一種用于提高恩拉霉素產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于提高恩拉霉素產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機碳源的含量為40-80g/L；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機氮源的含量為10-60g/L。本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法，將殺真菌素鏈霉菌的種子液接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)192-240小時后，從發(fā)酵液中提取恩拉霉素。本發(fā)明所述發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵方法大幅度提高了恩拉霉素的發(fā)酵單位，適用于恩拉霉素的規(guī)?；a(chǎn)。
【專利說明】一種用于提高恩拉霉素產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于提高恩拉霉素產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法。

【背景技術(shù)】
[0002]恩拉霉素(Enramycin)是由土壤中分離出來的放線菌Streptomycesfungicid1us N0.B5477發(fā)酵產(chǎn)生的一種由不飽和脂肪酸和十幾種氨基酸結(jié)合成的多肽類抗生素。該藥于1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會社研發(fā)，1974年在日本正式注冊，其后在許多國家被注冊和廣泛使用。1993年，我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)該藥在我國注冊。2005年，國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)與美國先靈德雅動物保健品有限公司(Schering Plough Animal Health Corp.)開始合作生產(chǎn)恩拉霉素預(yù)混劑。恩拉霉素是由包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的有機堿。其中氨基酸分子構(gòu)成環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，脂肪酸位于多肽結(jié)構(gòu)末端。據(jù)其末端脂肪酸種類不同，分為恩拉霉素A(Cltl7H138Cl2N26O31)和恩拉霉素B(Cltl8H14tlCl2N26O31)，恩拉霉素則是由這兩種成分組成的混合物。恩拉霉素的鹽酸鹽為白色結(jié)晶性粉末，分子量約為2500,融點為238~245°C,易溶于二甲亞砜,可溶于甲醇、含水乙醇,難溶于丙酮,不溶于苯、氯仿。它對革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用，長期使用后不易產(chǎn)生抗藥性。它能改變腸道內(nèi)的細菌群落分布，有利于飼料營養(yǎng)成份的消化吸收，促進動物增重和提高飼料利用率，因此被世界上許多國家推薦作為抗生素促生長劑。
[0003]目前，恩拉霉素生產(chǎn)成本較高，發(fā)酵結(jié)果不理想、易染菌。要使發(fā)酵水平有所提高必須改變培養(yǎng)基以及發(fā)酵方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于提高恩拉霉素產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法。
[0005]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種用于提高恩拉霉素產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機碳源的含量為40-80g/L ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機氮源的含量為10-60g/L。所述含量以發(fā)酵罐實際裝液量來計。
[0006]作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機碳源的含量為65g/L ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機氮源的含量為52g/L。
[0007]進一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.8-7.2，優(yōu)選為6.9-7.0。
[0008]其中，所述有機碳源為葡萄糖、玉米淀粉和麥芽糊精中的一種或多種；葡萄糖較優(yōu)的范圍35-45g/L，玉米淀粉10-25g/L，麥芽糊精較優(yōu)的范圍35_45g/L。
[0009]所述有機氮源為豆柏粉、棉籽餅粉、玉米漿水解液和酵母浸膏/粉中的一種或多種。
[0010]作為優(yōu)選，所述有機碳源為玉米淀粉和麥芽糊精兩者中的至少一種和葡萄糖，所述有機氮源為豆柏粉、棉籽餅粉、玉米漿水解液三者中的至少一種和酵母浸膏/粉。
[0011]作為優(yōu)選，所述酵母浸膏/粉的含量l-6g/L。
[0012]進一步地，所述豆柏粉和棉籽餅粉為過80目篩孔后的豆柏粉和棉籽餅粉。
[0013]進一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基中所使用無機氮源、無機鹽和消泡劑。所述無機氮源用量較佳范圍為5-10g/L，優(yōu)選為NH4Cl ;所述無機鹽用量較佳范圍為10-20g/L，優(yōu)選為NaCl ;蘇搜狐消泡劑為聚醚類消泡劑，用量為常規(guī)用量。
[0014]在本發(fā)明的一個較佳實施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含:葡萄糖40g/L、麥芽糊精15g/L、玉米淀粉15g/L、豆柏粉21g/L、棉籽餅粉10g/L、玉米漿水解液20g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉 6g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵 0.6g/L。
[0015]在本發(fā)明的另一較佳的實施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含:葡萄糖40g/L ;玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽餅粉10g/L、玉米漿水解液20g/L、酵母浸粉lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵 0.6g/L。
[0016]本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法，將殺真菌素鏈霉菌的種子液接種于前述發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)192-240小時后，從發(fā)酵液中提取恩拉霉素。從發(fā)酵液中提取恩拉霉素的方法是常規(guī)方法，一般是將停止發(fā)酵后的恩拉霉素發(fā)酵液添加預(yù)處理劑經(jīng)過熱處理，過濾，收集菌體，再將菌體與預(yù)混劑(稻糠或玉米芯粉、二氧化硅等)混勻，通過氣流干燥機烘干，得到含有8 %恩拉霉素的飼料預(yù)混劑。
[0017]其中，所述鏈霉菌為突變菌株FYFJ03，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.4113，保藏日期為2010年8月25日。
[0018]作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28_32°C，發(fā)酵培養(yǎng)過程中pH為6.8-7.0。
[0019]本發(fā)明的有益效果在于:
[0020]本發(fā)明解決了恩拉霉素生產(chǎn)成本較高，發(fā)酵水平不理想的不足，提供了一種有利于殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)高效發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素(enramycin)的發(fā)酵培養(yǎng)基以及相應(yīng)的發(fā)酵方法。通過優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮成分及配比，優(yōu)化培養(yǎng)溫度、PH等發(fā)酵參數(shù)，從而大幅度提高了恩拉霉素的發(fā)酵單位，適用于恩拉霉素的規(guī)?；a(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明對比例I中不同發(fā)酵溫度下恩拉霉素的效價。
[0022]圖2為本發(fā)明對比例2中不同發(fā)酵培養(yǎng)pH條件下恩拉霉素的效價。

【具體實施方式】
[0023]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0024]以下實施例中培養(yǎng)基配方中的各組分均為市售商品。
[0025]實驗菌種為殺真菌素鏈霉菌突變菌株FYFJ03，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101)，保藏日期為2010年8月25日，保藏編號為CGMCCN0.4113。
[0026]實施例1
[0027]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；將殺真菌素鏈霉菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)而得到種子液，種子液以8%-10% (v/v)接種量接種于裝液量為35L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵周期8天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價能達到9133μ g/mL。
[0028]其中，所述固體斜面培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10g/L，胰蛋白胨lg/L，瓊脂22g/L，酵母粉lg/L。
[0029]所述種子培養(yǎng)基的組成為:玉米粉40g/L、玉米漿28g/L、棉籽餅粉5g/L、玉米蛋白粉5g/L、硫酸銨3g/L、硫酸亞鐵0.36g/L、磷酸二氫鉀1.25g/L、碳酸鈣22g/L、泡敵0.6g/L，水余量，培養(yǎng)基PH7.0-7.5。
[0030]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽餅粉 10g/L、玉米漿水解液 20g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵
0.6g/L，用20%液堿調(diào)pH6.9，最后投入碳酸鈣。
[0031]實施例2
[0032]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；種子液以8%-10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵周期10天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價能達到8517μ g/mL。
[0033]所述固體斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1 ;
[0034]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:葡萄糖40g/L、玉米淀粉15g/L、豆柏粉21g/L、棉籽餅粉10g/L、玉米漿水解液 25g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵 0.6g/L，用20%液喊調(diào)ρΗ7.I，最后投入碳酸鈣。
[0035]實施例3
[0036]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；種子液以8% -10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵周期9天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價能達到9048μ g/mL。
[0037]所述固體斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1 ;
[0038]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽餅粉10g/L、玉米漿水解液 20g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵 0.6g/L，用20%液喊調(diào)ρΗ7.0，最后投入碳酸鈣。
[0039]實施例4
[0040]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；種子液以8% -10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵周期8天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價能達到9113μ g/mL。
[0041]所述固體斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1 ;
[0042]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:40g/L葡萄糖、15g/L麥芽糊精、15g/L玉米淀粉、20g/L豆柏粉、10g/L棉籽餅粉、20g/L玉米漿水解液、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉5g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、20g/L CaCO3、泡敵0.6g/L，用20%液堿調(diào)pH6.85，最后投入碳酸鈣。
[0043]實施例5
[0044]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；種子液以8% -10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵周期9天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價能達到8500μ g/mL。
[0045]所述固體斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1 ;
[0046]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:葡萄糖30g/L、玉米淀粉10g/L、豆柏粉21g/L、棉籽餅粉10g/L、玉米漿水解液 15g/L、酵母浸粉 5g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵 0.6g/L，用20%液喊調(diào)ρΗ7.0，最后投入碳酸鈣。
[0047]實施例6
[0048]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；種子液以8% -10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵周期9天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價能達到8753μ g/mL。
[0049]所述固體斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1 ;
[0050]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:葡萄糖40g/L、玉米淀粉20g/L、麥芽糊精20g/L，豆柏粉20g/L、棉籽餅粉10g/L、玉米漿水解液20g/L、胰蛋白胨3g/L，酵母浸粉2g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵0.6g/L，用20%液堿調(diào)ρΗ7.0，最后投入碳酸鈣。
[0051]實施例7
[0052]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；種子液以8% -10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵周期9天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價能達到8324μ g/mL。
[0053]所述固體斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1 ;
[0054]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉5g/L、棉籽餅粉2g/L、玉米漿水解液 2g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵 0.6g/L，用20%液喊調(diào)pH6.8,最后投入碳酸鈣。
[0055]實施例8
[0056]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；種子液以8% -10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵周期9天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價能達到9012μ g/mL。
[0057]所述固體斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1 ;
[0058]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:葡萄糖30g/L、玉米淀粉15g/L、麥芽糊精20g/L、豆柏粉25g/L、棉籽餅粉15g/L、玉米漿水解液15g/L、酵母浸粉5g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵0.6g/L，用20%液堿調(diào)pH7.0，最后投入碳酸鈣。
[0059]對比例I發(fā)酵溫度的優(yōu)化
[0060]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；將殺真菌素鏈霉菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)而得到種子液，種子液以8%-10% (v/v)接種量接種于裝液量為35L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度分別為26°C、28°C、30°C、32°C、34°C，發(fā)酵周期8天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價如圖1所示。由圖1可知，發(fā)酵溫度在28°C~32°C培養(yǎng)時，恩拉霉素效價較高，其最適溫度為28°C。
[0061]其中，所述固體斜面培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10g/L，胰蛋白胨lg/L，瓊脂22g/L，酵母粉lg/L。
[0062]所述種子培養(yǎng)基的組成為:玉米粉40g/L、玉米漿28g/L、棉籽餅粉5g/L、玉米蛋白粉5g/L、硫酸銨3g/L、硫酸亞鐵0.36g/L、磷酸二氫鉀1.25g/L、碳酸鈣22g/L、泡敵0.6g/L，水余量，培養(yǎng)基PH7.0-7.5。
[0063]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽餅粉 10g/L、玉米漿水解液 20g/L、酵母浸粉 lg/L、NaCl 15g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵
0.6g/L，用20%液堿調(diào)pH6.9，最后投入碳酸鈣。
[0064]對比例2pH的優(yōu)化
[0065]將實驗菌種在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7天；將殺真菌素鏈霉菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)而得到種子液，種子液以8%-10% (v/v)接種量接種于裝液量為35L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基pH分別為6.6、6.8、6.9、7.0、7.2。發(fā)酵培養(yǎng)溫度28°C，發(fā)酵周期8天。發(fā)酵結(jié)束后取樣(HPLC)測定，恩拉霉素效價如圖2所示。由圖2可知，在pH在6.8~7.2時，恩拉霉素效價較高，其最佳pH為6.9~7.0。
[0066]其中，所述固體斜面培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10g/L，胰蛋白胨lg/L，瓊脂22g/L，酵母粉lg/L。
[0067]所述種子培養(yǎng)基的組成為:玉米粉40g/L、玉米漿28g/L、棉籽餅粉5g/L、玉米蛋白粉5g/L、硫酸銨3g/L、硫酸亞鐵0.36g/L、磷酸二氫鉀1.25g/L、碳酸鈣22g/L、泡敵0.6g/L，水余量，培養(yǎng)基PH7.0-7.5。
[0068]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽餅粉 10g/L、玉米漿水解液 20g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敵
0.6g/L，用20%液堿調(diào)至所需的pH，最后投入碳酸鈣。
[0069] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于提高恩拉霉素產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機碳源的含量為40-80g/L ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機氮源的含量為10-60g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機碳源的含量為65g/L ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中有機氮源的含量為52g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.8-7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述有機碳源為葡萄糖、玉米淀粉和麥芽糊精中的一種或多種；所述有機氮源為豆柏粉、棉籽餅粉、玉米漿水解液和酵母浸膏/粉中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述有機碳源為玉米淀粉和麥芽糊精兩者中的至少一種和葡萄糖，所述有機氮源為豆柏粉、棉籽餅粉、玉米漿水解液三者中的至少一種和酵母浸膏/粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述豆柏粉和棉籽餅粉為過80目篩孔后的豆柏粉和棉籽餅粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述酵母浸膏/粉的含量l_6g/L。
8.一種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征在于，將殺真菌素鏈霉菌的種子液接種于權(quán)利要求1-7任一項所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)192-240小時后,從發(fā)酵液中提取恩拉霉素。
9.根據(jù)權(quán)利要求8 所述的方法，其特征在于，所述殺真菌素鏈霉菌為突變菌株FYFJ03，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.4113。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28-32°C，發(fā)酵培養(yǎng)過程中pH為6.8-7.0。
【文檔編號】C12P21/04GK104131054SQ201410269954
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】李榮杰, 張雪鋒, 尚海濤, 徐斌, 楊為華, 鄧遠德, 張印 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司