專利名稱：一種柚苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵培養(yǎng)基，具體地說涉及一種用于柚苷酶工業(yè)發(fā)酵的培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
柚苷酶(Naringinase)是一種以水解柚皮苷(化學(xué)名為4，5，7_三羥黃烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷)至柚皮素為活性特征的糖苷酶，它具有α-L-鼠李糖苷酶(E. C. 3. 2. L 40)和β-D-葡萄糖苷酶(E.C.3.2·1. 21)兩種酶的活性。人們對柚苷酶的液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)進行了較長期的研究。2011年，Puri等利用xylosus MAK2菌株發(fā)酵橘皮產(chǎn)柚苷酶,研究表明添加橘皮可明顯提高酶的產(chǎn)量，產(chǎn)酶可達(dá)8. 9 IU/mL。同年,Mutuswamy等以米糠、麥麩、甘鹿洛、橘皮等為固態(tài)原料發(fā)酵柚苷酶，對比發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物柚皮苷O. 1%時，利用米糠固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶最大可達(dá)58.1 U/gds ;橘皮略次之為54. 76 U/gds。2012年，Ni等從腐爛的柚子中篩選得到柚苷酶高產(chǎn)菌株黑曲霉DB056，以20 g/L的柚皮苷為唯一碳源，在200 L罐上進行柚苷酶發(fā)酵，柚苷酶活力達(dá)2. 5 U/mL。但目前柚苷酶發(fā)酵存在培養(yǎng)基成本高、酶發(fā)酵活力低等不足，其工業(yè)酶制劑的價格十分昂貴，如日本田邊制藥生產(chǎn)的柚苷酶制劑(酶活力為150U/g)，其售價高達(dá)2600元/kg，限制了柚苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，開發(fā)新的柚苷酶發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)、降低其生產(chǎn)成本具有重要意義。發(fā)酵工藝和發(fā)酵原料是影響酶發(fā)酵產(chǎn)量和發(fā)酵成本的重要因素。微生物發(fā)酵酶主要有兩種方式固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。在液態(tài)發(fā)酵過程中微生物容易形成菌絲球和菌膜，限制了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及酶的分泌，酶產(chǎn)量低、發(fā)酵效率低。相比而言，固態(tài)發(fā)酵周期短、工藝簡單、不易形成菌絲球、酶產(chǎn)量高，是工業(yè)酶制劑常用的生產(chǎn)方式。相關(guān)研究表明，液態(tài)發(fā)酵柚苷酶的產(chǎn)量普遍比固態(tài)發(fā)酵低。此外，在液態(tài)發(fā)酵柚苷酶時常用柚皮苷和橙皮苷為原料，成本高；而在柚苷酶固態(tài)發(fā) 酵過程中，常用橙、葡萄柚(西柚)和橘子的加工副產(chǎn)物為原料，成本低。因此，固態(tài)發(fā)酵是生產(chǎn)柚苷酶的理想方法。相關(guān)研究表明，柚苷酶是誘導(dǎo)酶，其合成需要柚皮苷、橙皮苷等誘導(dǎo)物的存在。根據(jù)酶的誘導(dǎo)和合成相關(guān)理論，誘導(dǎo)酶的合成常受到分解代謝阻遏效應(yīng)的調(diào)控。即當(dāng)培養(yǎng)基中存在多種營養(yǎng)物時，微生物對營養(yǎng)物的利用具有先后順序，優(yōu)先利用營養(yǎng)物(速效營養(yǎng)物)的分解產(chǎn)物對遲效營養(yǎng)物利用的相關(guān)酶具有抑制作用，最經(jīng)典的例子就是葡萄糖的存在會抑制乳糖分解酶的合成。在柚苷酶的發(fā)酵過程中，我們也發(fā)現(xiàn)了明顯的分解代謝阻遏現(xiàn)象，如本說明書表I中培養(yǎng)基7、8和9，當(dāng)培養(yǎng)基中含有葡萄糖、果糖和淀粉時，柚苷酶的合成量大幅度降低。因此，在尋找柚苷酶工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基原料時，還要考慮其含有的誘導(dǎo)物含量及是否產(chǎn)生分解代謝阻遏效應(yīng)等因素。柚苷酶固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基主要由碳源和氮源組成。目前，相關(guān)文獻(xiàn)報道的發(fā)酵柚苷酶的碳源主要有橘皮、橙皮、甘蔗渣等；而氮源主要是豆餅粉、麩皮、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等。目前報道的固態(tài)發(fā)酵柚苷酶的培養(yǎng)基原料具有以下幾方面不足(1)鮮食所剩下的橙皮、橘皮和葡萄柚(西柚)皮由于收集困難、來源不穩(wěn)定而不適用于工業(yè)發(fā)酵柚苷酶；(2)甘蔗渣和其他碳源由于缺乏誘導(dǎo)物而需要加入柚皮苷和橙皮苷等才能合成柚苷酶，成本高；(3)蛋白胨、酵母膏和牛肉膏等氮源由于價格昂貴，僅適用于實驗室研究，用于工業(yè)發(fā)酵會大幅增加成本；(4)豆餅粉、麩皮等由于含有大量的淀粉而容易產(chǎn)生分解代謝阻遏，柚苷酶的合成量受到限制，難以實現(xiàn)高產(chǎn)發(fā)酵。因此，目前報道的柚苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的原料由于來源不穩(wěn)定、價格高及存在分解代謝阻遏等原因而不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，尋找來源穩(wěn)定、加工低廉、產(chǎn)量高的發(fā)酵培養(yǎng)基是實現(xiàn)柚苷酶工業(yè)發(fā)酵的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種原材料來源穩(wěn)定、價格低廉、消除分解代謝阻遏的柚苷酶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，不僅提高柚苷酶的發(fā)酵產(chǎn)量，還降低其發(fā)酵培養(yǎng)基成本。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
一種柚苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基，以柚子加工的副產(chǎn)物柚皮為碳源、銨鹽或尿素為氮源配制培養(yǎng)基，其組分及重量份為柚皮粉100份，銨鹽或尿素4-20份，水100-300份。所述銨鹽為硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨、磷酸銨、磷酸氫銨和碳酸氫銨中的一種或幾種。制備本發(fā)明的柚苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的方法
(I)將柚皮曬干或烘干，粉碎，得到柚皮粉；
(2 )按所述重量份稱取柚皮粉、銨鹽或者尿素、水，并攪拌均勻。本發(fā)明用工業(yè)加工柚子的副產(chǎn)物柚皮為碳源進行發(fā)酵。具有以下幾個優(yōu)點(1)柚子是我國南方大宗的 亞熱帶水果，近年來，柚子果汁加工業(yè)快速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的加工副產(chǎn)物——果皮，柚皮具有穩(wěn)定的工業(yè)來源，相比鮮食所剩的橘皮、橙皮和葡萄柚(西柚)皮，柚皮容易收集、來源穩(wěn)定、成本低；(2)由于柚子果實大、果皮厚而硬，在工業(yè)生產(chǎn)柚子果汁的過程中，采用了先剝皮后榨汁的工藝，不僅有效防止了果皮中的柚皮苷、橙皮苷等流失到果汁中，同時也防止了果肉和果肉渣中的葡萄糖和果糖等滲透到果皮中。而橘汁、橙汁和葡萄柚果汁加工由于采用整果榨汁的工藝，其副產(chǎn)物(果皮和果肉渣混合物)中柚皮苷和橙皮苷含量少(流失到果汁中，導(dǎo)致柚苷酶誘導(dǎo)作用弱)，且含有一定量的葡萄糖和果糖(果肉渣帶入，容易產(chǎn)生分解代謝阻遏)。因此，柚皮與橘、橙、葡萄柚(西柚)鮮食和加工所產(chǎn)生的副產(chǎn)物明顯不同，不僅來源穩(wěn)定、成本低，而且其中柚皮苷和橙皮苷的含量高、葡萄糖和果糖含量低，對柚苷酶的誘導(dǎo)作用強并消除了分解代謝阻遏作用，從而可大幅度提高柚苷酶的產(chǎn)量。銨鹽是常用的工業(yè)發(fā)酵氮源，但目前的相關(guān)研究報道銨鹽對柚苷酶的合成具有抑制作用，不能作為柚苷酶高產(chǎn)發(fā)酵的氮源，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)銨鹽只在液態(tài)發(fā)酵過程中對柚苷酶的合成具有抑制作用，而在固態(tài)發(fā)酵過程中用銨鹽為氮源卻消除了以豆餅粉為氮源時產(chǎn)生的葡萄糖分解代謝阻遏(表I培養(yǎng)基5)效應(yīng),有利于提高柚苷酶的發(fā)酵產(chǎn)量(表I培養(yǎng)基6)。另外，在研究過程中我們發(fā)現(xiàn)尿素可水解生產(chǎn)銨根離子，從而實現(xiàn)和銨鹽基本同等的作用和效果。本發(fā)明用銨鹽或尿素為氮源，具有以下優(yōu)點(1)相比蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等價格昂貴，銨鹽和尿素價格便宜，來源穩(wěn)定，更適于工業(yè)化中應(yīng)用；(2)相比豆餅粉和麩皮等氮源中含有大量的淀粉，其容易被微生物分泌的淀粉酶分解成葡萄糖而產(chǎn)生分解代謝阻遏效應(yīng)，銨鹽和尿素不產(chǎn)生分解代謝阻遏，可有效提高柚苷酶的產(chǎn)量。如我們研究時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)豆餅粉和柚皮的重量份數(shù)比例大于35:100時(表I培養(yǎng)基5)，柚苷酶的合成量就顯著下降。而用銨鹽或尿素代替豆餅粉時，柚苷酶的產(chǎn)量就大幅度提高(見實施例6)。因此，本發(fā)明提供的以加工所產(chǎn)生的副產(chǎn)物柚皮為碳源和以銨鹽或尿素為氮源進行柚苷酶固態(tài)發(fā)酵具有原料來源穩(wěn)定、成本低、柚苷酶產(chǎn)量高的特點，是適合工業(yè)化生產(chǎn)柚苷酶的培養(yǎng)基。且該培養(yǎng)基無論是用生料發(fā)酵還是用熟料發(fā)酵，都可以高產(chǎn)柚苷酶。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下述實施例中的培養(yǎng)基通過以下方法制備
(1)將柚皮曬干或烘干，粉碎，得到柚皮粉；
(2)實施例1-11按照重量比例稱取柚皮粉、銨鹽或尿素、水?dāng)嚢杈鶆?，進行生料發(fā)酵(培養(yǎng)基不滅菌而直接接種后進行發(fā)酵)或熟料發(fā)酵(培養(yǎng)基在121° C條件下滅菌20-60分鐘后接種發(fā)酵)。(3)采用Davis法測定酶活性，柚苷酶的活力定義為目前該領(lǐng)域中的通用定義，即I個柚苷酶活力單位為在pH 4. O和40° C條件下水解Mg柚皮苷所需要的酶量，酶反應(yīng)時間為 60 min0下述實施例中采用的發(fā) 酵菌株為棘孢曲霉，可利用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行柚苷酶發(fā)酵的微生物不限于棘孢曲霉，其他的如黑曲霉、土曲霉、青霉等微生物也可利用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行柚苷酶發(fā)酵。采用不同的微生物利用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行柚苷酶發(fā)酵并不影響本發(fā)明的專利保護范圍。實施例1
柚皮粉100份，硫酸銨4份，水100份，生料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到41767. 38 U/gds ；
本實施例中的生料發(fā)酵方法為培養(yǎng)基不滅菌而直接接種后進行發(fā)酵，實施例
2-6、實施例10、實施例11的生料發(fā)酵方法可參考本實施例的生料發(fā)酵方法進行。實施例2
柚皮粉100份，硫酸銨12份，水100份，生料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到67022. 68 U/ gds ； 實施例3
柚皮粉100份，硫酸銨8份，水100份，生料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到61525. 67 U/gds ； 實施例4
柚皮粉100份，硫酸銨10份，水100份，生料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到70687. 27 U/gds ； 實施例5
柚皮粉100份，硝酸銨13份，水100份，生料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到70452. 16 U/gds ； 實施例6
柚皮粉100份，磷酸氫二銨10份，水100份，生料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到86326. 91 U/
gds ；實施例7
柚皮粉100份，磷酸氫二銨10份，水150份，熟料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到60620. 91 U/
gds ；
本實施例中的熟料發(fā)酵方法為培養(yǎng)基在121° C條件下滅菌20-60分鐘后接種發(fā)酵，實施例8、實施例9和實施例12的熟料發(fā)酵方法可參考本實施例的熟料發(fā)酵方法進行。實施例8
柚皮粉100份，磷酸氫二銨10份，水200份，熟料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到60530. 28 U/
gds ；
實施例9
柚皮粉100份，磷酸氫二銨10份，水300份，熟料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到42651. 50 U/
gds ；
實施例10
柚皮粉100份，尿素5份，水100份，生料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到55486. 89 U/gds。實施例11柚皮粉100份，硫酸銨4份，水100份，生料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到39358. 86 U/gds ； 實施例12
柚皮粉100份，硫酸銨8份，磷酸氫二銨12份，水150份，熟料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到66027. 95 U/gdsο實施例13
柚皮粉100份，磷酸氫二銨14份，水100份，生料發(fā)酵柚苷酶活力達(dá)到113476. 03 U/
gds ο本發(fā)明人還進行相關(guān)對比實驗，以測驗本發(fā)明的培養(yǎng)基進行柚苷酶發(fā)酵的效果，如下面的表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種柚苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于其組分及重量份為柚皮粉100份，銨鹽或尿素 4-20 份，水 100-300 份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述銨鹽為硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨、磷酸銨、磷酸氫銨和碳酸氫銨中的一種或幾種。
3.制備權(quán)利要求1或2所述的柚苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，其特征在于 (I)將柚皮曬干或烘干，粉碎，得到柚皮粉； (2 )按所述重量份稱取柚皮粉、銨鹽或尿素、水，并攪拌均勻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種柚苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分及重量份為柚皮粉100份，銨鹽(或尿素)4-20份，水100-300份。本發(fā)明用柚皮作為柚苷酶發(fā)酵的主要原料，以銨鹽或尿素為氮源，從而消除了葡萄糖、果糖和淀粉等對柚苷酶發(fā)酵的分解代謝阻遏作用。由于柚子已經(jīng)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化加工，作為副產(chǎn)物的柚皮具有穩(wěn)定的來源；此外，柚子加工采用先剝皮后榨汁的工藝，所剩余的果皮與橙、橘和葡萄柚(西柚)的加工副產(chǎn)物相比具有柚皮苷和橙皮苷含量高、葡萄糖和果糖含量低等優(yōu)點。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)基具有來源穩(wěn)定、價格低廉、柚苷酶發(fā)酵產(chǎn)量高等特點，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。該培養(yǎng)基無論是用生料發(fā)酵還是用熟料發(fā)酵，都可高產(chǎn)柚苷酶。
文檔編號C12N9/24GK103060287SQ20131000888
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者倪輝, 肖安風(fēng), 李利君, 陳紅, 杜希萍, 陳 峰, 楊遠(yuǎn)帆, 黃高凌, 蔡慧農(nóng), 蘇文金 申請人:集美大學(xué)