專利名稱：一種微生物飼料添加劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一種含有芽孢乳酸菌的飼料添加劑。
背景技術(shù)：
微生物飼料添加劑是指在飼料中添加一種或多種菌系的微生物制品。具有補(bǔ)充微量元素、調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體胃腸道菌群平衡，抑制病原微生物生長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫力的功效。隨著人們對(duì)動(dòng)物性食品安全的日益重視，飼料亦成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)，抗生素作為飼料添加劑的廣泛應(yīng)用，已經(jīng)造成了嚴(yán)重的安全隱患，如多重抗藥菌的產(chǎn)生、超級(jí)細(xì)菌的形成、動(dòng)物性食品藥物超標(biāo)并直接威脅人類健康，最終置人類于無(wú)藥可醫(yī)的尷尬、無(wú)奈境地。因此，研制綠色、新型、易推廣的微生物飼料添加劑，從調(diào)動(dòng)和增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體自身抵抗力，調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡，利用優(yōu)勢(shì)菌株的抗菌作用逐步取代抗生素已成為飼料工業(yè)面臨的重要課題和緊迫任務(wù)。近年來(lái)，從動(dòng)物胃腸道直接篩選抗逆性強(qiáng)、易生長(zhǎng)，益生作用強(qiáng)的乳酸菌作為飼料添加劑已成為人們研究的熱點(diǎn)。糞腸球菌、凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均是中國(guó)農(nóng)業(yè)部公告的飼料添加劑品種目錄中，屬于國(guó)家允許使用的微生物添加劑品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株幾腸球菌(Enterococcusfaecalis)E15-CUI。本發(fā)明提供的幾腸球菌(Enterococcus faecalis)E15_CUI,其保藏號(hào)為CGMCCNO. 6130。本發(fā)明還提供了一株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)BC-CUI。本發(fā)明提供的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)BC-CUI，其保藏號(hào)為 CGMCC NO. 6151。本發(fā)明的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)來(lái)源于CGMCC NO.1. 210。菌株糞腸球菌E15-⑶I于2012年5月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia :北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 6130，分類命名為糞腸球菌Enterococcusfaecalis。菌株凝結(jié)芽孢桿菌BC-⑶I于2012年5月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia :北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC NO. 6151。分類命名為凝結(jié)芽孢桿菌Bacilluscoagulans。本發(fā)明的微生物飼料添加劑其特征為由分離自動(dòng)物胃腸道的2株益生性乳酸菌幾腸球菌(Enterococcus faecalis)E15_CU1、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans),以及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)組成，各微生物的重量百分比為糞腸球菌30-35%，凝結(jié)芽孢桿菌30-35%和枯草芽孢桿菌25-30%。
上述飼料添加劑的制備方法，其特征工藝為:將糞腸球菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌分別活化，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，根據(jù)菌株的呼吸類型，糞腸球菌和凝結(jié)芽孢桿菌兼性厭氧發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)、枯草芽孢桿菌需氧發(fā)酵培養(yǎng)，制備發(fā)酵液，接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基固體發(fā)酵，加入吸水基質(zhì)，鼓風(fēng)干燥等一系列工藝制成微生態(tài)制劑。上述微生物飼料添加劑的制備方法，其特征在于處理工藝按照如下步驟進(jìn)行:①制備各菌株用培養(yǎng)基②各菌株搖床和發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng):分別把糞腸球菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌冰凍保存的種子菌活化，500ml三角瓶液體恒溫?fù)u床擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，按5-8% (v/w)的接種量，接種到發(fā)酵罐中，進(jìn)行種子液的發(fā)酵培養(yǎng)，③再以6-10% (v/w)的接種量接種到工業(yè)用發(fā)酵罐中，進(jìn)行生產(chǎn)用菌液的發(fā)酵，收獲細(xì)菌發(fā)酵液。④按8-10% (v/w)的接種量，加入固體發(fā)酵基質(zhì)中，在35-45°C發(fā)酵24-48h，收獲菌液。⑤加入食品級(jí)玉米粉配料，利用鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行干燥、粉碎、過(guò)篩，將三種菌按照一定比例混勻，風(fēng)干后，即得微生物飼料添加劑。上述培養(yǎng)方法，其特征在于各菌株種子液的培養(yǎng)條件分別為:糞腸球菌培養(yǎng)溫度35-37°C，120r/min低速攪拌，培養(yǎng)18_24h，培養(yǎng)基為胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，葡萄糖1%，蔗糖0.5%，醋酸鈉1.5%，枸櫞酸銨0.2%,KH2PO40.6%,MgSO4.7Η200.058 %，MnSO4.4Η200.025 %，F(xiàn)eSO4.7Η200.003 %，吐溫-800.1 %，ρΗ6.5-7.0,116°C、10鎊，高壓蒸汽滅菌20min。凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)溫度37-45°C，450r/min、培養(yǎng)，18-24h，培養(yǎng)基為大豆蛋白胨0.5%，酵母粉 0.5%, K2HPO40.1%, MgSO4.7Η200.02%, CaCO3I %，葡萄糖 1%, ρΗ6.0-6.5，116°C、10鎊，高壓蒸汽滅菌20min?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)溫度35-37°C，120r/min低速攪拌，培養(yǎng)18_24h，培養(yǎng)基為葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，pH7.0-7.4，121°C、15磅，高壓蒸汽滅菌15min。將上述細(xì)菌種子液按6-10% (v/w)的比例分別接種到裝有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的工業(yè)發(fā)酵罐中，進(jìn)行生產(chǎn)擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)。糞腸球菌培養(yǎng)溫度35-37°C，120r/min低速攪拌，培養(yǎng)18_24h，培養(yǎng)基為胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，葡萄糖1%，蔗糖0.5%，醋酸鈉1.5%，枸櫞酸銨0.2%，KH2PO40.6%MgSO4.7Η200.058 %，MnSO4.4Η200.025 %，F(xiàn)eSO4.7Η200.003 %，吐溫-800.1 %，ρΗ6.5-7.0,116°C、10鎊，高壓蒸汽滅菌20min。凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)溫度40-45 V，220r/min、培養(yǎng)24_48h，培養(yǎng)基為大豆蛋白胨0.5%,酵母粉 0.5%, K2HPO40.1 %，葡萄糖 0.1%, MgSO4.7Η200.02%，MnSO4.7Η200.002%，ρΗ6.0-6.5,116。。、10 鎊，高壓蒸汽滅菌 20min?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)溫度35-37°C，120r/min低速攪拌，培養(yǎng)24_48h，培養(yǎng)基為葡萄糖 0.2%，NaCl0.5 %，酵母粉 0.5%，蛋白胨 I %, K2HPO40.1 %, MgSO4.7Η200.05%,MnSO4.7Η200.01%, ρΗ7.0-7.4，116。。、10 磅，高壓蒸汽滅菌 20min。在培養(yǎng)生產(chǎn)用發(fā)酵菌液時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基分別為添加了促進(jìn)芽孢生成的MnSO4,并延長(zhǎng)了培養(yǎng)時(shí)間，經(jīng)檢測(cè)芽孢形成率達(dá)到90%以上，收獲菌液。上述培養(yǎng)方法，其特征在于將液體細(xì)菌發(fā)酵液(芽孢形成率90 %以上)，按8-10 %(v/w)的接種量，接種固體發(fā)酵基質(zhì)中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)檢測(cè)細(xì)菌數(shù)均達(dá)到1.3*109個(gè)/g以上。固體基質(zhì)組成以來(lái)源廣泛的麩皮為主，在培養(yǎng)基配方中適當(dāng)加入玉米粉，為了增加培養(yǎng)基的透氣性，適量加入稻殼；加入豆柏作為氮源，玉米粉為碳源，由于硫酸鎂、磷酸氫二鉀參與細(xì)菌細(xì)胞壁的組成，硫酸錳有促進(jìn)芽孢桿菌芽孢形成的作用，所以組方中加入硫酸鎂、磷酸氫二鉀和硫酸錳。各成分比例為麩皮20-45 %，稻殼5-10 %，玉米粉10-20 %，豆柏20-25%，酵母粉5-10%，硫酸鎂0.05%,磷酸氫二鉀0.05-1 %，硫酸錳0.01%,含水量60-65 %，發(fā)酵溫度 35-45 V，24_48h。上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)能夠提高芽孢的生產(chǎn)率，因此可以有效的抵抗干燥時(shí)的加熱溫度，提升產(chǎn)品的活菌水平。凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌在固體發(fā)酵過(guò)程中，檢測(cè)芽孢形成狀態(tài)，待芽孢生成率達(dá)到90%以上，即可進(jìn)行干燥工藝。產(chǎn)品干燥時(shí)固體含菌發(fā)酵基質(zhì)與載體玉米粉的適宜配比為1: 1，適宜干燥溫度在65°C以下。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、制備種子液培養(yǎng)基(I)糞腸球菌培養(yǎng)基胰蛋白胨I %，酵母浸粉0.5%，葡萄糖I %，蔗糖0.5%，醋酸鈉1.5%，枸櫞酸銨 0.2 %，KH2PO40.6 %，MgSO4.7Η200.058 %，MnSO4.4Η200.025 %，F(xiàn)eSO4.7Η200.003 %，吐溫-800.1 %，ρΗ6.5-7.0，116°C、10 磅，高壓蒸汽滅菌 20min。(2)凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)基大豆蛋白胨0.5%,酵母粉 0.5%, K2HPO40.1 %，MgSO4.7Η200.02 %，CaCO3I %，葡萄H I %, ρΗ6.0-6.5,116。。、10 鎊，高壓蒸汽滅菌 20min。(3)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基葡萄糖0.2%, NaCl0.5%，酵母粉 0.5%，蛋白胨 I %，ρΗ7.0-7.4，121 、15 磅，高壓蒸汽滅菌15min。實(shí)施例2、制備生產(chǎn)菌液用培養(yǎng)基(I)糞腸球菌培養(yǎng)基胰蛋白胨I %，酵母浸粉0.5%，葡萄糖I %，蔗糖0.5%，醋酸鈉1.5%，枸櫞酸銨 0.2 %，KH2PO40.6 %，MgSO4.7Η200.058 %，MnSO4.4Η200.025 %，F(xiàn)eSO4.7Η200.003 %，吐溫-800.1 %，ρΗ6.5-7.0，116°C、10 磅，高壓蒸汽滅菌 20min。(2)凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)基大豆蛋白胨 0.5 %，酵母粉 0.5%, K2HPO40.1 %，葡萄糖 0.1%, MgSO4.7Η200.02 %，MnSO4.7Η200.002%, ρΗ6.0-6.5，116。。、10 磅，高壓蒸汽滅菌 20min。(3)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基葡萄糖0.2 %, NaCl0.5 %,酵母粉 0.5%，蛋白胨 I %，K2HPO40.1 %,MgSO4.7Η200.05%, MnSO 4.7Η200.01%, ρΗ7.0-7.4，116。。、10 磅，高壓蒸汽滅菌 20min。實(shí)施例3、制備芽孢菌固體發(fā)酵用培養(yǎng)基麩皮20-45 %，稻殼5-10 %，玉米粉10-20 %，豆柏20-25 %，酵母粉5-10 %，硫酸鎂0.05%,磷酸氫二鉀 0.05-1%,硫酸錳 0.01%,含水量 60-65 %，pH 為 6.5。實(shí)施例4、細(xì)菌活菌數(shù)的測(cè)定采用平板傾注法計(jì)數(shù)(I)制備培養(yǎng)基，參照實(shí)施例1中3種菌的配方，添加1.2%瓊脂，高壓滅菌，冷卻到45-50°C、備用，(2)樣品稀釋，將發(fā)酵菌液或固體發(fā)酵物進(jìn)行一系列濃度的稀釋，取Iml加到滅菌的平皿，隨后倒入冷卻至45-50°C的培養(yǎng)基15-20ml，輕輕混勻，倒置恒溫箱中培養(yǎng)18_24h，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)施例5、芽孢生成率測(cè)定取發(fā)酵菌液或固體發(fā)酵物按一定比例稀釋，80°C水浴加熱lOmin，殺死細(xì)菌繁殖體，按實(shí)施例5的方法測(cè)定細(xì)菌活菌數(shù)即為芽孢數(shù)。芽孢生成率=芽孢數(shù)/細(xì)菌總數(shù)*100%實(shí)施例6、本發(fā)明飼料添加劑對(duì)仔豬生長(zhǎng)機(jī)能的影響試驗(yàn)地點(diǎn)分別選擇豬場(chǎng)(一)和豬場(chǎng)(二)進(jìn)行(I)試驗(yàn)分組分別選用豬場(chǎng)(一)和豬場(chǎng)(二)出生日齡相近的出生乳豬100頭(試驗(yàn)用生產(chǎn)母豬要求胎次相近、品種一致、體格健壯)，隨機(jī)分成兩組，分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組。(2)飼喂方法試驗(yàn)組乳豬出生即服試驗(yàn)料1.5g/頭；7日開始飼喂開口料，在開口料中按4%。添加試驗(yàn)料；21日斷奶后，在斷奶乳豬料中按2%。添加試驗(yàn)料D，飼喂20天。試驗(yàn)期間由專人負(fù)責(zé)，統(tǒng)一飼喂，自由采食，常規(guī)消毒免疫。分別于正式試驗(yàn)開始和結(jié)束清晨空腹稱重，并按組計(jì)算采食量，觀察記錄豬的發(fā)病數(shù)、腹瀉數(shù)和死亡數(shù)并進(jìn)行糞便采集、大腸桿菌分離鑒定。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，不添加試驗(yàn)料，結(jié)果見表1、表2。表1.豬場(chǎng)(一)試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種微生物飼料添加劑，其特征是該添加劑中包含分離自動(dòng)物腸道的糞腸球菌和凝結(jié)芽孢桿菌，以及益生性枯草芽孢桿菌。
2.權(quán)利要求1所述的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)E15-QJI,其保藏號(hào)為CGMCCN0.6130、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)BC_CUI，其保藏號(hào)為CGMCC N0.6151，或與來(lái)源于CGMCC N0.1.210的枯草芽孢桿菌發(fā)酵物在微生態(tài)制品中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，分離自動(dòng)物胃腸道的2株益生性乳酸菌:糞腸球菌(Enterococcus faecalis)E15-QJ1、革蘭氏陽(yáng)性，圓形或卵圓形,單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列，無(wú)莢膜、無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛的球菌；凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans),革蘭氏陽(yáng)性，棒狀桿菌呈柵欄狀排列，無(wú)莢膜、無(wú)鞭毛，形成芽孢、位于菌體一端。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述微生物飼料添加劑各菌株的重量百分比為糞腸球菌30-35%，凝結(jié)芽孢桿菌30-35%和枯草芽孢桿菌25-30%。
5.一種飼料添加劑的制備方法，其特征工藝步驟為:①將糞腸球菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌分別活化，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，②根據(jù)菌株的呼吸類型，糞腸球菌和凝結(jié)芽孢桿菌兼性厭氧發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)、枯草芽孢桿菌需氧發(fā)酵培養(yǎng)，制備發(fā)酵液，③接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基固體發(fā)酵，④加入吸水基質(zhì)，鼓風(fēng)干燥等一系列工藝制成微生態(tài)制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟①②所述培養(yǎng)基的成分以質(zhì)量百分比計(jì)，糞腸球菌培養(yǎng)基為:胰蛋白胨I %，酵母浸粉0.5%，葡萄糖I %，蔗糖0.5%，醋酸鈉1.5 %，枸櫞酸銨 0.2 %，KH2PO40.6 % MgSO4.7Η200.058 %，MnSO4.4Η200.025 %，F(xiàn)eSO4.7Η200.003 %，吐溫-800.1 %，ρΗ6.5-7.0 ;凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)基為:大豆蛋白胨0.5%,酵母粉 0.5%, K2HPO40.1 %，葡萄糖 0.1%, MgSO4.7Η200.02%，MnSO4.7Η200.002%，ρΗ6.0-6.5 ;枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基為:葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，K2HPO40.1 %，MgSO4.7Η200.05%, MnSO4.7Η200.01%, ρΗ7.0-7.4。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟③所述培養(yǎng)基的成分以質(zhì)量百分比計(jì)為:麩皮20-45%，稻殼5-10%，玉米粉10-20%，豆柏20-25 %，酵母粉5-10%，硫酸鎂0.05%，磷酸氫二鉀0.05-1%,硫酸錳0.01%，含水量60-65 %，pH為6.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，培養(yǎng)生產(chǎn)用發(fā)酵菌液時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基分別為添加了促進(jìn)芽孢生成的MnSO4，并延長(zhǎng)了培養(yǎng)時(shí)間，經(jīng)檢測(cè)芽孢形成率達(dá)到90%以上，收獲菌液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，固體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，檢測(cè)芽孢生成率達(dá)到90%以上，進(jìn)行干燥工藝。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，步驟④其特征在于，產(chǎn)品干燥時(shí)固體含菌發(fā)酵基質(zhì)與載體玉米粉的適宜配比為1: 1，適宜干燥溫度在65°c以下。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物飼料添加劑及其制備方法。本發(fā)明提供了一株糞腸球菌，其保藏號(hào)為CGMCC NO.6130和一株凝結(jié)芽孢桿菌，其保藏號(hào)為CGMCC NO.6151。本發(fā)明的復(fù)合微生物飼料添加劑組成包括糞腸球菌30-35％，凝結(jié)芽孢桿菌30-35％和枯草芽孢桿菌25-30％。本發(fā)明涉及所述的飼料添加劑的制備方法，包括菌種的分離鑒定；細(xì)菌的一代培養(yǎng)，發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，固體發(fā)酵風(fēng)干、粉碎，按一定比例混合配制成微生物成品；將微生物成品與配料混合，風(fēng)干后，即得到微生物飼料添加劑。本發(fā)明的復(fù)合微生物添加劑具有抑制腸道不良微生物增殖，增加和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，提高飼料報(bào)酬率的效力。
文檔編號(hào)C12R1/07GK103070285SQ20131000850
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者崔德鳳, 張永紅, 李煥榮, 阮文科 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院