 4699881， Oct 13， 1987，Matschke, et al.； 5007995， Apr 16， 1991， Takahizuki。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提出一種基于表面電極的高通量細胞電融合芯片裝置，芯片上集成陣列化的微電極結構，保證微電極的集成度和較好的融合效率， 微電極貼附于多聚物微通道層上，避免傳統(tǒng)的齒狀突出電極結構帶來的細胞堵塞問題。本發(fā)明的技術方案如下
基于表面電極的高通量細胞電融合芯片裝置，其由微電極陣列芯片和帶進出樣導管的蓋片構成；其特征在于
所述微電極陣列芯片它自下而上依次分為石英基底層、多聚物微通道層和頂層保護層。在所述石英基底層上形成有底層梳狀微電極陣列，所述底層梳狀微電極陣列在石英基底層上以梳齒相對的形式對稱設置兩組。所述多聚物微通道層的中間加工有上下開敞的微通道，其位置對應于底層梳狀微電極陣列兩組之間的位置，微通道的兩端為儲樣孔。在所述多聚物微通道層上形成有與底層梳狀微電極陣列形狀和位置均對應的頂層梳狀微電極陣列，并在微通道的側壁上形成有側壁表面電極，側壁表面電極分別連接底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列對應的每一對梳齒，使底層梳狀微電極陣列、側壁表面電極和頂層梳狀微電極陣列電氣聯(lián)通；所述底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列的電信號輸出和輸出端分別通過金絲采用金絲鍵合工藝與在各自的外側形成鍵合點， 實現(xiàn)與外界控制電路的電氣連接，使外圍電信號在芯片內部形成細胞電融合所需的電場。所述帶進出樣導管的蓋片通過表面等離子處理后鍵合在所述微電極陣列芯片上， 其上的進出樣導管分別連通微通道兩端的儲樣孔。本發(fā)明通過底層梳狀微電極陣列、側壁電極和頂層梳狀微電極陣列電氣聯(lián)通，結合多聚物微通道層，組成“三明治”結構，使多聚物微通道層中的微通道形成光滑的流路通道。電極的材料一致，均選用導電性優(yōu)異、抗氧化能力強、生物相容性好的金、鉬等材料，厚度在0.廣0.5 μ m。多聚物微通道層的厚度為4(Γ50μπι，微通道的寬度為6(Γ 00μπι，以保證細胞在微通道內部的自由流動，同時，微通道的拐角處均做圓角處理，以降低細胞在微通道內部流動受到的阻力，多聚物的材料選用光敏聚酰亞胺。石英基底層選用透光度高的石英玻璃，其厚度在500 μ πΓ ΟΟΟ μ m,以為芯片提供較好的支撐。蓋片選用PDMS等生物相容性好，透光的材料進行加工制造，其上集成了進樣和出樣導管，以保證樣品能夠順利在其內部流動。本發(fā)明具有如下優(yōu)點
本裝置可借助底層梳狀微電極陣列、側壁電極和頂層梳狀微電極陣列電氣聯(lián)通，結合多聚物微通道層組成的“三明治”結構，在保證微電極的集成度和較好的融合效率的同時， 由于側壁電極和頂層梳狀微電極陣列是制作在多聚物微通道層上的，相當于與多聚物微通道層貼附，電極可以做得較薄，由此形成光滑的流路通道，其光滑的微通道流路結構有利于細胞在微通道內部的流動，降低了現(xiàn)有的具有鋸齒狀電極結構的微通道易使細胞堵塞的可能，消除了以往的齒狀電極存在的突出電極影響微通道內部細胞流動的弊端。同時，金質的電極使微電極陣列結構芯片具有良好的電導通特性，結合微電極梳齒間較小的間距可以保證低壓驅動條件下的高效融合。本芯片材料具有良好的生物相容性及抗腐蝕性能，這保證了芯片的可靠性，也提高了細胞融合的安全性。同時，芯片內部集成了大量的微電極陣列， 可實現(xiàn)大量細胞的同時融合，融合效率高。


圖1基于表面電極技術的高通量細胞電融合芯片裝置示意圖； 圖2基于表面電極技術的高通量細胞電融合芯片裝置組裝示意圖3基于表面電極技術的高通量細胞電融合芯片裝置的各功能層的分解示意圖； 圖4基于表面電極技術的高通量細胞電融合芯片的電極的分布結構示意圖； 圖5基于表面電極技術的高通量細胞電融合芯片的剖面結構示意圖。
具體實施例方式實施例1
參見圖1、圖2和圖3，基于表面電極技術的高通量細胞電融合芯片裝置由高通量細胞電融合芯片1和帶進出樣導管的蓋片2組成。參見圖3，高通量細胞電融合芯片1自下而上依次為石英基底層3、多聚物微通道層5和頂層保護層8。
底層梳狀微電極陣列4、側壁表面電極層6、頂層梳狀微電極陣列層7、其特點在于底層梳狀微電極陣列層4、側壁電極層6和頂層梳狀微電極陣列層7電氣聯(lián)通，并組成“三明治”結構的側壁表面電極陣列9，結合石英基底層3和多聚物微通道層5，形成光滑的流路通道10。底層梳狀微電極陣列層4采用微加工技術制作在石英基底層3上，以梳齒相對的形式對稱設置兩組，材料選用導電性能優(yōu)異，生物相容性強的金、鉬等材料，厚度為0. Γ0. 5 ym。結合圖4可見，其梳齒11的寬度為20 μ m，同一梳脊12上兩相鄰梳齒11間的間距為 60 μ m，梳齒11的長度為100 μ m，梳脊12的寬度為100 μ m。梳脊12的長度可根據(jù)集成微電極的數(shù)目進行調整，梳脊12上有兩個外圍鍵合點13。多聚物微通道層5的厚度為2(Γ40 μ m，材料選用光敏聚酰亞胺便于加工成型。多聚物微通道層5中間設置有上下未封閉的微通道10，微通道的寬度為60 μ m，其兩端各有一整個儲樣孔14，儲樣孔14的直徑為200 500 μ m。頂層梳狀微電極陣列7是在完成多聚物微通道層5的加工后，通過濺射、光刻等工藝手段在多聚物微通道層5上加工而得，頂層梳狀微電極陣列層7與底層梳狀微電極陣列形狀和位置均對應，并在多聚物微通道層5的微通道的側壁上形成有側壁表面電極，側壁表面電極分別連接底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列對應的每一對梳齒，使底層梳狀微電極陣列、側壁表面電極和頂層梳狀微電極陣列電氣聯(lián)通。側壁表面電極的寬度為 20 ym，高度為多聚物微通道層5的高度(2(Γ40 μ m)，厚度與頂層微電極陣列6的厚度一樣，為0.廣0.5 μπι。頂層微電極陣列層7依然有兩個鍵合點15。在制作完成頂層微電極陣列7后，再次使用光敏聚酰亞胺材料在其表面制作一層保護層8，主要作用在于保護頂層微電極陣列7。底層梳狀微電極陣列4和頂層梳狀微電極陣列7的電信號輸出和輸出端分別通過金絲采用金絲鍵合工藝在各自的外側形成鍵合點13和15，與外界形成電氣連接。帶進出樣導管的蓋片2由PDMS蓋片16和導管17組成。PDMS蓋片上設置有進樣口 18和出樣口 19，進樣口和出樣口的直徑為500 μ m，其上安裝導管17.
以上高通量細胞電融合芯片1和帶進出樣導管的蓋片2鍵合而成，外界電信號可直接加載于鍵合點13或15上(加載方式可采用鍵合或者直接用一夾具夾住鍵合點，進而加載電信號)。實施例2 本裝置的使用方法
在實驗中，可使用微量泵將細胞懸浮液從實施例1中的進樣口 18注入芯片內部，當細胞懸浮液流經微通道10時，經鍵合點13或15加載正弦波電刺激信號，相對的側壁微電極間將形成一非均勻梯度電場，微電極間的兩個細胞將在介電電泳力作用下進行細胞排隊。 完成排隊后，施加方波脈沖序列信號，完成排隊的細胞對將在微電極間高強度的脈沖電場作用下完成細胞電穿孔-細胞電融合等過程。完成細胞電融合過程后，再利用微量泵注入細胞培養(yǎng)液，將微通道內的細胞經微通道10、儲樣孔14、出樣口 19及導管17流出，獲得細胞緩沖液可利用培養(yǎng)皿進行收集，進行后期的培養(yǎng)。隨后，再次使用微量泵注入細胞懸浮液，再次進行上述的電融合過程，進而實現(xiàn)連續(xù)的細胞電融合。實施例3 高通量細胞電融合芯片裝置的制作采用MEMS加工工藝，其加工工藝如下A.清洗石英玻璃片；
B.將石英玻璃片置于蒸發(fā)爐中，蒸發(fā)沉積形成2000
C.旋涂AZ4620于金膜表面，曝光顯影后形成與底層微電極陣列結構相同的圖形；
D.將石英玻璃片先后置于金腐蝕液和HF腐蝕液中，去除多余的金膜，形成底層微電極陣列結構；
E.丙酮去除底層微電極陣列結構表面殘余的AZ4620；
F.清洗；
G.旋涂PI7510于石英玻璃片表面，曝光顯影形成多聚物微通道層，顯影后置于固化爐中固化PI7510形成微通道結構；
H.清洗；
I.旋涂AZ4620于石英玻璃片上，曝光顯影后置于丙酮中去除多余殘膠，形成于底層微電極陣列結構相同的形狀結構；
J. 將石英玻璃片置于濺射爐中，濺射金屬(金或鉬)形成底層微電極陣列結構，由于凹槽較底層微電極陣列結構及多聚物微通道層寬，因此將在多聚物微通道的側壁形成一層金屬層，形成側壁表面電極；
K. 完成濺射后將石英玻璃片置于丙酮中去除多余殘留的PI7510膠及多余金屬，形成最終的底層微電極陣列結構和側壁表面電極結構； L.清洗；
M. 旋涂PI2210于石英玻璃片上，曝光顯影形成多聚物頂層保護層，顯影后置于固化爐中固化PI2210，僅露出側壁表面電極、鍵合區(qū)和微通道區(qū)域； N.清洗，獲得芯片。PDMS蓋片的加工通過倒模工藝實現(xiàn)，材料選用PDMS，加工步驟如下
A.利用印刷電路板制作工藝，模具結構為細胞懸浮液進樣口和出樣口；
B.將模具固定于一培養(yǎng)皿上；
C.倒入混合好的PDMS混合膠，靜止后抽真空；
D.置于加熱臺上75°C固化；
E.揭下固化后PDMS，根據(jù)底層結構形狀剪裁，并去除進樣口、出樣口的膠即可。完成上述加工后，將芯片與PDMS蓋片鍵合形成一密閉腔體，僅通過進樣口和出樣口進行細胞懸浮液的進出樣。
權利要求
1.基于表面電極的高通量細胞電融合芯片裝置，其由微電極陣列芯片和帶進出樣導管的蓋片構成；其特征在于所述微電極陣列芯片自下而上依次分為石英基底層、多聚物微通道層和頂層保護層； 在所述石英基底層上制作有底層梳狀微電極陣列，所述底層梳狀微電極陣列在石英基底層上以梳齒相對的形式對稱布置兩組；所述多聚物微通道層的中間加工有上下開敞的微通道，其位置對應于底層梳狀微電極陣列兩組之間的位置，微通道的兩端為儲樣孔；在所述多聚物微通道層上制作有與底層梳狀微電極陣列形狀和位置均對應的頂層梳狀微電極陣列，并在微通道的側壁上形成有側壁表面電極，側壁表面電極分別連接底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列對應的每一對梳齒，使底層梳狀微電極陣列、側壁表面電極和頂層梳狀微電極陣列電氣聯(lián)通；所述底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列的電信號輸出和輸出端分別通過金絲采用金絲鍵合工藝在各自的外側形成鍵合點，實現(xiàn)與外界控制電路的電氣連接；所述帶進出樣導管的蓋片通過表面等離子處理后鍵合在所述微電極陣列芯片上，其上的進出樣導管分別連通微通道兩端的儲樣孔。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于表面電極的高通量細胞電融合芯片裝置，其特征在于 所述底層梳狀微電極陣列、側壁表面電極和頂層梳狀微電極陣列厚度為0. Γ0.5μπιο
3.根據(jù)權利要求1所述的基于表面電極的高通量細胞電融合芯片裝置，其特征在于 所述多聚物微通道層的厚度為4(Γ50μπι，微通道的寬度為6(Γ 00μπι。
全文摘要
一種基于表面電極的高通量細胞電融合芯片裝置，其由微電極陣列芯片和帶進出樣導管的蓋片構成。微電極陣列芯片自下而上依次分為石英基底層、多聚物微通道層和頂層保護層；在石英基底層上制作底層梳狀微電極陣列，多聚物微通道層的中間有微通道，其上制作與底層梳狀微電極陣列形狀和位置均對應的頂層梳狀微電極陣列，并在微通道的側壁上形成側壁表面電極，側壁表面電極分別連接底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列對應的每一對梳齒，使三者電氣聯(lián)通組成三明治結構。本發(fā)明通過使微電極陣列貼附與多聚物微通道層上，避免傳統(tǒng)的齒狀突出電極結構帶來的細胞堵塞問題，同時保證微電極的集成度和較好的融合效率。
文檔編號C12N15/02GK102174388SQ20111002692
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權日2011年1月25日
發(fā)明者侯文生, 劉琳琳, 廖彥劍, 張小玲, 徐濤, 楊軍, 羅洪艷, 胡寧, 胡晉豪, 許莎, 鄭小林 申請人:重慶大學