專利名稱：用于發(fā)酵產冠菌素的紅糖培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種發(fā)酵產冠菌素的紅糖培養(yǎng)基。
背景技術：
冠菌素(coronatine，COR, C18H25NO4, 319)，是由植物病菌分泌于細胞外的植物生長物質，結構及活性與茉莉酸(Jasmonic acid，JA，C12H18O3)和脫落酸(Abscisic acid, ABA, C15H20O4)相近，包括一個含氨基酸的冠烷酸(coronamic acid)和一個聚酮結構的冠菌酸 (coronafacic acid)，以酞胺鍵連結。作為細菌(如丁香假單胞菌)的次級代謝產物，合成與菌體生長直接相關，傳統(tǒng)菌株產冠菌素活性一直存在低溫(最適溫度為18°C)限制，因此，產冠菌素的發(fā)酵條件需要在菌體生長與冠菌素積累兩方面平衡，
經典的冠菌素發(fā)酵培養(yǎng)基為 Hoitink-Sinden minimal medium optimized for coronatine medium(HSC medium)磷酸氫二鉀 4. lg、磷酸二氫鉀 3. 6g、氯化銨 lg、七水合硫酸鎂0. 2g、氯化高鐵2 μ Μ、葡萄糖20g。在此基礎上,碳源主要為葡萄糖(個別使用萘碳源進行菌種篩選)，依據菌種等因素差異，葡萄糖含量為10 20g/L ；常用的氮源為氯化銨、蛋白胨、黃豆餅粉、牛肉膏和玉米漿等，氯化銨的培養(yǎng)基濃度均為lg/L，其他有機氮源的使用并沒有顯示出一定的規(guī)律性；另外由于冠菌素在不同PH下顯示不同的溶解性，在酸性條件下，不溶于水，而易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中，堿性條件下形成鈉鹽和鉀鹽易溶于水，因此發(fā)酵液的PH極大的影響冠菌素的積累，并且對菌體的生長也作用明顯。但傳統(tǒng)培養(yǎng)基主要存在三大缺陷(1)冠菌素發(fā)酵菌株基本為丁香假單胞菌屬的致病變種，而培養(yǎng)基沒有考慮菌株的植物源性；(2)標準HSC培養(yǎng)基菌體生長速度緩慢(3) 傳統(tǒng)培養(yǎng)基的成分過于單一，利于研究成分影響，但是不利于冠菌素的有效積累。

發(fā)明內容
解決的技術問題
針對以上問題，本發(fā)明的目的在于提供一種冠菌素發(fā)酵的新型培養(yǎng)基，通過分析菌株的植物源性，兼顧發(fā)酵前期菌體生長和發(fā)酵后期冠菌素積累，提高冠菌素的積累效率。技術方案
用于發(fā)酵產冠菌素的紅糖培養(yǎng)基(Brown sugar medium optimized for coronatine medium, BSC medium)，由下述物質組成l%wt 4%wt紅糖、1 15 μ M氯化高鐵、 0. 2%wt 0. 6%wt 磷酸氫二鉀、0. 05%wt 0. 6%wt 磷酸二氫鉀、0. 01%wt 0. 5%wt 氯化銨、 0. 001%wt^0. l%wt七水合硫酸鎂，余量為水。發(fā)酵菌株為桑丁香假單胞菌(Aeyi/offloaas syringae pv. ori)M4_13菌株，保藏日期為2010年2月1日，保藏登記號為CGMCC No. 3621。種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基胰化蛋白胨1. 0%，酵母粉0. 5%，氯化鈉1. 0%，pH7. 2。有益效果
本發(fā)明提供的新型冠菌素發(fā)酵培養(yǎng)基以紅糖作為培養(yǎng)基碳源，在低溫(10°c -20°c)區(qū)域，提高了桑丁香假單胞菌(/^ewi/offloaas syringae pv.M4_l3的生長速度。紅糖作為一種植物源(甘蔗)產物，不僅提供了菌體生長的碳源，而且紅糖中含有大量維他命和電解質成分，可提供菌體生長的微量元素，結果顯示可以有效促進冠菌素的積累。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1
本實施例說明桑丁香假單胞菌O^ewi/offloaas syringae pv. ) M4-13菌株以HSC 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其生長速度與溫度的相關性。HSC培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基組成磷酸氫二鉀4. lg、磷酸二氫鉀3. 6g、氯化銨lg、七水合硫酸鎂0. 2g、氯化高鐵2 μ M、葡萄糖20g，將桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv. mori)M4-13以1%的接種量接種于培養(yǎng)基中，分別于10°C、20°C、30°C、32°C、37°C和40°C下培養(yǎng)，轉速200rpm，定時取樣，于0D550nm測定發(fā)酵液濃度，取其生長對數(shù)期斜率m，得生長速率
log 2
其中 k1(l=0. 0316，Ii2tl=O. 2098,k30=0. 7141，k32=0. 7063，k37=0. 6220 和 k4(l=0. 0316，下標表示該溫度下的K值。實施例2
本實施例說明桑丁香假單胞菌O^ewi/offloaas syringae pv. ) M4-13菌株以BSC 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其生長速度與溫度的相關性。BSC培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基組成磷酸氫二鉀3. 6g、磷酸二氫鉀lg、氯化銨lg、七水合硫酸鎂0. 2g、氯化高鐵4μ M、紅糖20g，將桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv. mori)M4-13以1%的接種量接種于培養(yǎng)基中，分別于10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、32°C、 37°C和40°C下培養(yǎng)，轉速200rpm，定時取樣，于0D550nm測定發(fā)酵液濃度，取其生長對數(shù)期斜率m，得生長速率
其中 k10=0. 1304，k15=0. 1989，k20=0. 3604，k25=0 . 6 2 0 5，k30=0. 8243，k32=0. 9780， k37=0. 8260和k4Q=0. 2392，下標表示該溫度下的K值。實施例3
本實施例說明桑丁香假單胞菌O^ewi/offloaas syringae pv. ) M4-13菌株以HSC 培養(yǎng)基，發(fā)酵合成冠菌素。HSC培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基組成磷酸氫二鉀4. lg、磷酸二氫鉀3. 6g、氯化銨lg、七水合硫酸鎂0. 2g、氯化高鐵2μΜ、葡萄糖20g，將桑丁香假單胞菌syringae pv.mori)M4-13以1%的接種量接種于培養(yǎng)基中，于18°C下培養(yǎng)，轉速200rpm，定時取樣，取發(fā)酵液經HPLC檢測，濃度為32mg/L。實施例4
本實施例說明桑丁香假單胞菌O^ewi/offloaas syringae pv. ) M4-13菌株以BSC
培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵合成冠菌素。BSC培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基組成磷酸氫二鉀3. 6g、磷酸二氫鉀lg、氯化銨lg、七水合硫酸鎂0. 2g、氯化高鐵4μ M、紅糖20g，將桑丁香假單胞菌(I^seudomonas syringae pv. mori)M4-13以1%的接種量接種于培養(yǎng)基中，于18°C下培養(yǎng)，轉速200rpm，定時取樣，取發(fā)酵液經HPLC檢測，濃度為149mg/L。
權利要求
1.用于發(fā)酵產冠菌素的紅糖培養(yǎng)基，其特征在于由下述物質組成l%wt 4%wt紅糖、1 15 μ M氯化高鐵、0. 2%wt 0. 6%wt磷酸氫二鉀、0. 05%wt 0. 6%wt磷酸二氫鉀、 0. 01%wt"0. 5%wt氯化銨、0. 001%wt"0. l%wt七水合硫酸鎂，余量為水。
全文摘要
用于發(fā)酵產冠菌素的紅糖培養(yǎng)基，由下述物質組成1%wt～4%wt紅糖、1～15μM氯化高鐵、0.2%wt~0.6%wt磷酸氫二鉀、0.05%wt~0.6%wt磷酸二氫鉀、0.01%wt~0.5%wt氯化銨、0.001%wt~0.1%wt七水合硫酸鎂，余量為水。發(fā)酵菌株桑丁香假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.mori)M4-13菌株，兼顧發(fā)酵前期菌體生長和發(fā)酵后期冠菌素積累，提高了冠菌素的積累效率，生物合成冠菌素產量由原來的32mg/L提高到149mg/L。
文檔編號C12P13/02GK102250975SQ20111016776
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月21日 優(yōu)先權日2011年6月21日
發(fā)明者呂榮賓, 吳福安, 張生杰, 梁垚, 潘飛, 王俊 申請人:江蘇科技大學