專利名稱：一種木聚糖酶的發(fā)酵方法及發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種木聚糖酶的發(fā)酵方法及發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
木聚糖是植物半纖維素的主要成分，是自然界中廣泛存在的、含量僅次于纖維素的可再生性多糖資源。木聚糖酶，主要是由P-1，4-D-內(nèi)切木聚糖酶和P-l，4-D-外切木糖苷酶組成，此外還有一些脫支鏈酶，如a -L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、a -葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶等，其可降解木聚糖中的￠-1,4糖苷鍵，這一作用既可降低木聚糖的粘性和抗?fàn)I養(yǎng)性，又可產(chǎn)生具保健和調(diào)節(jié)胃腸功能的低聚木糖，因而有廣泛的應(yīng)用前景。國內(nèi)外眾多研究均已證實木聚糖酶應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，可改善畜禽消化道功能、增強免疫力、提高飼料利用率和生產(chǎn)性能、減少糞便對環(huán)境的污染；應(yīng)用于食品工業(yè)，可提高食品品質(zhì)和加工效率，還具保健功能；應(yīng)用于造紙工業(yè)，則可大大減少毒性漂白劑的使用，降低紙的脆性，有效減少有毒廢液對環(huán)境的污染。雖然木聚糖酶的應(yīng)用價值早已在世界范圍內(nèi)得到確認(rèn)，但由于該酶在天然材料中表達水平太低、難以大量生產(chǎn)、并且生產(chǎn)成本昂貴以及木聚糖酶的一些酶活性不能完全滿足應(yīng)用相關(guān)條件，因此，到目前為止木聚糖酶并沒有得到很好的推廣應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過基因工程技術(shù)這一手段，利用生物反應(yīng)器則有望成百上千倍地提高其表達量，運用基因工程技術(shù)在分子水平上對木聚糖酶進行分子改造，則可望解決一些木聚糖酶活性(如抗逆性、PH值、熱穩(wěn)定性等)的應(yīng)用缺陷。國外對重組木聚糖酶的研究開展較早，并先后從天然微生物，如黑曲霉、木霉及芽孢桿菌中克隆出其基因并實現(xiàn)異源表達。但受表達水平的限制，當(dāng)前市場上銷售的木聚糖酶仍然以天然酶為主。然而，微生物在分泌木聚糖酶的過程中，通常伴有其它酶類的分泌，這無疑大大增加了分離純化的難度和生產(chǎn)成本。何軍，“高效木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建及重組酶沒學(xué)性質(zhì)與功效研究”，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)中公開了一種含有編碼里氏木霉木聚糖酶基因序列的重組畢赤酵母工程菌PX-I，其表達產(chǎn)物能夠有效分泌至培養(yǎng)基，且雜蛋白分泌量極少，但是產(chǎn)酶水平低，僅為560U/ml，不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求，如何進一步提高異源表達水平是實現(xiàn)木聚糖酶工業(yè)化廉價生產(chǎn)的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的木聚糖酶發(fā)酵方法及發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明提供了一種制備木聚糖酶的方法，它包括如下步驟i、取包含SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的重組畢赤酵母菌，接種到Y(jié)PD種子培養(yǎng)基上，pH為5. 4^5. 6，溫度為2擴31°C下培養(yǎng)，制備得到種子液；U、取步驟i制備的種子液，以廣3%的接種量接種到酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵pH為5. 4 5. 6，發(fā)酵溫度為29 31。。；
iii、碳源耗盡后，饑餓0. 5 lh，用甲醇誘導(dǎo)木聚糖酶表達，甲醇的濃度維持為0. 5%(v/v)，直至酶活出現(xiàn)下降時終止發(fā)酵；iv、收集培養(yǎng)物上清，分離純化，即得到木聚糖酶。包含SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的重組畢赤酵母菌，簡稱畢赤酵母PX-I，是何軍，“高效木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建及重組酶沒學(xué)性質(zhì)與功效研究”，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文中制備的畢赤酵母工程菌PX-I。其中，步驟i所述pH為5. 5，所述溫度為30°C。其中，步驟ii所述的接種量為2%，發(fā)酵pH為5. 5，發(fā)酵溫度為30°C。 其中，步驟ii所述的酵母發(fā)酵培養(yǎng)基每一升培養(yǎng)基包括如下成分磷酸鹽
6.5g 55g、鈣鹽0. 23 0. 93g、鉀鹽4. 55 18. 2g、鎂鹽3. 73 14. 9g、氫氧化鉀I. 03 I. 5g、生物素4. 73ml、PTMl微量元素溶液4. 37ml、甘油40ml。微量元素(PTMl) (g/L):五水硫酸銅6. 0，碘化鉀0. 18，一水硫酸錳3. 0，二水鑰酸鈉0. 2，硼酸0. 02，氯化鈷0. 5，氯化鋅20. 0，七水硫酸亞鐵65. 0，濃硫酸5. OmL0優(yōu)選地，所述磷酸鹽為磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀或者六偏磷酸鈉。優(yōu)選地，所述鈣鹽為硫酸鈣；所述鉀鹽為硫酸鉀；所述鎂鹽為七水硫酸鎂。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基每一升培養(yǎng)基包括如下成分磷酸二氫銨50g，磷酸二氫鉀5g，二水硫酸鈣0. 93g，硫酸鉀18. 2g，七水硫酸鎂14. 9g，氫氧化鉀I. 5g，甘油40mL，生物素
4.73mL，PTMl微量元素溶液4. 37mL。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基每一升培養(yǎng)基包括如下成分六偏磷酸鈉6. 5g，二水硫酸鈣
0.23g，硫酸鉀4. 55g，七水硫酸鎂3. 73g，氫氧化鉀I. 03g,甘油40mL,生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，每一升培養(yǎng)基包括如下成分磷酸鹽
6.5g 55g、鈣鹽0. 23 0. 93g、鉀鹽4. 55 18. 2g、鎂鹽3. 73 14. 9g、氫氧化鉀I. 03 I. 5g、生物素4. 73ml、PTMl微量元素溶液4. 37ml、甘油40ml。其中，所述磷酸鹽為磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀或者六偏磷酸鈉。其中，所述鈣鹽為硫酸鈣；所述鉀鹽為硫酸鉀；所述鎂鹽為七水硫酸鎂。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基每一升培養(yǎng)基包括如下成分磷酸二氫銨50g，磷酸二氫鉀5g，二水硫酸鈣0. 93g，硫酸鉀18. 2g，七水硫酸鎂14. 9g，氫氧化鉀I. 5g，甘油40mL，生物素
4.73mL，PTMl微量元素溶液4. 37mL。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基每一升培養(yǎng)基包括如下成分六偏磷酸鈉6. 5g，二水硫酸鈣
0.23g，硫酸鉀4. 55g，七水硫酸鎂3. 73g，氫氧化鉀I. 03g,甘油40mL,生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。每一升培養(yǎng)基包括如下成分六偏磷酸鈉6. 5g，二水硫酸鈣0. 23g，硫酸鉀4. 55g，七水硫酸鎂3. 73g，氫氧化鉀I. 03g,甘油40mL，生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。本發(fā)明提供的發(fā)酵方法可以顯著提高畢赤酵母工程菌PX-I的產(chǎn)酶水平，克服現(xiàn)有產(chǎn)酶量低的缺點，提供的兩種甘油發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵水平和產(chǎn)酶水平相當(dāng)，甘油低濃度鹽培養(yǎng)基含鹽量低，生產(chǎn)成本低，可實現(xiàn)木聚糖酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，市場應(yīng)用前景良好。


圖I畢赤酵母PX-I的生長曲線圖2菌體濕重曲線圖3不同培養(yǎng)基的產(chǎn)酶曲線圖4不同pH對畢赤酵母木聚糖酶活力的影響圖5不同反應(yīng)溫度對畢赤酵母木聚糖酶活力的影響圖6畢赤酵母木聚糖酶在不同pH下保溫時的失活速率圖7pH對畢赤酵母木聚糖酶穩(wěn)定性的影響圖8畢赤酵母木聚糖酶在不同溫度時的失活速率圖9溫度對畢赤酵母木聚糖酶穩(wěn)定性的影響
具體實施例方式以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實施例I本發(fā)明木聚糖酶的制備I材料與方法I. I 材料I. I. I 菌種含里氏木霉(Trichoderma reesei) Rut C-30 木聚糖酶基因(Xyn II)的畢赤酵母(Pichia Pastoris) PX-1，其為包含SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的重組畢赤酵母菌，按照何軍，“高效木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建及重組酶沒學(xué)性質(zhì)與功效研究”，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)中公開的方法制備。I. I. 2 培養(yǎng)基酵母培養(yǎng)基YPD (質(zhì)量分?jǐn)?shù))1%酵母浸出物，2%大豆蛋白胨，2%葡萄糖；甘油基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(GLY-BSM) (1L):磷酸二氫銨50g，磷酸二氫鉀5g，二水硫酸鈣
0.93g，硫酸鉀18. 2g，七水硫酸鎂14. 9g，氫氧化鉀I. 5g，甘油40mL，生物素4. 73mL，微量元素溶液(PTMl) 4. 37mL,消泡劑lmL。葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(GLU-BSM) (1L):以40g葡萄糖代替40mL甘油；甘油低濃度鹽培養(yǎng)基(GLY-LS-BSM) (1L):六偏磷酸鈉((NaPO3) 6 6. 5g，二水硫酸鈣0. 23g，硫酸鉀4. 55g，七水硫酸鎂3. 73g，氫氧化鉀I. 03g,甘油40mL,生物素4. 73mL,微量元素溶液(PTMl) 4. 37mL,消泡劑lmL。其中，微量元素(PTMl) (g/L):五水硫酸銅6. 0，碘化鉀0. 18，一水硫酸錳3. 0，二水鑰酸鈉0. 2，硼酸0. 02,氯化鈷0. 5，氯化鋅20. 0,七水硫酸亞鐵65. 0，濃硫酸5. OmL。試劑均為國產(chǎn)生化試劑純或分析純。I. 2 方法I. 2. I培養(yǎng)方法(I)首先用75%的乙醇將菌種保存管外壁消毒，取保藏的畢赤酵母(PichiaPastoris)PX-l劃線轉(zhuǎn)接到活化斜面(YPD)，30°C恒溫靜置培養(yǎng)2d，使菌種復(fù)壯。接I環(huán) 生長良好的活化斜面種子至裝有50mL種子培養(yǎng)基(YPD)的500mL搖瓶中，置于200r/min恒溫?fù)u瓶柜，30°C振蕩培養(yǎng)24h,8層紗布封口，作為發(fā)酵用的一級種子；
(2)取一級種子IOmL接種于裝有300mLYro培養(yǎng)基的IOOOmL搖瓶中，30°C，200r/min振蕩培養(yǎng)16h，8層紗布封口，作為發(fā)酵用的二級種子。
(3)取得到的二級種子，以2%的接種量分別接種到上述三種培養(yǎng)基中，在30°C和300r/min的條件下振蕩培養(yǎng)。發(fā)酵全程用氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，使之維持在5. 5。(4)待碳源耗盡后，饑餓0.5 Ih開始誘導(dǎo)，甲醇的濃度維持為0.5% (v/v)0甲醇采用流加的方式后，每12h取樣檢測一次酶活，直至酶活出現(xiàn)下降時終止發(fā)酵(5)收集發(fā)酵液上清，用常規(guī)分離純化方法純化，即得到木聚糖酶。I. 2. 2酶活定義在37°C，pH為5. 50的條件下，每分鐘從濃度為5mg/mL的木聚糖溶液中降解釋放I u mo I還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U。I. 2. 3酶液和固體酶的制備酶液的制備畢赤酵母液體培養(yǎng)發(fā)酵液，經(jīng)4000r/min離心15min的上清液,并作
適當(dāng)稀釋。固體酶的制備據(jù)最優(yōu)發(fā)酵條件培養(yǎng)菌種，所得液體酶以玉米芯粉和玉米淀粉混合物按照I :6的比例吸附，噴霧干燥后測得所得固體酶產(chǎn)品的水分含量為4. 68%，以固體酶進行酶學(xué)性質(zhì)的分析。I. 2. 4考察指標(biāo)1.2. 4. I酵母細胞密度分析將菌懸液作適當(dāng)稀釋，以去離子水為對照，使用紫外/可見分光光度計于波長600nm下測定吸收值(0D_)，OD6tltl=OD讀數(shù)X稀釋倍數(shù)，以O(shè)D值作為生物量繪制生長曲線。殘留的樣液4000r/min離心分離lOmin，上清液_40°C下保存，以備酶活測定。I. 2. 4. 2菌體濕重的測定每隔4h，取IOmL發(fā)酵液，4000r/min離心lOmin，倒掉上清液，稱重后減去離心管重即為濕菌體濃度(g/L)。I. 2. 4. 3木聚糖酶活力的測定按照GB/T 23874-2009 標(biāo)準(zhǔn)檢測。I. 2. 4. 4酶學(xué)性質(zhì)的分析酶的活力受測定環(huán)境的影響，相同的酶在不同的催化條件下表現(xiàn)出不同的催化能力，因此酶學(xué)性質(zhì)的酶活以相對酶活力來表示相對酶活=特定條件下的酶活/最適條件下的酶活X 100%I. 2. 5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析用Excel軟件統(tǒng)計和計算,并作圖。2結(jié)果與分析2. I不同培養(yǎng)基對重組畢赤酵母生長曲線及生物量的影響以2%的接種量接種到30L發(fā)酵罐，每隔4h進行0D_和菌體濕重的檢測，所得結(jié)果見圖r2和表廣2。表I菌種PX-I的生長曲線(OD600)
權(quán)利要求
1. 一種制備木聚糖酶的方法，其特征在于它包括如下步驟 1.取包含SEQID NO. I所示核苷酸序列的重組畢赤酵母菌，接種到Y(jié)H)種子培養(yǎng)基上，pH為5. 4^5. 6，溫度為2擴31°C下培養(yǎng)，制備得到種子液； ii、取步驟i制備的種子液，以廣3%的接種量接種到酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵pH為5. 4 5. 6，發(fā)酵溫度為29 31。。； iii、碳源耗盡后，饑餓0.5 lh，用甲醇誘導(dǎo)木聚糖酶表達，甲醇的濃度維持為0. 5% (v/V)，直至酶活出現(xiàn)下降時終止發(fā)酵； iv、收集培養(yǎng)物上清，分離純化，即得到木聚糖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟i所述pH為5.5，所述溫度為30°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟ii所述的接種量為2%，發(fā)酵pH為5.5，發(fā)酵溫度為30°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟ii所述的酵母發(fā)酵培養(yǎng)基每一升培養(yǎng)基包括如下成分磷酸鹽6. 5g 55g、鈣鹽0. 23 0. 93g、鉀鹽4. 55 18. 2g、鎂鹽3.73 14. 9g、氫氧化鉀I. 03 I. 5g、生物素4. 73ml、PTMl微量元素溶液4. 37ml、甘油40ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述磷酸鹽為磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀或者六偏磷酸鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述鈣鹽為硫酸鈣；所述鉀鹽為硫酸鉀；所述鎂鹽為七水硫酸鎂。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于每一升培養(yǎng)基包括如下成分磷酸二氫銨50g,磷酸二氫鉀5g，二水硫酸鈣0. 93g，硫酸鉀18. 2g，七水硫酸鎂14. 9g，氫氧化鉀I. 5g，甘油40mL，生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于每一升培養(yǎng)基包括如下成分六偏磷酸鈉6.5g，二水硫酸鈣0. 23g，硫酸鉀4. 55g，七水硫酸鎂3. 73g，氫氧化鉀I. 03g,甘油40mL，生物素4. 73mL，PTMl微量元素溶液4. 37mL。
9.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于每一升培養(yǎng)基包括如下成分磷酸鹽6. 5g飛5g、鈣鹽0. 23 0. 93g、鉀鹽 4. 55 18. 2g、鎂鹽 3. 73 14. 9g、氫氧化鉀 I. 03 I. 5g、生物素 4. 73ml,PTMl微量元素溶液4. 37ml、甘油40ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基,其特征在于每一升培養(yǎng)基包括如下成分六偏磷酸鈉6. 5g，二水硫酸鈣0. 23g，硫酸鉀4. 55g，七水硫酸鎂3. 73g，氫氧化鉀I. 03g,甘油40mL，生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了本發(fā)明提供了一種制備木聚糖酶的方法，它包括如下步驟ⅰ、取包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重組畢赤酵母菌，接種到Y(jié)PD種子培養(yǎng)基上，pH為5.4~5.6，溫度為29~31℃下培養(yǎng)，制備得到種子液；ⅱ、取步驟ⅰ制備的種子液，以1~3％的接種量接種到畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵pH為5.4~5.6，發(fā)酵溫度為29~31℃；ⅲ、碳源耗盡后，饑餓0.5~1h，用甲醇誘導(dǎo)木聚糖酶表達，甲醇的濃度維持為0.5%(v/v)，直至酶活出現(xiàn)下降時終止發(fā)酵；ⅳ、收集培養(yǎng)物上清，分離純化，即得到木聚糖酶。本發(fā)明制備木聚糖酶的方法簡便，產(chǎn)酶量高，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，具有工業(yè)應(yīng)用價值。
文檔編號C12N9/42GK102643790SQ20121014027
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者何軍, 余冰, 吳德, 鄭萍, 陳代文 申請人:何軍