專利名稱：基于果膠裂解酶Pcpel15基因開(kāi)發(fā)的檢測(cè)辣椒疫霉菌的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基于果膠裂解酶Pcpe 115基因開(kāi)發(fā)的檢測(cè)辣椒疫霉菌的引物及方法。
背景技術(shù)：
植物病原卵菌是ー類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導(dǎo)致多種植物毀滅性的病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici)、大豆疫霉(P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分別引起馬鈴薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹(shù)及柑橘重要疫病，嚴(yán)重年份乃至絕產(chǎn)。卵菌主要以菌絲體或卵孢子在病殘?bào)w或土壤中度過(guò)不良環(huán)境并作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或 卵孢子均可萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊-釋放游動(dòng)孢子，借助雨水或氣流傳播、侵染而引起植物病害。因此，對(duì)該類病菌引起的病害早期進(jìn)行適時(shí)檢控，利于控制病害的發(fā)生。傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調(diào)控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發(fā)乃至產(chǎn)生明顯危害時(shí)實(shí)施，忽視了對(duì)初侵染源或侵染寄主早期適時(shí)采取綜合防控和高效治理措施，近而事半功倍，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。近年來(lái)，PCR技術(shù)及其相關(guān)分子檢測(cè)技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的分子檢測(cè)與預(yù)警，其中利用核糖體rDNA/ITS序列設(shè)計(jì)特異引物，已針對(duì)性的開(kāi)展了大豆疫霉、致病疫霉、冬生疫霉、寄生疫霉、辣椒疫霉分子檢測(cè)技術(shù)研究，但這些技術(shù)性研發(fā)成果僅能對(duì)病菌活動(dòng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)與預(yù)警，但不能對(duì)病菌致病特性與發(fā)生趨勢(shì)進(jìn)行檢測(cè)與預(yù)警。研究表明疫霉菌-寄主互作過(guò)程中常分泌多種重要的細(xì)胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(Pg)、果膠甲基酯酶(Pme)、果膠裂解酶(Pel)，這些重要致病因子主要通過(guò)降解或軟化植物細(xì)胞壁的主要成分果膠、中膠層及果膠聚合體，而促使病菌的侵入與定植，對(duì)寄主產(chǎn)生寄生與致病性。該類致病酶均由多基因編碼，如目前已公開(kāi)的辣椒疫霉果膠裂解酶基因有 Pcpel 1-2 (GenBank 號(hào)分別為:FJ213434_5)、Pcpel4 (GenBank 號(hào)為FJ213437)、Pcpel9 (GenBank 號(hào)為FJ213442)、Pcpelll (GenBank 號(hào)為FJ213444)。其中少數(shù)關(guān)鍵基因是重要的致病靶基因，因此分離鑒定這些重要致病酶的靶標(biāo)基因，利用基因信息學(xué)設(shè)計(jì)并合成靶標(biāo)基因的特異引物，針對(duì)病菌不同時(shí)期致病特性進(jìn)行分子檢測(cè)與預(yù)警，以便在病菌初侵染期適時(shí)采取綜合防控措施，減少藥劑使用次數(shù)及使用量，阻斷病菌的擴(kuò)展與蔓延，控制病害的發(fā)生與蔓延。因此，開(kāi)展重要疫霉菌致病酶類靶標(biāo)基因克隆及其特異引物設(shè)計(jì)與合成，研制病菌分子檢測(cè)、預(yù)警技術(shù)及其試劑盒，對(duì)疫霉病的綜合防控具有重要的理論與實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的ー個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供ー種可特異檢測(cè)辣椒疫霉的PCR引物對(duì)(試劑)。
本發(fā)明所提供的特異檢測(cè)辣椒疫霉的PCR引物對(duì)，是果膠裂解酶Pcpell5基因的特異引物對(duì)，其名稱為pell5F-R，由序列表中序列I所示的單鏈DNA(pell5F)和序列表中序列2所示的單鏈DNA(pel 156R)組成。其中，序列表中的序列I由20個(gè)核苷酸組成，序列2由22個(gè)核苷酸組成。含有pell5F_R的檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉的PCR試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑盒還可含有DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP和dGTP等其它PCR試劑。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉的方法，包括如下步驟用pell5F_R對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR，確定待測(cè)樣品中是否含有辣椒疫霉或確定待測(cè)樣品中辣椒疫霉菌的含量。
所述待測(cè)樣品可為土壤或?yàn)樗隼苯芬呙沟乃拗髦参锏慕M織和/或器官，如辣椒葉片、莖、果實(shí)等。上述方法中，可按照如下方法確定待測(cè)樣品中是否含有辣椒疫霉以待測(cè)樣品的基因組DNA或總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的CDNA為模板，用pell5F_R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足下述I)或2)的條件，則所述待測(cè)樣品含有辣椒疫霉或候選含有辣椒疫霉；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不滿足所述I)或2)的條件，則所述待測(cè)樣品不含有辣椒疫霉或候選不含有辣椒疫霉；I)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為172bp的片段；2)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為100bp_200bp的條帶。所述方法中可采用如下條件的PCR擴(kuò)增確定待測(cè)樣品中是否含有辣椒疫霉95°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 2min，58°C 45s, 72°C 30s, 40 個(gè)循環(huán)。所述方法中采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定待測(cè)樣品中辣椒疫霉的含量。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的條件可為95°C預(yù)變性2min ;94°C變性50s，54°C退火20s，65°C延伸55s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的果膠裂解酶Pcpell5基因的特異引物對(duì)pell5F_R，可對(duì)不同時(shí)期的辣椒疫霉以及不同辣椒疫病材料(病田土壌、病莖、病果、病葉)進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)，可對(duì)辣椒疫霉初侵染源及其侵染過(guò)程各個(gè)時(shí)期病菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)與預(yù)警，便于及時(shí)確定病害最佳防控時(shí)期，特別是在病菌早期活動(dòng)時(shí)期適時(shí)進(jìn)行綜合防控與治理，如根據(jù)對(duì)土壌中卵孢子檢測(cè)的有無(wú)及多少，適時(shí)處理土壤，阻斷源頭病菌的繁殖與蔓延，降低了病害防控成本。


圖I為6個(gè)果膠裂解酶基因于接種辣椒果實(shí)中RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖。圖中橫坐標(biāo)a，b，c，d分別代表辣椒疫霉接種辣椒果實(shí)天數(shù)ld、3d、5d、7d，l_6分別代表 6 個(gè) Pcpel 基因I :Pcpell, 2 :Pcpel2, 3 Pcpel4,4 :Pcpel9, 5 Pcpelll, 6 Pcpell5,18SrRNA為內(nèi)參。標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)自三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。圖2為Pcpell5基因特異引物對(duì)不同參試種菌DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖。圖中，A為Pcpel 15基因一對(duì)特異引物對(duì)pel 15F-R對(duì)不同種菌DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果；B為Pcpell基因一對(duì)特異引物對(duì)pellF-R對(duì)不同種菌DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果；1 :標(biāo)準(zhǔn)DNA ；2 :陰性對(duì)照水；3-7 :辣椒疫霉 SD33, Jul02101, Jul02104, ATCC7858, ATCC7859 ；8 :大 疫霉；9 :寄生疫霉；10 :致病疫霉；11 :棒疫霉；12 :掘氏疫霉；13 :掠桐疫霉；14 :熱帶疫霉；15 :苧麻疫霉；16 :惡疫霉；17 :苜蓿疫霉；18 :芋疫霉；19 :標(biāo)準(zhǔn)DNA ；20 :隱地疫霉；21 跳 疫霉；22 :早眷疫霉；23 :大雄疫霉；24 :采 疫霉；25 :蔥疫霉；26 :冬生疫霉；27 :瓜果腐霉；28 :水霉；29 :甘薯根霉；30 :立枯絲核；31 :串珠錸刀菌；32 :腐皮錸孢菌；33 :茄鏈格孢；34 :青霉菌；35 :淡黃曲霉。圖3為Pcpell5基因特異引物PCR檢測(cè)辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子DNA結(jié)果示意圖。圖中，A為Pcpel 15 —對(duì)特異引物對(duì)pel 15F-R對(duì)不同濃度辣椒疫霉菌SD33游動(dòng)孢子DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果；圖B為參比基因Pcpell —對(duì)特異引物對(duì)pelIF-R對(duì)不同濃度游動(dòng)孢子DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果；1 :標(biāo)準(zhǔn)DNA ；2 :陰性對(duì)照水；3 :陽(yáng)性對(duì)照辣椒疫霉DNA ;4_19 :對(duì)不同體積游動(dòng)孢子 DNA(6. 0,5. 5,5. 0,4. 5,4. 0,3. 5,3. 0,2. 5,2. O, I. 5，I. 0,0. 5,0. 4,0 . 3，
0.2,0. IyL)檢測(cè)效果(7個(gè)游動(dòng)孢子/ μ L)。圖4為Pcpell5基因特異引物PCR檢測(cè)辣椒疫霉菌SD33卵孢子DNA示意中，A為Pcpell5 —對(duì)特異引物pell5F_R對(duì)卵孢子DNA PCR檢測(cè)結(jié)果；B為Pcpell 一對(duì)特異引物pellF-R對(duì)卵孢子DNA PCR檢測(cè)結(jié)果；1 :標(biāo)準(zhǔn)DNA ；2 :陰性對(duì)照水；
3:陽(yáng)性對(duì)照辣椒疫霉菌SD33DNA ;4_14 :對(duì)不同體積的卵孢子DNA(3. 5,3. 0,2. 5,2. O, I. 5，
1.0，O. 5，O. 4，O. 3，O. 2，O. I μ L) DNA 檢測(cè)效果(7 個(gè)卵孢子 / μ L)。圖5為Pcpell5基因特異引物對(duì)pell5F_R不同辣椒疫霉菌材料PCR擴(kuò)增結(jié)果示意中，I :標(biāo)準(zhǔn)DNA ；2-3 :無(wú)菌水和健康辣椒組織DNA ；4 :辣椒疫霉菌SD33菌絲體DNA ；5 :病莖組織DNA ；6 :病果組織DNA ；7 :病葉組織DNA ；8 :人工接種卵孢子的土壤菌體DNA ；9 :含有卵孢子的病田土壤菌體DNA。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)· (New York GoldSpring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper, J 等(1988)操作技術(shù)規(guī)程或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化 試劑商店購(gòu)買得到的。實(shí)施例I、特異檢測(cè)辣椒疫霉的引物對(duì)pell5F_R的獲得及其特異性和靈敏度本實(shí)施例以辣椒疫霉為參試材料，依據(jù)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)辣椒疫霉果膠裂解酶 Pcpel 1-2 (GenBank 號(hào)分別為FJ213434_5)、Pcpel4 (GenBank 號(hào)為FJ213436)、Pcpel9 (GenBank 號(hào)為FJ213442)、Pcpelll (GenBank 號(hào)為FJ213444)及 Pcpel 15(其核苷酸序列是序列表中的序列3)基因這6個(gè)基因成員在辣椒病果實(shí)中RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的差異，比較相關(guān)數(shù)據(jù)信息，Pcpell5被界定為靶標(biāo)致病基因，設(shè)計(jì)并合成Pcpell5基因(序列3)的多對(duì)特異引物，測(cè)試了這些引物對(duì)對(duì)所有參試菌種的特異性及對(duì)辣椒疫霉菌檢測(cè)的靈敏性。從中選擇出了一對(duì)特異性和靈敏度均較高的引物對(duì)pell5F-R作為特異檢測(cè)辣椒疫霉的引物對(duì)，上游引物為pell5F(20bp)，序列為5'-CACGATGCCATTGCTGACCG-3' ;下游引物為 pell5R(22bp)，序列為 5'-GGCCGAGTACGACTTGACCTTT-3'，擴(kuò)增目的基因長(zhǎng)度為 172bp。具體步驟如下1、6個(gè)Pcpel基因在接種辣椒果實(shí)中RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平qRT-PCR檢測(cè)步驟I. I、辣椒疫霉菌 SD33(山東農(nóng)業(yè)大學(xué))(Yong Jian Jia,Bao Zhen Feng,Wen XiuSun and Xiu Guo Zhang, J. Phytopathol, 157 :585-591, 2009)游動(dòng)抱子接種辣椒果實(shí)，具體方法如下I. I. I、將辣椒疫霉菌株SD33移置于10% V8固體培養(yǎng)基培養(yǎng)4天后，挑取菌落邊緣菌絲塊至10% V8液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天，25°C黑暗培養(yǎng)5-6天。I. I. 2、加入滅菌水，剛好浸沒(méi)菌絲為宜，每隔I天換水至產(chǎn)生游動(dòng)孢子，收集游動(dòng)孢子調(diào)節(jié)濃度至I X IO5個(gè)/ml，配置游動(dòng)孢子懸浮液用于辣椒果實(shí)接種。I. I. 3、辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子懸浮液接種辣椒果實(shí) I)取新鮮幼嫩辣椒果實(shí)，經(jīng)75%無(wú)水こ醇消毒處理，置無(wú)菌操作臺(tái)晾干。2)手木刀將果實(shí)表皮組織輕輕劃破，造成深度約1cm，面積約O. 25cm2微創(chuàng)傷。3)將于適宜濃度的游動(dòng)孢子懸浮液中浸泡30min的無(wú)菌脫脂棉球覆蓋于傷ロ處，然后用保鮮膜包扎密封。4)接種果實(shí)置于28 °C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d，按照I、3、5、7d間隔取樣，切取病健交界處保存置_80°C下備用提取RNA。I. 2、提取接種辣椒果實(shí)RNA，用微量蛋白核酸測(cè)定儀(IMPLEN)測(cè)定RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)6個(gè)基因于接種辣椒病果中RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。具體方法如下I. 2. I、接種辣椒疫霉菌辣椒病果RNA提取I)取辣椒病果O. Ig于液氮中充分研磨，移入Iml Trizol中，混勻后室溫下靜置5min,使核蛋白復(fù)合物完全解離(樣品體積不超過(guò)所用Trizol體積的10% )。2)加入O. 2mL氯仿，劇烈搖動(dòng)或用旋潤(rùn)震蕩器混勻，4°C下12000rpm/min離心15min,吸取上清夜,重復(fù)一次或多次該步驟。3)吸取上清夜，每Iml Trizol加入O. 25倍體積異丙醇和O. 25倍RNA沉淀劑，充分混勻，室溫放置lOmin，于4°C下12000rpm/min離心lOmin。4)收集RNA沉淀，用75%こ醇洗滌2次，重復(fù)上述離心。5) 一次性吸頭吸盡殘存こ醇，打開(kāi)管蓋的離心管放置實(shí)驗(yàn)臺(tái)幾分鐘，使殘余こ醇揮發(fā)棹。6)加50-100 μ I DEPC處理的水，將RNA溶液貯存于_70°C。I. 2. 2、RNA 檢測(cè)通過(guò)RNA甲醛變性電泳鑒定RNA完整性，rRNA占總RNA80-85%，瓊脂糖凝膠可清晰看到28S和18SrRNA。28SrRNA量約是18SrRNA的兩倍，說(shuō)明RNA完整性較好。取2. 5 μ IRNA樣品，用微量蛋白核酸測(cè)定儀(MPLEN)測(cè)定RNA，結(jié)果表明Α260/Α280比值為I. 9-2. 1，得到純度較高的RNA。I. 2. 3、反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成I)反應(yīng)體系為最終為 20 μ L，10 X RT mix 2 μ L，2. 5mmol/LdNTP 混合液 2 μ L，引物01igo_dT 2 μ L, Quant Reverse Transcriptase I μ L, RNase Free ddH20 13_xyL,豐莫板RNA第四步加入χ μし2)將模板RNA在冰上解凍，引物、10 X RT mix、dNTP混合液、RNase Free ddH20在室溫解凍，然后迅速置于冰上。使用前將各種溶液渦旋振蕩混勻，簡(jiǎn)短離心收集殘留于管壁上的液體。3)按照I)反轉(zhuǎn)錄體系配制混合液，徹底混勻，渦旋振蕩不超過(guò)5秒鐘，簡(jiǎn)短離心，置于冰上。4)如需多個(gè)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可將配制好的混合液分裝在單反應(yīng)管中，置于冰上。5)將模板RNA加入混合液中，徹底混勻，簡(jiǎn)短離心收集管壁上殘留液體。
6) 37°C孵育60分鐘，后反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)。I. 2. 4、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (qRT-PCR)所采用的qRT-PCR引物序列如下Pcpell 的上游引物5'-CGACCTTCGACTTCCGTAC-3'，Pcpell 的下游引物5'-CCGTGTTGCTCATTCCTCC-3' ；Pcpel2 的上游引物5' -CAGATGATCGCCACCAACAC-3'，Pcpel2 的下游引物5'-TGTGCCAAGGAAGAGGAAGG-3' ；Pcpel4 的上游引物5' -ACGTTCGACTTCCGTGGTACTGA-3'，Pcpel4 的下游引物5'-TCGTACGTGATCTTGACGGGAGT-3' ；Pcpel9 的上游引物5' -ACCACGTCAAGATCTCGAGCAT-3'，，Pcpel9 的下游引物5'-CGTAGAAGAGCATGGTCCAGTAGT-3' ；Pcpelll 的上游引物5'-TGATTCTCGGCAAGCAAACG-3'，Pcpelll 的下游引物5'-ATACCCACCCGTAGCCACAT-3' ；Pcpell5 的上游引物5'-CACGATGCCATTGCTGACCG-3' (序列 I)，Pcpell5 的下游引物5'-GGCCGAGTACGACTTGACCTTT_3'(序列 2、；以辣椒寄主18S rRNA為內(nèi)參基因，其上游引物5' -TTTCGGTCCTATTACGTTGG-3' ;下游引物5'-TTCGCAGTTGTTCGTCTTTC-3'。以不同接種時(shí)間辣椒果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行qRT-PCR, PCR 擴(kuò)增體系為 20μ L，2. 5 XrealMasterMix :8 μ L，20 X SYBR solution I μ L，正向引物(λ 5 μ L，反向引物(λ 5 μ L，cDNA模板2 μ L，加dd H2O至20 μしPCR參數(shù)95°C預(yù)變性2min ;94°C變性50s，54°C退火20s，65°C延伸55s，40個(gè)循環(huán)，65_95°C制備溶解曲線。選擇辣椒寄主18S rRNA為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)，用法對(duì)樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對(duì)定量分析。ΛΛ Ct = (CT target_CT 18S rENA)待_本-
(しTtarget しT 18S rRNA)校準(zhǔn)樣
ホ，選擇每個(gè)基因在接種第一天的表達(dá)為校準(zhǔn)樣本，第3、5、7天為待測(cè)樣本，例如
樣本名稱「JUNMean(Ct) I 18SrRNA Mean(Ct) 「Λ Ct I AACt [2~AACt
127. 3516.9810. 37OI
227. 5216.8610.660.29 0.82
以I號(hào)樣本為校準(zhǔn)樣本，2號(hào)為待測(cè)樣本，應(yīng)用ΛΛ Ct法進(jìn)行分析第一歩，應(yīng)用參照基因?qū)π?zhǔn)樣本和待測(cè)樣本進(jìn)行校正Λ Ct (校準(zhǔn)樣本)=JUN (Mean Ct)「參照基因 18S rRNA (Mean C^1 = 27. 35-16. 98 =10. 37Δ Ct(待測(cè)樣本)=JUN (Mean Ct) 2-參照基因 18S rRNA (Mean Ct) 2 = 27. 52-16. 86 =10. 66第二步，校準(zhǔn)樣本和待測(cè)樣本的Λ Ct進(jìn)行歸一化ΔΔ Ct = Δ Ct(待測(cè)樣本廠 Δ Ct(校準(zhǔn)樣本)=10. 66_10. 37 = O. 29第二步，表達(dá)差異計(jì)算2^AAct = 2-0·29 = O. 82因此2號(hào)樣本的JUN基因的表達(dá)水平比I號(hào)低O. 82倍。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明6個(gè)基因成員中Pcpell5基因RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在接種第7天最高(圖I)，由此將其界定為靶標(biāo)致病基因。2、Pcpell5基因特異引物設(shè)計(jì)并合成Pcpell5基因的若干對(duì)特異引物，測(cè)試了這些引物對(duì)對(duì)所有參試菌種的特異性及對(duì)辣椒疫霉菌檢測(cè)的靈敏性。從中選擇出了一對(duì)特異性和靈敏度均較高的引物對(duì)Pel 15F-R作為特異檢測(cè)辣椒疫霉的弓I物對(duì)，上游引物為pel 15F (20bp)，序列為 5' -CACGATGCCATTGCTGACCG-3' (序列 I);下游引物為 pell5R(22bp)，序列為5' -GGCCGAGTACGACTTGACCTTT-3' (序列2)，擴(kuò)增目的基因長(zhǎng)度為172bp。同時(shí)以PcpelUGenBank號(hào)為FJ213434)為參比基因，選擇Pcpell —對(duì)特異性引物，名稱為pellF-R,上游引物為 pellF，序列為 5'_tcgtgcagaacatccacatcac_3',下游引物為 pellR,序列為5'_cgtcccagttgagccttgc_3',擴(kuò)增目的基因長(zhǎng)度為574bp。2. l、Pcpell5和Pcpell的一對(duì)特異引物的特異性2. I. I.供試種菌及其培養(yǎng)制作供試菌株辣椒疫霉(P.capsici) SD33, Jul02101, Jul02104(J. Phytopathol157 :585-591,2009), ATCC7858, ATCC7859,大豆疫霉(P. so jae) SCRP555 (MolecularPlant Pathology,2006，7(5)365-379)、寄生疫霉(P. parasitic)SD-I(J. Phytopathol157 :585-591, 2009)、致病疫霉(P. infestans) Aug0206-7 (J. Phytopathol 157 :585-591,2009)、樟疫霉(P. cinnamomi) (CBS341. 72)、掘氏疫霉(P. drechsleri) (CBS 111342)、棕櫚疫霉(P. palmivora) (CBS 111346)、熱帶疫霉(P. tropicalis) (CBS121658)、苧麻疫霉(P. boehmeriae) (CBS 111328)、惡疫霉(P. cactorum) (CBS 128432)、苜猜疫霉(P. medicaginis) (CBS119902)、芋疫霉(P. colocasiae) (CBS 192.91)、隱地疫霉(P. cryptogea) (CBS 130886)、豌豆疫霉(P. erythroseptica) (CBS 111343)、草莓疫霉(P. fragariae) (CBS309. 62)、大雄疫霉(P. megasperma) (CBS 118733)、菜豆疫霉(P. phaseoli) (CBS120373)、蔥疫霉(P. porri) (CBS127101)、冬生疫霉(P. hibemalis)(CBSl 19904)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum) (CBS 127509)、水霉(Saprolegniasp.) (CBS 342. 62)分別用V8培養(yǎng)基(培養(yǎng)基制作參照植病研究方法，1998，37-52)。甘薯根霉(Rhizopus batatas) (CBS 387. 34)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani) (CBS 124594)、串珠祿刀菌(Fusarium moniliforme) (CBS130180)、腐皮祿抱菌(F. solani) (CBS 130328)、爺鏈格抱(Alternaria solani) (CBS347. 79)、青霉菌(Penicillium sp.) (CBS339. 61)及淡黃曲霉(Aspergillus cremeus) (CBS477. 65)均用馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)(培養(yǎng)基制作參照植病研究方法，1998,37-52)。辣椒疫霉游動(dòng)孢子懸浮液和土壤卵孢子制備及記數(shù)方法參考疫霉研究技術(shù)，1997，78-83)。2. 1.2.菌體培養(yǎng)與收集供試各種疫霉菌移至燕麥平板培養(yǎng)基上，于25°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3d后,從菌落邊緣切取菌塊，轉(zhuǎn)至V8培養(yǎng)基，而其它參試真菌移至PDA培養(yǎng)基上，所有參試種菌均25°C震蕩培養(yǎng)5-7d，無(wú)菌紗布過(guò)濾，經(jīng)冷凍抽干研制成粉，_20°C保存?zhèn)溆谩?. I. 3.參試?yán)苯芬呙咕煌N菌材料DNA提取采用CTAB法，提取的DNA于_20°C保存?zhèn)溆?，并分別取2 μ L (50ng/ μ L)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
2. I. 4. Pcpel 15和Pcpell基因特異引物對(duì)參試種菌DNA的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系均為10XPCR緩沖液5 μ L，模板DNA(50ng) 2 μ L，上下游引物各I μ L (Pcpe 115和Pcpe 11基因上下游引物濃度均相同，均為IO μ Μ)，dNTP (2. 5mmo I /L) 4 μ L，MgCl2 (25mmol/L) 4 μ L，Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L (5 單位 / μ L)，ddH20 (32. 5 μ L)。PCR 檢測(cè)程序均為95°C 預(yù)變性 3min ;94°C 變性 2min，58°C 45s, 72 °C 30s，40 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。取10 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 5%的TBE膠檢測(cè)，用DL2000DNAMarker作對(duì)照。電泳結(jié)束后，用Bio Imaging System Gene Cenius LP-400全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描于計(jì)算機(jī)軟件中保存。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明Pcpell5基因的一對(duì)特異引物pell5F_R與參比Pcpell基因的一對(duì)特異引物pelIF-R均對(duì)5個(gè)辣椒疫霉菌樣品具特異檢測(cè)性能。pell5F_R對(duì)5個(gè)辣椒疫霉菌樣品的擴(kuò)增體系均得到了 172bp的片段，PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果表明這5株辣椒疫霉菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列均為序列表中序列3的第954-1125位；pellF-R對(duì)5個(gè)辣椒疫霉菌樣品的擴(kuò)增體系均得到了 574bp的片段(圖2)。2. 2Pcpell5和Pcpell基因特異引物的靈敏度該步驟通過(guò)定量檢測(cè)辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子和卵孢子的實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)Pcpell5和Pcpell基因特異引物的靈敏度。2. 2. I.對(duì)辣椒疫霉游動(dòng)孢子DNA的PCR取50 μ L無(wú)菌水中加入350個(gè)辣椒疫霉菌SD33游動(dòng)孢子(顯微鏡下直接記述)，加O. 05g石英砂，在渦旋器上劇烈震蕩3min，稍離心，上清液即為游動(dòng)孢子的DNA粗提液，分別取 6. 0,5. 5,5. 0,4. 5,4. 0,3. 5,3. 0,2. 5,2. O, I. 5，I. 0,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2,0. I μ L 上清液直接作為PCR擴(kuò)增模板。特異引物對(duì)pe 115F-R和pe IIF-R的PCR擴(kuò)增中，所采用的PCR反應(yīng)體系均為50μ LoPcpelK和Pcpell的PCR反應(yīng)體系均為10XPCR緩沖液5 μ L，PCR擴(kuò)增模板，上下游引物各I V- L(Pcpme 6和Pcpme I基因上下游引物濃度均相同，均為10 μ Μ), dNTP (2. 5mmol/L) 4 μ L，MgCl2 (25mmol/L) 4 μ L, Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L (5 單位 / μ L)，カロ ddH20 補(bǔ)足至50 μ L0PCR 檢測(cè)程序均為95°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 2min，58°C 45s，72°C 30s，40 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。取10 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 5%的TBE膠檢測(cè)，用DL2000 DNAMarker作對(duì)照。電泳結(jié)束后，用Bio Imaging System Gene Cenius LP-400全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描于計(jì)算機(jī)軟件中保存。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明Pcpel 15基因一對(duì)特異引物pel 15F-R均對(duì)不同濃度的游動(dòng)孢子具明顯的檢測(cè)效果，尤其對(duì)游動(dòng)孢子DNA樣品為O. 4，0. 3，0. 2和O. I μ L均具明顯的檢測(cè)效果，均得到了 172bp的片段，檢測(cè)游動(dòng)孢子精度最低可達(dá)O. 7個(gè)/50 μ L，而PcpelI基因一對(duì)特異引物pellF-R對(duì)游動(dòng)孢子DNA樣品的最低檢測(cè)體積為O. 5 μ L，對(duì)O. 4,0. 3，O. 2，O. I μ L樣品不具檢測(cè)效果，檢測(cè)游動(dòng)孢子精度最低可達(dá)3. 5個(gè)/50 μ L (圖3)。因此，Pcpel 15基因特異引物pel 15F-R較參比基因Pcpel I基因特異引物pel IF-R對(duì)辣椒疫霉游動(dòng)孢子的檢測(cè)靈敏度更高。2. 2. 2.對(duì)辣椒疫霉卵孢子DNA的PCR取50 μ L無(wú)菌水中加入350個(gè)辣椒疫霉菌SD33卵孢子(顯微鏡下直接記述)，加O. 05g石英砂，在渦旋器上劇烈震蕩3min，稍離心，上清液即為游動(dòng)孢子的DNA粗提液，分別取 3. 5，3. 0，2. 5，2. 0，L 5，L 0，O. 5，O. 4，O. 3，O. 2，O. I μ L 上清液直接作為 PCR 擴(kuò)增模板。特異引物對(duì)pe 115F-R和pe IIF-R的PCR擴(kuò)增中，所采用的PCR反應(yīng)體系均為50 μしPCR反應(yīng)體系均為=IOXPCR緩沖液5 μ L，PCR擴(kuò)增模板，上下游引物各lyL(Pcpell5和Pcpell基因上下游引物濃度均相同，均為10 μ M)，dNTP (2. 5mmo I/L) 4 μ L，MgCl2 (25mmol/L) 4 μ L, Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L (5 單位 / μ L)，カロ ddH20 補(bǔ)足至50 μ L0PCR檢測(cè)程序均為95で預(yù)變性3min ;94で變性2mi η, 58 °C 45s,72°C 30s, 40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。取10 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 5%的TBE膠檢測(cè)，用DL2000DNAMarker作對(duì)照。電泳結(jié)束后，用Bio Imaging System Gene Cenius LP-400全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描于計(jì)算機(jī)軟件中保存。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明Pcpel 15基因一對(duì)特異引物pel 15F-R均對(duì)不同濃度的卵孢子具明顯的檢測(cè)效果，尤其對(duì)卵孢子DNA樣品為O. 4，0. 3，0. 2，0. I μ L均具明顯的檢測(cè)效果，均得到了 172bp的片段，檢測(cè)卵孢子精度最低可達(dá)O. 7個(gè)/50 μ L，而Pcpell基因一對(duì)特異引物pel IF-R對(duì)卵孢子DNA樣品的最低檢測(cè)體積為O. 5 μ L，對(duì)O. 4，O. 3,0. 2,0. IyL樣品不具檢測(cè)效果，檢測(cè)卵孢子精度最低可達(dá)3. 5個(gè)/50 μ L (圖4)。因此，Pcpel 15基因特異引物pell5F-R較參比基因Pcpell基因特異引物pellF-R對(duì)辣椒疫霉卵孢子的檢測(cè)靈敏度更高。實(shí)施例2、Pcpell5基因特異引物對(duì)Pme6F-R對(duì)不同病組織和病田土壤DNA PCR檢測(cè)本實(shí)施例測(cè)試了 pell5F_R對(duì)病田土壌、病莖、病果、病葉中辣椒疫霉的檢測(cè)效果，具體方法如下I. DNA 提取將辣椒疫霉菌SD33轉(zhuǎn)至V8固體平板中，25°C黑暗培養(yǎng)2_3d后，用打空氣從菌落邊緣取菌落塊(2_X2mm)，創(chuàng)傷接種于辣椒(中椒6號(hào))幼苗(7_9片葉)莖基部、果實(shí)，同 樣大小的菌塊微傷ロ接種于辣椒葉片，然后分別切取不同發(fā)病組織，參考Wang等(NucleicAcids Research，1993，21 :4153-4154)的NaOH法提取病組織的DNA :分別取一段病莖、病果、病葉，Img病組織加入10 ii L 0. 5mol/L NaOH,充分研磨后轉(zhuǎn)至I. 5mL的eppendorf離心管中，IOOOOrpm 離心 5min,取 5 u L 上清液加入 495 u L0. Immol /T, Tris (pH 8. 0)，混均后取11； L作為模板直接用于PCR擴(kuò)增。用本方法提取的健康辣椒(中椒6號(hào))莖、果實(shí)、葉片的混合DNA為空白對(duì)照。以辣椒疫霉菌SD33的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)辣椒疫霉菌SD33感染的病田土壤DNA以及人工接種辣椒疫霉菌SD33卵孢子的病田土壤DNA提取方法同實(shí)施例1，取I U LDNA作為模板。2. Pcpell5基因特異引物對(duì)不同辣椒疫病組織DNA的PCR擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系為:10\ 0 緩沖液51^，模板，？11166 和？111661 各1111( 0 1肥 6 和Pcpme I 基因上下游引物濃度均相同，均為 IOuM), dNTP (2. 5mmol/L) 4 u L, MgCl2 (25mmol/L)4u L, Taq DNA 聚合酶 0. 5u L(5 單位 / y L)，加 ddH20 補(bǔ)足至 50 u L。PCR檢測(cè)程序?yàn)?5°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 2min，58°C 45s, 72°C 30s，40 個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸lOmin。取10 y L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 5%的TBE膠檢測(cè)，用DL2000DNA Marker作對(duì)照。電泳結(jié)束后，用Bio Imaging System Gene Cenius LP-400全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描于計(jì)算機(jī)軟件中保存。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明病莖組織DNA、病果組織DNA、病葉組織DNA、人工接種卵孢子的土壤菌體DNA和含有卵孢子的病田土壤菌體DNA經(jīng)過(guò)特異性引物對(duì)pell5F-R的PCR擴(kuò)增，均得到了 172bp的片段(圖5)，說(shuō)明pell5F-R對(duì)不同辣椒疫霉病組織和病田土壤中的辣椒疫霉菌具明顯的檢測(cè)效果。本發(fā)明所提供的Pcpell5基因的一對(duì)特異引物pell5F-R能對(duì)不同時(shí)期的辣椒疫霉菌進(jìn)行定性、定量檢測(cè)與預(yù)警。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉的特異引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成。
2.檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉的PCR試劑，其特征在于所述試劑含有權(quán)利要求I所述的特異引物對(duì)。
3.檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉的PCR試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有為權(quán)利要求I所述的特異引物對(duì)。
4.權(quán)利要求I所述的特異引物對(duì)在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述特異性引物對(duì)在檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉中的應(yīng)用。
6.檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟用權(quán)利要求I所述特異性引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR，確定待測(cè)樣品中是否含有辣椒疫霉或確定待測(cè)樣品中辣椒疫霉的含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于按照如下方法確定待測(cè)樣品中是否含有辣椒疫霉以所述待測(cè)樣品的基因組DNA或總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用權(quán)利要求I所述特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足下述I)或2)的條件，則所述待測(cè)樣品含有辣椒疫霉或候選含有辣椒疫霉；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不滿足所述I)或2)的條件，則所述待測(cè)樣品不含有辣椒疫霉或候選不含有辣椒疫霉； 1)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為172bp的片段； 2)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為100bp-200bp的條帶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中采用如下條件的PCR擴(kuò)增確定待測(cè)樣品中是否含有辣椒疫霉95°C預(yù)變性3min ;94°C變性2min，58°C 45s, 72°C 30s, 40個(gè)循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定待測(cè)樣品中辣椒疫霉的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的條件為95°C預(yù)變性2min ;94°C變性50s，54°C退火20s，65°C延伸55s，40個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了基于果膠裂解酶Pcpel15基因開(kāi)發(fā)的檢測(cè)辣椒疫霉菌的引物及方法。本發(fā)明基于果膠裂解酶Pcpel15基因開(kāi)發(fā)的檢測(cè)辣椒疫霉菌的引物，由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成。該引物可對(duì)不同時(shí)期的辣椒疫霉以及不同辣椒疫病材料進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)，可對(duì)辣椒疫霉初侵染源及其侵染過(guò)程各個(gè)時(shí)期病菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)與預(yù)警，便于及時(shí)確定病害最佳防控時(shí)期，特別是在病菌早期活動(dòng)時(shí)期適時(shí)進(jìn)行綜合防控與治理，如根據(jù)對(duì)土壤中卵孢子檢測(cè)的有無(wú)及多少，適時(shí)處理土壤，阻斷源頭病菌的繁殖與蔓延，降低了病害防控成本。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102676670SQ201210140038
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者張修國(guó) 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)