專利名稱：一株植物乳桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一株優(yōu)良乳酸菌及其應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
生物胺是一類含氮的脂肪族、芳香族或雜環(huán)類有機化合物。主要有酪胺、組胺、腐 胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亞精胺。在人體內積累到較高數(shù)量時就會產生毒害，如外部 血管膨脹導致高血壓和頭痛，以及腸道平滑肌的收縮造成腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等，嚴重的 還會危及生命。 食品中常見的8種生物胺中精胺和亞精胺是原料中帶來的，其它生物胺均由微生 物產生的氨基酸脫羧酶催化氨基酸脫羧產生的，其主要存在于蛋白質含量高的發(fā)酵食品 中。發(fā)酵肉制品中生物胺含量已受廣大關注，國外學者已做了大量的調查，認為生物胺在 發(fā)酵肉制品中普遍存在，特別是在發(fā)酵香腸中，一些產品中生物胺遠遠超過了FDA規(guī)定的 標準。例如，傳統(tǒng)中式香腸屬自然發(fā)酵香腸，其中微生物菌系及其復雜，在本課題組的調查 研究中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中式香腸中生物胺含量，遠遠高國外學者報道，生物胺含量達1651. 84mg/ kg。對消費者的健康有重要影響。發(fā)酵肉制品中主體生物胺一般為酪胺、腐胺和尸胺。
目前在傳統(tǒng)肉制品發(fā)酵生產中對生物胺的控制主要從兩方面可以實現(xiàn)一是控制 產胺菌的生長，另一方面采用能夠產生物胺氧化酶的微生物產生的生物胺氧化酶，減少生 物胺積累。例如，在傳統(tǒng)中式香腸中主要的產胺菌是腸細菌，腸細菌產生生物胺是在對數(shù)生 長后期，并且菌數(shù)達到一定濃度時才協(xié)同產生生物胺。所以抑制腸細菌的生長，把腸細菌控 制在最低濃度，是有效控制生物胺產生的重要措施。 因此，為控制傳統(tǒng)中式香腸中生物胺的產生和累積，以生長能力強，抑制腸細菌能 力強，產生物胺氧化酶為目的，從生物胺含量低的傳統(tǒng)中式香腸樣品中分離篩選出一株植 物乳桿菌，可有效控制生物胺的產生和累積。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對肉制品發(fā)酵生產中產胺菌會產生生物胺，篩選一種能夠 在肉制品發(fā)酵生產中產生生物胺氧化酶，抑制產胺菌的生長，氧化并降解生物胺的植物乳 桿菌菌株及其應用。 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的 一 株植物乳桿菌(Lactobaci 1 lusplantarum) xlbf002，其特征在于菌株的保藏號為CGMCC No. 3167，菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37。C培 養(yǎng)36h，在改良MRS液體培養(yǎng)基中富集，白色菌落，直桿，成短鏈，革蘭氏陽性，無鞭毛，同型 發(fā)酵，發(fā)酵葡萄糖不產氣，發(fā)酵核糖時產生乙酸和乳酸，不還原亞硝酸鹽；該菌株在普通顯 微鏡下呈桿狀，該菌株16S rDNA的Genbank登陸號為GQ890358。 在本發(fā)明中所述的MRS瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸 檬酸氫三銨2g，葡萄糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳 0. 25g，瓊脂18克，蒸餾水1000mL， pH值6. 2 6. 4 ;所述的改良MRS液體培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨2g，葡萄糖20g，吐溫80 lmL，乙酸鈉5g，磷酸 氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，碳酸鈣0. 4g，半胱氨酸鹽酸鹽，乳精粉7. 5g，啤酒 65ml，蒸餾水1000mL， pH值6. 2 6. 4。 上述一株植物乳桿菌的應用，其特征在于將菌株活化、擴培、菌體收集后形成發(fā) 酵劑，在肉制品發(fā)酵生產中產生生物胺氧化酶，抑制產胺菌的生長，氧化并降解生物胺。
在所述一株植物乳桿菌的應用中所述的菌株活化是指從斜面挑取菌落接種于 裝有液體培養(yǎng)基的試管中，37t:靜置培養(yǎng)24小時后，取菌液再接種于裝有改良MRS液體培 養(yǎng)基的試管中37t:靜置培養(yǎng)22小時，試管中的接種量為106cfu/ml，取菌液接種活化至少 反復三次；所述的擴培是指將活化的菌液接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三 角瓶中的接種量為106cfu/ml，37t:靜置培養(yǎng)22小時，形成富集菌種的菌液；所述的菌體收 集是指取富集菌種的菌液于無菌離心管中，10000轉離心10分鐘，在無菌條件下棄去上清 液獲得菌體，獲得的菌體可做為發(fā)酵劑直接應用，也可以制成干粉發(fā)酵劑。
在所述一株植物乳桿菌的應用中所述的發(fā)酵劑是指將收集到的菌體用無菌生 理水洗出直接作為發(fā)酵劑，或在菌體中加入保護劑后冷凍干燥，制成干粉發(fā)酵劑。
在所述一株植物乳桿菌的應用中所述的產胺菌是指屎腸球菌，糞腸球菌，產氣 腸桿菌，大腸埃希桿菌，陰溝腸桿菌；所述產胺菌產生的生物胺是指酪胺，腐胺，尸胺，苯 乙胺；產生的生物胺氧化酶所氧化降解的生物胺是腐胺和尸胺。 在所述一株植物乳桿菌的應用中在肉制品發(fā)酵生產的配方中發(fā)酵劑的加入量為 106—7cfu/g，同時需要加入1. 5%的葡萄糖。 本發(fā)明的優(yōu)點在于一株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)xlbf002生長 能力強，富集培養(yǎng)后培養(yǎng)基中菌體濃度達10 fu/ml，發(fā)酵劑制備工藝簡單，將獲得的菌體 置于保護劑中，可以在生產干粉發(fā)酵劑時減少植物乳桿菌的失活率，發(fā)酵劑在肉制品發(fā)酵 生產中能有效抑制腸細菌的生長繁殖，控制生物胺的產生，另外本菌株產生的生物胺氧化 酶，可減少生物胺的累積。


圖1是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)xlbf002菌株在普通顯微鏡下的 圖片。
具體實施例方式
實施例1 菌株的篩選和保藏 本菌株是從傳統(tǒng)中式香腸中分離出來不產生物胺的菌株，將分離到菌株培養(yǎng)液離 心，取上清液，觀察上清液對五種產胺菌的抑制能力。并將其接入含有生物胺的培養(yǎng)基中， 檢測氧化減少生物胺能力。 該菌屬革蘭氏陽性菌，白色菌落，直桿，成短鏈，無鞭毛，同型發(fā)酵，發(fā)酵葡萄糖不 產氣，發(fā)酵核糖時產生乙酸和乳酸，不還原亞硝酸鹽，不產生吲哚，硫化氫產生陰性，凝固酶 陰性；該菌株在普通顯微鏡下呈桿狀。 該菌株根據(jù)Gen bank比對結果，命名為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)xlbf002，于2009年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏
號為CGMCC No. 3167。通用引物U968，L1401擴增的該菌株16S rDNA的Genbank登陸號為
GQ890358。 實施例2 植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)xlbf002對產胺菌的抑制作用實驗用產 胺菌屎腸球菌 培養(yǎng)基MRS瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨2g， 葡萄糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，瓊脂18克， 蒸餾水1000mL， pH值6. 2-6. 4。
實驗方法 將傳統(tǒng)中式香腸中優(yōu)勢產胺腸菌尿腸球菌涂布于MRS瓊脂的培養(yǎng)皿；將24小時 37t:培養(yǎng)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) xlbf002菌液，8000轉離心10分鐘，用 無菌槍頭吸取上清液于無菌離心管中。取已滅菌的直徑為0. 6cm濾紙沾取此上清液，并放 置于上述接種腸細菌的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，觀察抑菌圈。抑菌圈為大于1. Ocm，說明xlbf002 對屎腸球菌有抑制作用。 用同樣的方法分別對糞腸球菌、產氣腸桿菌、大腸埃希桿菌以及陰溝腸桿菌，抑菌 圈均大于1. Ocm，證明植物乳桿菌xlbf002對上述產胺菌具有相同的抑制作用。
實施例3 植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)xlbf002氧化并降解生物胺的作用。
生物胺腐胺和尸胺 培養(yǎng)基改良MRS液體培(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨2g，葡 萄糖20g，吐溫80 lmL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，碳酸鈣0. 4g， 半胱氨酸鹽酸鹽，乳精粉7. 5g，啤酒65ml，蒸餾水1000mL， pH值6. 2 6. 4。
實驗方法 實驗分成三個組，分別對應于腐胺、尸胺和對照組，在各組的改良MRS液體培養(yǎng)基 中分別加入500ug/ml的生物胺和空白做為對照，115t:滅菌15min ;冷卻后實驗組接入植物 乳桿菌(Lactobacillus plantarum) xlbf002，接種量為106cfu/ml， 37°C ，搖床(85轉/分 鐘)培養(yǎng)72小時，HPLC測各組生物胺濃度的變化，其中腐胺減少了 144.87iig/ml，尸胺減 少了 146. 42 ii g/ml。說明植物乳桿菌xlbf002對生物胺的氧化和降解作用明顯。
實施例4
菌體的收集 培養(yǎng)基改良MRS液體培(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨2g，葡
萄糖20g，吐溫80 lmL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，碳酸鈣0. 4g，
半胱氨酸鹽酸鹽，乳精粉7. 5g，啤酒65ml，蒸餾水1000mL， pH值6. 2 6. 4。 稱取上述培養(yǎng)基，放800ml蒸餾水中，加熱并攪拌均勻至完全溶解后，補水至
1000ml。再次攪拌均勻后，分裝于試管中，并用橡皮篩塞緊后，來滅菌，以備活化用。將做好
的培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，滅菌后用于擴培。 1、活化 從斜面挑取菌落接種于裝有液體培養(yǎng)基的試管中，37t:靜置培養(yǎng)24小時后，取菌液再接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的試管中37t:靜置培養(yǎng)22小時，試管中的接種量為
1(fcfu/ml，取菌液接種活化至少反復三次。 2、擴培 將活化的菌液接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶中的接種量為 1(fcfu/ml，37t:靜置培養(yǎng)22小時，形成富集菌種的菌液。
3、菌體收集 取富集菌種的菌液于無菌離心管中，10000轉離心IO分鐘，無菌條件下棄去上清
液。即收集到菌體。
實施例5
發(fā)酵劑的制備 1、將收集到的菌體用無菌生理水洗出，形成發(fā)酵劑。 2、將收集到的菌體置于保護劑中，制成干粉發(fā)酵劑，其中，保護劑為15%的脫脂乳 +甘油50mL/L+蔗糖30g/L5+麥芽糊精10g/L+谷氨酸鈉20g/L+酵母浸提膏20g/L。
實施例6 在肉制品發(fā)酵生產中的應用(以廣式香腸為例) 配方去皮豬肉，肥瘦比為1 : 3，含硝精鹽2.5% (每公斤食鹽中加入6g亞硝 酸鈉)葡萄糖1. 5% ，蔗糖2% ，生抽1 % ，汾酒4% ，香辛料適量，實施例5中制備的發(fā)酵劑 106cfu/g。 加工方法 1.將肥肉切成約0. 5cm 放入IO(TC沸水中浸1小時，用冷水沖洗去浮油，瀝干，拌 上汾酒，蔗糖，4°C 6°C腌制8小時。 2.把瘦肉用絞肉機絞碎或用刀切成黃豆粒大小的碎塊，加入含硝精鹽，香辛料，生 抽和葡萄糖拌均，4t: 6t:腌制24小時。后加入發(fā)酵劑拌均。 3.將肥瘦肉放在一起拌勻，灌腸后，用溫水洗去腸體表面浮油，并用針在腸表面扎 孔，便于放氣。 4.瀝水后，日曬或煙熏2 3天后，陰干成熟一個月，即可食用。 以本發(fā)明生產的廣式香腸樣品中，生物胺總量低于同期生產的未加發(fā)酵劑的廣式
香腸樣品(下稱對照組)的60%以上。本發(fā)明生產的樣品成熟結束時檢測不到腸細菌，而對
照組樣品中腸細菌量為102cfu/g。本發(fā)明生產的樣品中成熟結束時乳酸菌含量為108cfu/
g，對照組樣品中乳酸菌數(shù)為105cfu/g?？梢姡参锶闂U菌xlbf002的迅速繁殖可有效抑制
腸細菌，抑制生物胺產生，減少生物胺累積。 以上各實施例不是對本發(fā)明的具體限制。
權利要求
一株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在于菌株的保藏號為CGMCC No.3167，菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36h，在改良MRS液體培養(yǎng)基中富集，白色菌落，直桿，成短鏈，革蘭氏陽性，無鞭毛，同型發(fā)酵，發(fā)酵葡萄糖不產氣，發(fā)酵核糖時產生乙酸和乳酸，不還原亞硝酸鹽；該菌株在普通顯微鏡下呈桿狀，該菌株16S rDNA的Genbank登陸號為GQ890358。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在 于所述的MRS瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨2g，葡萄 糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，瓊脂18克，蒸餾 水lOOOmL， pH值6. 2 6. 4 ;所述的改良MRS液體培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉膏l(xiāng)Og，酵母 膏5g，檸檬酸氫三銨2g，葡萄糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g， 硫酸錳0. 25g，碳酸鈣0. 4g，半胱氨酸鹽酸鹽，乳精粉7. 5g，啤酒65ml ，蒸餾水lOOOmL， pH值 6. 2 6. 4。
3. —種保藏號為CGMCC No.3167的一株植物乳桿菌的應用，其特征在于將菌株活化、 擴培、菌體收集后形成發(fā)酵劑，在肉制品發(fā)酵生產中抑制產胺菌的生長，產生生物胺氧化 酶，氧化降解生物胺。
4. 根據(jù)權利要求3所述的保藏號為CGMCC No. 3167的一株植物乳桿菌的應用，其特征 在于所述的菌株活化是指從斜面挑取菌落接種于裝有液體培養(yǎng)基的試管中，37t:靜置 培養(yǎng)24小時后，取菌液再接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的試管中37t:靜置培養(yǎng)22小時， 試管中的接種量為106cfu/ml，取菌液接種活化至少反復三次；所述的擴培是指將活化的 菌液接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶中的接種量為1(fcfu/ml，37t:靜 置培養(yǎng)22小時，形成富集菌種的菌液；所述的菌體收集是指取富集菌種的菌液于無菌離 心管中，10000轉離心10分鐘，在無菌條件下棄去上清液獲得菌體；獲得的菌體可做為發(fā)酵 劑直接應用，也可以制成干粉發(fā)酵劑。
5. 根據(jù)權利要求4所述的保藏號為CGMCC No.3167的一株植物乳桿菌的應用，其特征在于所述的發(fā)酵劑是指將收集到的菌體用無菌生理水洗出直接作為發(fā)酵劑，或在菌體中加入保護劑后冷凍干燥，制成干粉發(fā)酵劑。
6. 根據(jù)權利要求3所述的保藏號為CGMCC No.3167的一株植物乳桿菌的應用，其特征在于所述的產胺菌是指屎腸球菌，糞腸球菌，產氣腸桿菌，大腸埃希桿菌，陰溝腸桿菌 (發(fā)酵肉制品中常見的產胺菌)；所產生的生物胺是指酪胺，腐胺，尸胺，苯乙胺；所產生的 生物胺氧化酶可氧化的生物胺為腐胺和尸胺。
7. 根據(jù)權利要求3 6之一所述的保藏號為CGMCC No. 3167的一株植物乳桿菌的應 用，其特征在于在肉制品發(fā)酵生產的配方中發(fā)酵劑的加入量為106—7cfu/g，同時需要加入 1.5%的葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及保藏號為CGMCC No.3167的一株植物乳桿菌菌株，該菌株可在改良MRS液體培養(yǎng)基中富集，在MRS瓊脂培養(yǎng)基上呈白色菌落，直桿，成短鏈，革蘭氏陽性，無鞭毛，同型發(fā)酵，發(fā)酵葡萄糖不產氣，發(fā)酵核糖時產生乙酸和乳酸，不還原亞硝酸鹽。應用中將菌株活化、擴培、菌體收集后形成發(fā)酵劑，在肉制品發(fā)酵生產中產生生物胺氧化酶，抑制產胺菌的生長，氧化并降解生物胺。其優(yōu)點是植物乳桿菌生長能力強，發(fā)酵劑制備工藝簡單，發(fā)酵劑在肉制品發(fā)酵生產中能有效抑制腸細菌的生長繁殖，控制生物胺的產生，另外本菌株產生的生物胺氧化酶可氧化降解尸胺和腐胺，因此將本菌株做為發(fā)酵劑生產發(fā)酵肉制品可有效減少生物胺的累積。
文檔編號A23L1/314GK101701203SQ20091023271
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權日2009年11月27日
發(fā)明者劉登勇, 盧士玲, 周光宏, 張秋勤, 徐幸蓮 申請人:南京農業(yè)大學