專利名稱：雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白及其用途的制作方法
雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白及其用途相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)是非臨時(shí)申請(qǐng)，其要求2010年7月9日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61 /363，120的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過弓I用并入本文。領(lǐng)域
提供了多價(jià)和多特異性結(jié)合蛋白，制備方法，和具體而言涉及其在急性和慢性炎性疾病、癌癥和其他疾病的診斷、預(yù)防和/或治療中的用途。背景
工程改造的蛋白，例如能夠結(jié)合2種或更多抗原的多特異性抗體是本領(lǐng)域已知的。此種多特異性結(jié)合蛋白可以使用細(xì)胞融合、化學(xué)綴合、或重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生。
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基于2種不同雜交瘤細(xì)胞系的體細(xì)胞融合，已使用四源雜交瘤(quadroma)技術(shù)(參見 Milstein，C.和 A.C.Cuello (1983) Nature, 305 (5934):第 537-40 頁)生產(chǎn)了雙特異性抗體，所述雜交瘤細(xì)胞系表達(dá)具有雙特異性抗體的所需特異性的鼠單克隆抗體(mAbs)。因?yàn)?種不同免疫球蛋白(Ig)重和輕鏈在所得到的雜合-雜交瘤(或四源雜交瘤)細(xì)胞系內(nèi)隨機(jī)配對(duì)，所以產(chǎn)生最高達(dá)10種不同Ig種類，其中只有一種是功能性雙特異性抗體。錯(cuò)配對(duì)副產(chǎn)品的存在和顯著減少的生產(chǎn)產(chǎn)量意味著需要復(fù)雜的純化程序。雙特異性抗體也可以通過2種不同mAbs的化學(xué)綴合來生產(chǎn)(參見,Staerz, U.D.,等人(1985), Nature 314(6012):第628-31頁)。這種方法不產(chǎn)生均質(zhì)制劑。其他方法已使用2種不同mAbs或較小抗體片段的化學(xué)綴合(參見Brennan, Μ.，等人(1985), Science229(4708):第 81-3 頁)。用于產(chǎn)生雙特異性抗體的另一種方法是用異雙功能交聯(lián)劑偶聯(lián)2種親本抗體，但所得到的雙特異性抗體經(jīng)受顯著的分子異質(zhì)性，因?yàn)榻宦?lián)劑與親本抗體的反應(yīng)不是定點(diǎn)的。為了獲得更均質(zhì)的雙特異性抗體制劑，2種不同F(xiàn)ab片段已以定點(diǎn)方式在其鉸鏈半胱氨酸殘基上進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)(參見Glennie，M.J.，等人(1987)，J Immunol 139(7):第2367-75頁)。但這種方法產(chǎn)生Fab’ 2片段，而不是全I(xiàn)gG分子。已開發(fā)了廣泛多樣的其他重組雙特異性抗體形式(參見Kriangkum, J.,等人(2001)，Biomol Eng 18 (2):第31-40頁)。在它們當(dāng)中，串聯(lián)單鏈Fv分子和雙抗體(diabody)、及其各種衍生物是最廣泛使用的。常規(guī)地，這些分子的構(gòu)建從識(shí)別不同抗原的2個(gè)單鏈 Fv(scFv)片段開始(參見 Economides, A.N.,等人(2003), Nat Med 9(1):第 47-52頁)。串聯(lián)scFv分子(taFv)代表用另外的肽接頭簡單連接2個(gè)scFv分子的簡單形式。這些串聯(lián)scFv分子中存在的2個(gè)scFv片段形成分開的折疊實(shí)體。各種接頭可以用于連接2個(gè)scFv片段和接頭具有最高達(dá)63個(gè)殘基的長度(參見Nakanishi，K.，等人(2001)，AnnuRev Immunol 19:第423-74頁)。盡管親本scFv片段可以以可溶形式在細(xì)菌中正常表達(dá)，然而，常常觀察到串聯(lián)scFv分子在細(xì)菌中形成不溶性聚集體。因此，重折疊方案或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的使用常規(guī)應(yīng)用于生產(chǎn)可溶性串聯(lián)scFv分子。在近期研究中，報(bào)道了通過轉(zhuǎn)基因兔和牛體內(nèi)表達(dá)針對(duì)⑶28的串聯(lián)scFv和黑素瘤相關(guān)蛋白聚糖(參見Gracie，J.A.，等人(1999)，J Clin Invest.104(10):第 1393-401 頁)。在這個(gè)構(gòu)建體中，2 個(gè) scFv 分子通過CHl接頭進(jìn)行連接，且得到最高達(dá)100 mg/L的雙特異性抗體血清濃度。使用各種策略包括結(jié)構(gòu)域順序變化或使用具有變化長度或柔性的中間接頭，以允許在細(xì)菌中可溶性表達(dá)。少數(shù)研究現(xiàn)在已報(bào)道了使用非常短的Ala3接頭或長的富甘氨酸/絲氨酸接頭，在細(xì)菌中表達(dá)可溶性串聯(lián)scFv分子(參見Leung，B.P.，等人(2000)，J Immunol 164(12):第 6495-502 頁；Ito, A.，等人(2003)，J Immunol 170(9):第 4802-9 頁；Kami, A.，等人(2002)，J Neuroimmunol 125 (1-2):第134-40頁)。在另一個(gè)近期研究中，包含長度為3或6個(gè)殘基的隨機(jī)化中間接頭的串聯(lián)scFv譜(repertoire)曬菌體展示,用于富集以可溶和活性形式在細(xì)菌中生產(chǎn)的那些分子。這種方法導(dǎo)致分離具有6個(gè)氨基酸殘基接頭的串聯(lián)scFv 分子(參見 Arndt, Μ.和 J.Krauss (2003)，Methods Mol Biol 207:第 305-21 頁)。這種接頭序列是否代表串聯(lián)scFv分子可溶性表達(dá)的一般解決方案仍不清楚。然而，這項(xiàng)研究證明串聯(lián)scFv分子的噬菌體展示與定向誘變組合是富集這些分子的有力工具，所述分子可以以活性形式在細(xì)菌中表達(dá)。雙特異性雙抗體(Db)利用雙抗體形式用于進(jìn)行表達(dá)。通過使連接VH和VL結(jié)構(gòu)域的接頭長度減少至約5個(gè)殘基，由scFv片段生產(chǎn)雙抗體(參見Peipp，Μ.和Τ.Valerius (2002), Biochem Soc Trans 30(4):第 507-11 頁)。接頭尺寸的這種減少通過使VH和VL結(jié)構(gòu)域交叉配對(duì)促進(jìn)2條多肽鏈的二聚化。雙特異性雙抗體通過在相同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)2條多肽鏈來生產(chǎn)，所述2條多肽鏈具有結(jié)構(gòu)VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL構(gòu)型)、或VLA-VHB和VLB-VHA (VL-VH構(gòu)型)。在過去已生產(chǎn)了大量品種繁多的不同雙特異性雙抗體，并且它們中的大多數(shù)以可溶形式在細(xì)菌中表達(dá)。然而，近期的比較研究證明可變結(jié)構(gòu)域的方向可以影響活性結(jié)合部位的表達(dá)和形成(參見Mack, Μ.,等人(1995), Proc Natl AcadSci U S A 92(15):第7021-5頁)。然而，在細(xì)菌中的可溶性表達(dá)代表超過串聯(lián)scFv分子的重要優(yōu)點(diǎn)。然而，因?yàn)?條不同多肽鏈在單一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所以可以生產(chǎn)無活性同源二聚體連同活性異二聚體。這使另外純化步驟的進(jìn)行成為必需，以獲得雙特異性雙抗體的均質(zhì)制齊U。促使雙特異性雙抗體產(chǎn)生的一種方法是結(jié)進(jìn)孔(knob-1nto-hole)雙抗體的生產(chǎn)(參見 Holliger, P., T.Prospero 和 G.Winter (1993), Proc Natl Acad Sci USA 90(14):第6444-8.18頁)。該方法對(duì)于針對(duì)HER2和⑶3的雙特異性雙抗體進(jìn)行了證明。通過用Phe交換Val37和用Trp交換Leu45將大結(jié)引入VH結(jié)構(gòu)域內(nèi)，且在抗HER2或抗⑶3可變結(jié)構(gòu)域中，通過使Phe98突變 為Met和使Tyr87突變?yōu)锳la在VL結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生互補(bǔ)孔。通過使用這種方法，雙特異性雙抗體的生產(chǎn)可以從經(jīng)由親本雙抗體的72%增至經(jīng)由結(jié)進(jìn)孔雙抗體的超過90%。重要的是，作為這些突變的結(jié)果生產(chǎn)產(chǎn)量只有輕微減少。然而，對(duì)于幾種構(gòu)建體觀察到抗原結(jié)合活性的減少。因此，這種相當(dāng)精細(xì)的方法需要分析各種構(gòu)建體，以鑒定產(chǎn)生具有不變結(jié)合活性的異二聚分子的那些突變。此外，此種方法需要免疫球蛋白序列在恒定區(qū)的突變修飾，因此生成非天然和非自然形式的抗體序列，這可以導(dǎo)致免疫原性增加、體內(nèi)穩(wěn)定性差、以及不希望有的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。單鏈雙抗體(scDb)代表改善雙特異性雙抗體樣分子形成的可替代策略(參見Holliger, P.和 G.Winter(1997), Cancer Tmmunol Immunother 45(3-4):第 128-30 頁；ffu, A.M.，等人(1996)，Immunotechnology 2(1):第 21-36 頁)。雙特異性單鏈雙抗體通過用另外的中間接頭連接2條雙抗體形成多肽鏈來產(chǎn)生，所述另外的中間接頭長度為約15個(gè)氨基酸殘基。因此，分子量對(duì)應(yīng)于單體單鏈雙抗體(50 — 60 kDa)的所有分子都是雙特異性的。幾項(xiàng)研究已證明雙特異性單鏈雙抗體在細(xì)菌中以可溶和活性形式表達(dá)，其中大多數(shù)純化的分子呈現(xiàn)為單體(參見Holliger, P.和G.Winter (1997) , Cancer TmmunolImmunother 45(3-4):第 128-30 頁；ffu, A.Μ.,等人(1996) Immunotechnol.2(1):第 21-36頁；Pluckthun, A.和 P.Pack (1997) Immunotechno1.3(2):第 83-105 頁；Ridgway,J.B.，等人(1996)，Protein Engin.9 (7):第617-21頁)。因此，單鏈雙抗體組合了串聯(lián)scFvs (所有單體都是雙特異性的)和雙抗體(在細(xì)菌中可溶性表達(dá))的優(yōu)點(diǎn)。更近地，雙抗體已與Fe融合以產(chǎn)生更Ig樣的分子，稱為雙-雙抗體(d1-diabodies)(參見 Lu, D.，等人(2004)，J Biol Chem 279 (4):第 2856-65 頁)。此外，已描述了在IgG重鏈中包含2個(gè)Fab重復(fù)且能夠結(jié)合4個(gè)抗原分子的多價(jià)抗體構(gòu)建體(參見 WO 0177342A1，和 Miller，K.，等人(2003)，J Immunol 170(9):第 4854-61 頁)。本領(lǐng)域需要能夠結(jié)合2種或更多抗原的改良的多價(jià)結(jié)合蛋白。美國專利申請(qǐng)系列號(hào)11/507，050提供了能夠以高親和力結(jié)合2種或更多抗原的結(jié)合蛋白新家族，其被稱為雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白(DVD-1g TM)。此外，提供了新的能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的結(jié)合蛋白。概沭
提供了能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的多價(jià)結(jié)合蛋白。提供了能夠以高親和力結(jié)合兩種或更多種抗原的結(jié)合蛋白的新的家族。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，C是恒定結(jié)構(gòu)域，Xl代表氨基酸或多肽，X2代表Fe區(qū)和η是O或I。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白中的VDl和VD2是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域是小鼠重鏈可變結(jié)構(gòu)域、人重鏈可變結(jié)構(gòu)域、CDR接枝的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或人源化重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，VDl和VD2能夠結(jié)合相同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，VDl和VD2能夠結(jié)合不同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。例如，Xl是接頭，條件是Xl不是CH1。例如，Xl 是包括如下的接頭:AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO:1); AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP(SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 8) ; RADAMA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10);ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13);TVMPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) ; QPKAAP (SEQ ID NO: 15) ; QPKMPSVTLFPP (SEQ ID NO:16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); akttap (SEQ ID NO:19); akttapsvyplap (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQID NO: 22)， GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24);GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25);或者 GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26)。在一個(gè)實(shí)施方案中，X2是Fe區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X2是變體Fe區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的結(jié)合蛋白包含多肽鏈，其中多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CHl，且X2是Fe區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 結(jié)合蛋白中的VDl和VD2是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域是小鼠輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、CDR接枝的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或人源化輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，VDl和VD2能夠結(jié)合相同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，VDl和VD2能夠結(jié)合不同抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Xl是接頭，條件是Xl不是CU。在一個(gè)實(shí)施方案中，Xl 包括 AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO:1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2);AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5);RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8);RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9).SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10) ; ADAAP (SEQID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ; AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18) ; akttap (SEQ ID NO: 19);akttapsvyplap (SEQ ID NO: 20) ; ASTKGP (SEQ ID NO: 21) ; ASTKGPSVFPLAP (SEQ IDNO: 22)，GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) ; GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24);GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25);或者GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白不包含X2。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈和可變輕鏈均包含相同接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈和可變輕鏈包含不同接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈和可變輕鏈均包含短(約6個(gè)氨基酸)接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈和可變輕鏈均包含長(多于6個(gè)氨基酸)接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈包含短接頭而可變輕鏈包含長接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈包含長接頭而可變輕鏈包含短接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的結(jié)合蛋白包含多肽鏈，其中所述多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2不包含F(xiàn)e區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含2條多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中所述第一多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)重`鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2是Fe區(qū)；且所述第二多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2不包含F(xiàn)e區(qū)。在具體實(shí)施方案中，雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)結(jié)合蛋白包含4條多肽鏈，其中首先2條多肽鏈分別包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2是Fe區(qū)；且其次2條多肽鏈分別包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2不包含F(xiàn)e區(qū)。此種雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)蛋白具有4個(gè)抗原結(jié)合部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合一種或多種靶。因此，在一些實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白包含至少兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域序列(例如，VDl和VD2)，其能夠結(jié)合至少兩種不同的靶。在一些實(shí)施方案中，VDl和VD2是獨(dú)立地選擇的。因此，在一些實(shí)施方案中，VDl和VD2包含相同的SEQ ID NO，在其他實(shí)施方案中，VDl和VD2包含不同的SEQ ID NO。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶是細(xì)胞因子、細(xì)胞表面蛋白、酶或者受體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白能夠調(diào)節(jié)一種或多種靶的生物學(xué)功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白能夠中和一種或多種靶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白能夠結(jié)合下述示例性細(xì)胞因子:淋巴因子、單核因子、多肽激素、受體或腫瘤標(biāo)記。例如，在一些實(shí)施方案中，DVD-1g能夠結(jié)合下述的兩種或更多種:神經(jīng)生長因子(NGF)，氨甲喋呤(MTX) ; NKG2D; IGFl, 2; RON; ErbB3;CD-3; IGFR; HGF; VEGF; DLL4; PlGF; CD-20; EGFR; HER-2; CD-19; CD-80; CD-22;CD-40; c-MET;以及NRPl (也見表2)。在具體實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白能夠結(jié)合下述示例性靶對(duì):NGF 和 MTX; NGF 和 NKG2D; NGF 和 IGF1, 2; NGF 和 RON; NGF 和 ErbB3; NGF 和 CD-3;NGF 和 IGFR; NGF 和 HGF; NGF 和 VEGF; NGF 和 DLL4; NGF 和 PlGF; NGF 和 CD-20; NGF 和EGFR; NGF 和 HER-2; NGF 和 CD-19; NGF 和 CD-80; NGF 和 CD-22; NGF 和 CD-40; NGF 和c-MET;或者NGF和NRPl (見實(shí)施例2.1至2.60)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白包含VDl和VD2重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述VDl和VD2重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括 SEQ ID NO: 28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88 或 90;和 VDl 和 VD2 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述 VDl 和 VD2 輕 鏈可變結(jié)構(gòu)域包括 SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89 或91。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白包含如表12-71中所示的重鏈和輕鏈序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合NGF (seq.2)和MTX的結(jié)合蛋白含有包含SEQ IDN0:96或SEQ ID NO:98的重鏈；和包含SEQ ID N0:97或SEQ ID NO:99的輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合NGF (seq.2)和MTX的結(jié)合蛋白包含SEQ ID NO: 96的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO: 97的輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合NGF (seq.1)和IL-6R的結(jié)合蛋白具有反向方向(reverse orientation),包含SEQ ID NO:98的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:99的輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中所述多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e區(qū)不存在于結(jié)合蛋白中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中所述多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，(Χ2)η不存在于結(jié)合蛋白中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白包含第一和第二多肽鏈，其中所述第一多肽鏈包含第一個(gè)VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；且其中所述第二多肽鏈包含第二個(gè)VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白包含兩條第一多肽鏈和兩條第二多肽鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，(Χ2)η不存在于第二個(gè)多肽中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e區(qū)，如果存在于第一多肽中，是天然的序列Fe區(qū)或變體序列Fe區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e區(qū)是來自IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE或IgD的Fe區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白能夠結(jié)合兩種抗原且包含四條多肽鏈，其中，第一和第三多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第二和第四多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在。提供通過預(yù)選擇親本抗體制備結(jié)合蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備能夠結(jié)合兩個(gè)抗原的雙重可變結(jié) 構(gòu)域免疫球蛋白的方法包含步驟a)獲得能夠結(jié)合第一個(gè)抗原的第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分山)獲得能夠結(jié)合第二個(gè)抗原的第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分；c)構(gòu)建包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n的第一和第三多肽鏈，其中VDl是從所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在；d)構(gòu)建包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n的第二和第四多肽鏈，其中VDl是從所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；e)表達(dá)所述第一、第二、第三和第四多肽鏈；從而生成能夠結(jié)合所述第一個(gè)和所述第二個(gè)抗原的雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供生成具有所需特性的能夠結(jié)合兩個(gè)抗原的雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白的方法，包含步驟a)獲得第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分，其能夠結(jié)合第一個(gè)抗原且具有至少一種由雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白表現(xiàn)的所需特性；b)獲得第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分，其能夠結(jié)合第二個(gè)抗原且具有至少一種由雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白表現(xiàn)的所需特性；c)構(gòu)建包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n的第一和第三多肽鏈，其中VDl是從所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在；d)構(gòu)建包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n的第二和第四多肽鏈，其中VDl是從所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；e)表達(dá)所述第一、第二、第三和第四多肽鏈；從而生成具有所需特性的能夠結(jié)合所述第一個(gè)和所述第二個(gè)抗原的雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，在此公開的第一和第二多肽鏈的VDI是從相同親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在此公開的第一和第二多肽鏈的VDI是從不同親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在此公開的第一和第二多肽鏈的VD2是從相同親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在此公開的第一和第二多肽鏈的VD2是從不同親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分與第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分是相同抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分與第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分是不同抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第一個(gè)抗原，而第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第二個(gè)抗原。在具體實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)抗原是相同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，親本抗體結(jié)合相同抗原上的不同表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)抗原是不同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第一個(gè)抗原，其結(jié)合能力不同于第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第二個(gè)抗原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第一個(gè)抗原，其結(jié)合親和力不同于第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第二個(gè)抗原的親和力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分，和第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分，是人抗體，CDR接枝的抗體，或人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分是Fab片段，F(xiàn) (ab’)2片段，包含由鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段，由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段， 由抗體的單一臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，dAb片段，分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，單鏈抗體或雙抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白具有至少一種由第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分、或第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分表現(xiàn)的所需特性?？商娲?，第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分和第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分具有至少一種由雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白表現(xiàn)的所需特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所需特性是一種或多種抗體參數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體參數(shù)是抗原特異性、對(duì)抗原的親和力、能力、生物學(xué)功能、表位識(shí)別、穩(wěn)定性、可溶性、生產(chǎn)效率、免疫原性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、生物利用度、組織交叉反應(yīng)性、或者直向同源抗原結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白是多價(jià)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白是多特異性的。本文所述的多價(jià)和或多特異性結(jié)合蛋白具有特別從治療觀點(diǎn)來看需要的特性。例如，多價(jià)和或多特異性結(jié)合蛋白可以(I)經(jīng)由細(xì)胞比二價(jià)抗體更快速內(nèi)在化(和/或發(fā)生分解代謝)，所述細(xì)胞表達(dá)抗體與之結(jié)合的抗原；(2)是激動(dòng)劑抗體；和/或(3)誘導(dǎo)表達(dá)多價(jià)抗體能夠與之結(jié)合的抗原的細(xì)胞的細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞凋亡。提供多價(jià)和或多特異性結(jié)合蛋白的至少一種抗原結(jié)合特異性的“親本抗體”可以是，經(jīng)由表達(dá)抗體與之結(jié)合的抗原的細(xì)胞內(nèi)在化(和/或發(fā)生分解代謝)的抗體；和/或可以是激動(dòng)劑、細(xì)胞死亡誘導(dǎo)、和/或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)性抗體，且如本文所述的多價(jià)和或多特異性結(jié)合蛋白可以展示這些特性中的一種或多種中的改善。此外，親本抗體可以缺乏這些特性中的任何一種或多種，但如本文所述構(gòu)建為多價(jià)結(jié)合蛋白時(shí)可以賦予這些特性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如通過表面等離振子共振測(cè)量的，結(jié)合蛋白對(duì)于一種或多種革El具有如下結(jié)合速率常數(shù)(Kon):至少約IO2IVrV1;至少約IO^TV1;至少約IO4IVrV1;至少約IO5MH或至少約IO6IT1S'在一個(gè)實(shí)施方案中，如通過表面等離振子共振測(cè)量的，結(jié)合蛋白對(duì)于一種或多種靶具有如下結(jié)合速率常數(shù)(Kon) =IO2M-1S-1 -1O3M-1S-1;IO3M-1S-1 — IO4MW IO4M-1S-1 — IO5MW 或 IO5M-1S-1 — IO6IT1S'在另一個(gè)實(shí)施方案中，如通過表面等離振子共振測(cè)量的，結(jié)合蛋白對(duì)于一種或多種靶具有如下解離速率(off rate)常數(shù)(Koff):至多約ΙΟ、—1 ;至多約ΙΟΛ-1 ;至多約ΙΟ ;和至多約ΙΟ 。在一個(gè)實(shí)施方案中，如通過表面等離振子共振測(cè)量的，結(jié)合蛋白對(duì)于一種或多種靶具有如下解離速率常數(shù)(Koff)為ΙΟ - KT4iT1 ; KT4iT1 - ΙΟ ;或10 - l(T6s' 在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白對(duì)于一種或多種靶具有如下解離常數(shù)(Kd):至多約1(T7 M ;至多約1(T8 M ;至多約1(T9 M ;至多約10, M ;至多約l(Tn M ;至多約1(T12 M ;和至多10_13M。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白對(duì)于其靶的解離常數(shù)(Kd)具有如下:10_7 Μ — 10_8M ;1(T8 M — 1(Γ9 M ;1(Γ9 M — 1(Γ10 M ;1(Γ10 — 1(Γη M ;1(Γη M — 1(Γ12 M ;或 KT12M — 1(Γ13 Μ。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的結(jié)合蛋白是進(jìn)一步包含試劑的綴合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑是免疫粘附分子、顯像劑、治療劑或細(xì)胞毒性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，顯像劑是放射性標(biāo)記、酶、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、磁性標(biāo)記或生物素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，放射性標(biāo)記是:3H、14C、35S、9°Y、99TC、mIn、1251、1311、177LU、166H0 或 153Sm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療劑或細(xì)胞毒性劑是:抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長因子、細(xì)胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環(huán)霉素、毒素或細(xì)胞凋亡劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的結(jié)合蛋白是結(jié)晶結(jié)合蛋白且作為晶體存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，晶體是無載體的藥學(xué)控釋晶體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)晶結(jié)合蛋白具有比所述結(jié)合蛋白的可溶性對(duì)應(yīng)物更長的體內(nèi)半衰期。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)晶結(jié)合蛋白保留生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的結(jié)合蛋白是糖基化的。例如，糖基化是人糖基化模式。還提供了分離的核酸，其編碼本文公開的結(jié)合蛋白中的任一種。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了包含本文公開的分離的核酸的載體，其中所述載體是pcDNA; pTT (Durocher等人，Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, N0.2) ; pTT3 (具有額外的多個(gè)克隆位點(diǎn)的 pTT; pEFBOS (Mizushima, S.和 Nagata, S.， (1990) Nucleic acids Research Vol18，N0.17) ; pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO; pEF6 TOPO;或 pBJ。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體是在美國專利申請(qǐng)系列號(hào)61/021，282中公開的載體。在另一個(gè)方面，宿主細(xì)胞用本文公開的載體轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)。在相關(guān)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，真核細(xì)胞是原生生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或者真菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于，CH0, COS ；NSO、SP2、PER.C6或真菌細(xì)胞例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);或昆蟲細(xì)胞例如 Sf9。在一個(gè)實(shí)施方案中，在單個(gè)重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)例如具有不同特異性的兩個(gè)或更多個(gè)。例如，已將抗體混合物的表達(dá)稱為Oligoclonics (Merus B.V.，荷蘭)美國專利號(hào) 7，262，028 ;7，429，486。提供了生產(chǎn)本文公開的結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括在足以生產(chǎn)結(jié)合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)同樣在本文公開的任何一種宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過這種方法生產(chǎn)的50 % — 75 %的結(jié)合蛋白是雙重特異性四價(jià)結(jié)合蛋白。在具體實(shí)施方案中，通過這種方法生產(chǎn)的75% — 90%的結(jié)合蛋白是雙重特異性四價(jià)結(jié)合蛋白。在具體實(shí)施方案中，生產(chǎn)的90% — 95%的結(jié)合蛋白是雙重特異性四價(jià)結(jié)合蛋白。一個(gè)實(shí)施方案提供了用于釋放結(jié)合蛋白的組合物，其中所述組合物包含制劑，所述制劑又包含如本文公開的結(jié)晶結(jié)合蛋白和成分，以及至少一種聚合載體。例如，聚合載體是:聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-輕基丁酸酯、聚己內(nèi)酯、聚二氧雜環(huán)己酮(poly (dioxanone))、聚乙二醇、聚(羥丙基)甲基丙烯酰胺、聚有機(jī)磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、馬來酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原、血纖蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多糖、或者摻合物及其共聚物。例如，成分可能是白蛋白、鹿糖、海藻糖、乳糖醇(Iactitol)、明膠、輕丙基-β -環(huán)糊精、甲氧基聚乙二醇或者聚乙二醇。另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于治療哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的本文公開的組合物的步驟。提供了包含如本文公開的結(jié)合蛋白和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥物組合物包含用于治療病癥的至少一種另外的治療劑。例如，另外的試劑可能是:治療劑，顯像劑，細(xì)胞毒性劑，血管生成抑制劑(包括但不限于抗VEGF抗體或VEGF-trap);激酶抑制劑(包括但不限于KDR和TIE-2抑制劑)；共刺激分子阻斷劑(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-1g、抗⑶20);粘附分子阻斷劑(包括但不限于抗LFA-1抗體、抗E/L選擇蛋 白抗體、小分子抑制劑)；抗細(xì)胞因子抗體或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF、和抗IL-6/細(xì)胞因子受體抗體)；氨甲蝶呤；環(huán)孢菌素；雷帕霉素；FK506 ;可檢測(cè)標(biāo)記或報(bào)道分子；TNF拮抗劑；抗風(fēng)濕劑；肌肉弛緩劑，麻醉藥，非類固醇消炎藥(NSAID)，止痛劑，麻醉劑，鎮(zhèn)靜劑，局部麻醉劑，神經(jīng)肌肉阻斷劑；抗微生物劑，抗牛皮癬齊U，皮質(zhì)類固醇，促蛋白合成類固醇，促紅細(xì)胞生成素，免疫，免疫球蛋白，免疫抑制劑，生長激素，激素替代藥物，放射性藥物，抗抑郁藥，抗精神病藥，刺激劑，哮喘藥物，β激動(dòng)劑，吸入類固醇，腎上腺素或類似物，細(xì)胞因子，或者細(xì)胞因子拮抗劑。提供了用于治療患有病癥的人受試者的方法，在所述病癥中能夠由本文公開的結(jié)合蛋白結(jié)合的一種或多種靶是有害的，所述方法包括給人受試者施用本文公開的結(jié)合蛋白，從而使得人受試者中的一種或多種靶的活性被抑制，并且多種癥狀之一減輕或達(dá)到治療。例如，病癥可能是關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、青少年慢性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病、全身性紅斑狼瘡、Crohn氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、變應(yīng)性疾病、牛皮癬、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、與器官移植相關(guān)的急性或慢性免疫性疾病、肉狀瘤病、動(dòng)脈粥樣硬化、彌散性血管內(nèi)凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、腎病綜合征、慢性疲乏綜合征、韋格納氏肉芽腫病、過敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、腎顯微血管炎、慢性活動(dòng)性肝炎、葡萄膜炎、膿毒性休克、中毒性休克綜合征、膿毒病綜合征、惡病質(zhì)、傳染病、寄生蟲病、獲得性免疫缺陷綜合征、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性腫瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散發(fā)性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏綜合征、成人(急性)呼吸窘迫綜合征、秀頭、斑秀(alopecia areata)、血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)病(arthopathy)、關(guān)節(jié)病、Reiter氏病、牛皮癬性關(guān)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎性關(guān)節(jié)病、腸病性滑膜炎、衣原體、耶爾森氏菌和沙門氏菌相關(guān)性關(guān)節(jié)病、脊椎關(guān)節(jié)病(spondyloarthopathy)、動(dòng)脈粥樣化疾病/動(dòng)脈硬化、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性大皰性疾病、尋常天皰瘡、落葉狀天皰瘡、類天皰瘡、線性IgA疾病、自身免疫性溶血性貧血、Coombs陽性溶血性貧血、獲得性惡性貧血、青少年性惡性貧血、肌痛腦炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮膚念珠菌病、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、原發(fā)性硬化性肝炎、隱原性自身免疫性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征、獲得性免疫缺陷相關(guān)病、乙型肝炎、丙型肝炎、常見的各種免疫缺陷(常見的可變低丙種球蛋白血癥)、擴(kuò)張型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、卵巢早衰、纖維化肺疾病、隱原性纖維化肺泡炎、炎癥后間質(zhì)性肺病、間質(zhì)性肺炎、結(jié)締組織病相關(guān)性間質(zhì)性肺病、混合型結(jié)締組織病相關(guān)性肺病、全身性硬皮病相關(guān)性間質(zhì)性肺病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性間質(zhì)性肺病、全身性紅斑狼瘡相關(guān)性肺病、皮肌炎/多肌炎 相關(guān)性肺病、SjSgren氏病相關(guān)性肺病、強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)性肺病、脈管炎性彌散性肺病、含鐵血黃素沉著病相關(guān)性肺病、藥物誘導(dǎo)的間質(zhì)性肺病、纖維化、放射性纖維化、閉塞性細(xì)支氣管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴細(xì)胞性浸潤性肺病、傳染后間質(zhì)性肺病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、I型自身免疫性肝炎(傳統(tǒng)自身免疫性或狼瘡樣肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自身免疫介導(dǎo)的低血糖、具有黑棘皮癥的B型胰島素耐受性、甲狀旁腺機(jī)能減退、與器官移植相關(guān)的急性免疫性疾病、與器官移植相關(guān)的慢性免疫性疾病、骨關(guān)節(jié)病、原發(fā)性硬化性膽管炎、I型牛皮癬、2型牛皮癬、特發(fā)性白細(xì)胞減少(Ieucopaenia)、自身免疫性嗜中性白細(xì)胞減少癥、腎臟病N0S、腎小球腎炎(glomerulonephritides)、腎顯微血管炎(vasulitis)、萊姆病、盤狀紅斑狼瘡、特發(fā)性男性不育癥或N0S、精子自身免疫性、多發(fā)性硬化(所有亞型)、交感性眼炎、結(jié)締組織病繼發(fā)的肺動(dòng)脈高壓、Goodpasture氏綜合征、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎的肺表現(xiàn)、急性風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sj0rgren氏綜合征、Takayasu氏病/動(dòng)脈炎、自身免疫性血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少癥、自身免疫性甲狀腺病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺腫性(goitrous)自身免疫性甲狀腺功能減退(Hashimoto氏病)、萎縮性自身免疫性甲狀腺功能減退、原發(fā)性粘液性水腫、晶狀體性(phacogenic)葡萄膜炎、原發(fā)性血管炎、白癜風(fēng)急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘導(dǎo)的肝損傷、膽汁郁積(choleosatatis)、特應(yīng)性肝病、藥物誘導(dǎo)的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、變態(tài)反應(yīng)和哮喘、B群鏈球菌(GBS)感染、精神障礙(例如，抑郁和精神分裂癥)、Th2型和Thl型介導(dǎo)的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌癥例如肺、乳腺、胃、膀胱、結(jié)腸、胰、卵巢、前列腺和直腸癌以及造血惡性腫瘤(白血病和淋巴瘤)、無β脂蛋白血癥(Abetalipoprotemia)、手足發(fā)甜、急性和慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性髓細(xì)胞樣白血病(AML)、急性或慢性細(xì)菌感染、急性胰腺炎、急性腎功能衰竭、腺癌、心房(aerial)異位搏動(dòng)、AIDS癡呆復(fù)征、酒精誘導(dǎo)的肝炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、過敏性接觸性皮炎、變應(yīng)性鼻炎、同種異體移植物排斥、Ct-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎縮性側(cè)索硬化、貧血、心絞痛、前角細(xì)胞(horn cell)變性、抗cd3治療、抗磷脂綜合征、抗受體超敏反應(yīng)、主動(dòng)脈和周圍性動(dòng)脈瘤(aneuryisms)、主動(dòng)脈夾層、高動(dòng)脈壓、動(dòng)脈硬化、動(dòng)靜脈瘺、共濟(jì)失調(diào)、心房纖維顫動(dòng)(持續(xù)性或陣發(fā)性)、心房撲動(dòng)、房室傳導(dǎo)阻滯、B細(xì)胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支傳導(dǎo)阻滯、Burkitt氏淋巴瘤、燒傷、心律失常、心臟震暈綜合征、心臟腫瘤、心肌病、心肺分流術(shù)炎癥應(yīng)答、軟骨移植排斥、小腦皮質(zhì)變性、小腦病癥、紊亂性或多源性房性心動(dòng)過速、化學(xué)療法相關(guān)病癥、慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理學(xué)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水楊酸鹽中毒、結(jié)腸直腸癌、充血性心力衰竭、結(jié)膜炎、接觸性皮炎、肺源性心臟病、冠狀動(dòng)脈疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培養(yǎng)物陰性膿毒病、囊性纖維化、細(xì)胞因子療法相關(guān)病癥、拳擊員癡呆(Dementia pugilistica)、脫髓鞘病、登革出血熱、皮炎、皮膚病學(xué)狀況、多尿癥(diabetes)、糖尿病、糖尿病性動(dòng)脈硬化性(ateriosclerotic)疾病、彌漫性Lewy小體病、擴(kuò)張性充血性心肌病、基底神經(jīng)節(jié)病癥、中年唐氏綜合征、由阻斷CNS多巴胺受體的藥物誘導(dǎo)的藥物誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)障礙、藥物敏感性、濕疹、腦脊髓炎、心內(nèi)膜炎、內(nèi)分泌病、會(huì)厭炎、EB病毒感染、紅斑性肢痛病、錐體外束和小腦病癥、家族性嗜血性(hematophagocytic)淋巴組織細(xì)胞增多癥、胎兒胸腺移植排斥、Friedreich氏共濟(jì)失調(diào)、功能性外周性動(dòng)脈病癥、真菌性膿毒病、氣性壞疽病、胃潰瘍、腎小球腎炎、任何器官或組織的移植物排斥、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽性膿毒病、由于細(xì)胞內(nèi)生物的肉芽腫、毛細(xì)胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲狀腺炎、枯草熱、心臟移植排斥、血色素沉著癥、血液透析、溶血性尿毒性綜合征/血栓溶解性血小板減少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常(arrythmias)、HIV感染/HIV神經(jīng)病、何杰金氏病、運(yùn)動(dòng)過度性運(yùn)動(dòng)障礙、超敏反應(yīng)、超敏感性肺炎、高血壓、運(yùn)動(dòng)機(jī)能減退性運(yùn)動(dòng)障礙、下丘腦-垂體-腎上腺軸評(píng)價(jià)、特發(fā)性Addison氏病、特發(fā)性肺纖維化、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、虛弱、嬰兒型脊髓性肌萎縮、主動(dòng)脈炎癥、流行性感冒a、電離輻射照射、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經(jīng)炎、缺血性再灌注損傷、缺血性中風(fēng)、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年脊髓性肌萎縮、卡波西氏肉瘤、腎移植排斥、軍團(tuán)桿菌、利什曼病、麻風(fēng)病、皮層脊髓系統(tǒng)損傷、脂肪水腫、肝移植排斥、淋巴水腫(Iymphederma)、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細(xì)胞增多癥、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血癥、代謝性/特發(fā)性疾病、偏頭痛、線粒體多系統(tǒng)病癥、混合型結(jié)締組織病、單克隆丙種球蛋白病、多發(fā)性骨髓瘤、多系統(tǒng)變性(MencelDejerine-Thomas Sh1-Drager和Machado-Joseph)、重癥肌無力、鳥胞內(nèi)分支桿菌、結(jié)核分支桿菌、骨髓異常增生綜合征、心肌梗死、心肌缺血性病癥、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎變病、神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)原性I肌萎縮、嗜中性粒細(xì)胞減少性發(fā)燒、非何杰金淋巴瘤、腹主動(dòng)脈及其分支閉塞、閉塞性動(dòng)脈病癥、okt3治療、睪丸炎/附睪炎(epidydimitis)、睪丸炎/輸精管切除術(shù)逆轉(zhuǎn)操作、器官巨大癥、骨質(zhì)疏松癥、胰移植排斥、胰癌、惡性腫瘤的腫瘤相關(guān)綜合征/高鈣血癥、甲狀旁腺移植排斥、盆腔炎癥性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性動(dòng)脈粥樣硬化(atherlosclerotic)疾病、外周血管病癥、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲性肺炎、肺炎、POEMS綜合征(多發(fā)性神經(jīng)病、器官巨大癥、內(nèi)分泌病、單克隆丙種球蛋白病、和皮膚變化綜合征)、灌注后綜合征、泵后綜合征、MI心切開術(shù)后綜合征、先兆子癇、進(jìn)行性 核上(supranucleo)麻痹、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、放射治療、Raynaud氏現(xiàn)象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常規(guī)狹窄QRS心動(dòng)過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小體型老年性癡呆、血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)病、中風(fēng)、鐮狀細(xì)胞貧血、皮膚同種異體移植物排斥、皮膚變化綜合征、小腸移植排斥、實(shí)體瘤、特殊心律失常(arrythmias)、脊髓性共濟(jì)失調(diào)、脊髓小腦變性、鏈球菌肌炎、小腦結(jié)構(gòu)損傷、亞急性硬化性全腦炎、暈厥、心血管系統(tǒng)梅毒、全身性過敏反應(yīng)(anaphalaxis)、全身炎癥反應(yīng)綜合征、全身發(fā)作性青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、T細(xì)胞或FAB ALL、毛細(xì)血管擴(kuò)張、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少癥、毒性、移植物、創(chuàng)傷/出血、III型超敏反應(yīng)、IV型超敏反應(yīng)、不穩(wěn)定心絞痛、尿毒癥、尿膿毒病、蕁麻疹、心臟瓣膜疾病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈血栓形成、心室纖維性顫動(dòng)、病毒和真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關(guān)性噬紅細(xì)胞(hemaphagocytic)綜合征、Wernicke-Korsakoff綜合征、Wilson氏病、或者任何器官或組織的異種移植排斥。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用組合物和方法治療或診斷的疾病包括但不限于:原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥，包括乳腺、結(jié)腸、直腸、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、膽囊和膽管、小腸、尿道(包括腎、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宮頸、子宮和卵巢，以及絨毛膜癌和妊娠性滋養(yǎng)層細(xì)胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睪丸和生殖細(xì)胞腫瘤)、內(nèi)分泌腺(包括甲狀腺、腎上腺和腦下垂體)和皮膚的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括從骨和軟組織產(chǎn)生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，腦、神經(jīng)、眼和腦膜的腫瘤(包括星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤(Schwannomas)和腦膜瘤)，從造血惡性腫瘤例如白血病和淋巴瘤(何杰金與非何杰金淋巴瘤)產(chǎn)生的實(shí)體瘤。DVD-1gs也可以治療一種或多種下列疾病:急性冠狀動(dòng)脈綜合征、急性特發(fā)性多神經(jīng)炎、急性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病、急性缺血、成人Still氏病、斑禿、過敏反應(yīng)、抗磷脂抗體綜合征、再生障礙性貧血、動(dòng)脈硬化、特應(yīng)性濕疹、特應(yīng)性皮炎、自身免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關(guān) 的自身免疫性病癥、自身免疫性腸病、自身免疫性聽力喪失、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性血小板減少癥(AITP)、自身免疫性卵巢早衰、瞼炎、支氣管擴(kuò)張、大皰性類天皰瘡、心血管病、災(zāi)變性抗磷脂綜合征、乳糜瀉、頸椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬、慢性缺血、疤痕性類天皰瘡、具有多發(fā)性硬化風(fēng)險(xiǎn)的臨床孤立綜合征(CIS)、結(jié)膜炎、兒童期發(fā)病性精神病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病、椎間盤突出、盤脫垂、藥物誘導(dǎo)的免疫性溶血性貧血、心內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位、眼內(nèi)炎、鞏膜外層炎、多形性紅斑、重型多形性紅斑、妊娠期類天皰瘡、Guillain-Barr6綜合征(GBS)、枯草熱、Hughes綜合征、特發(fā)性帕金森氏病、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)、免疫性溶血性貧血、內(nèi)含體肌炎、傳染性眼炎性疾病、炎性脫髓鞘疾病、炎性心臟病、炎性腎病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜結(jié)膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、網(wǎng)狀青斑、黃斑變性、惡性腫瘤、顯微鏡下多脈管炎、Morbus Bechterev、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病癥、粘膜類天皰瘡、多器官衰竭、重癥肌無力、脊髓異常增生綜合征、心肌炎、神經(jīng)根障礙、神經(jīng)病、非甲非乙型肝炎、視神經(jīng)炎、骨質(zhì)溶解、卵巢癌、少關(guān)節(jié)的JRA、周圍動(dòng)脈閉塞性疾病(PAOD)、周圍血管疾病(PVD)、外周動(dòng)脈疾病(PAD)、靜脈炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(或結(jié)節(jié)性動(dòng)脈外膜炎)、多軟骨炎、風(fēng)濕性多肌病、白發(fā)癥、多關(guān)節(jié)的JRA、多發(fā)性內(nèi)分泌缺陷綜合征、多肌炎、風(fēng)濕性多肌病(PMR)、泵后綜合征、原發(fā)性帕金森綜合征、前列腺和直腸癌以及造血惡性腫瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、單純紅細(xì)胞再生障礙、原發(fā)性腎上腺機(jī)能不足、復(fù)發(fā)型視神經(jīng)脊髓炎、再狹窄、風(fēng)濕性心臟病、SAPHO(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、繼發(fā)性淀粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經(jīng)痛、繼發(fā)性腎上腺機(jī)能不足、硅樹脂相關(guān)的結(jié)締組織病、Sneddon-ffiIkinson皮膚病、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、Stevens-Johnson綜合征(SJS)、全身性炎癥應(yīng)答綜合征、顳動(dòng)脈炎、弓形體視網(wǎng)膜炎、中毒性表皮壞死松解、橫貫性脊髓炎、TRAPS (腫瘤壞死因子受體、I型變態(tài)反應(yīng)、II型糖尿病、蕁麻疹、普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)、脈管炎、春季結(jié)膜炎、病毒性視網(wǎng)膜炎、Vogt-Koyanag1-Harada綜合征(VKH綜合征)、濕黃斑變性、傷口愈合、耶爾森氏鼠疫桿菌和沙門氏菌相關(guān)關(guān)節(jié)病。在一個(gè)實(shí)施方案中，將抗體或其抗原結(jié)合部分在單獨(dú)地或與放射治療和/或其他化療劑組合地使用時(shí)，用于治療癌癥或預(yù)防本文所述腫瘤的轉(zhuǎn)移。在另一個(gè)方面，提供了治療患有病癥的患者的方法，所述方法包括在如本文討論的第二種試劑施用之前、同時(shí)或之后，施用本文公開的任何一種結(jié)合蛋白的步驟。在具體實(shí)施方案中，第二種試劑是布地萘德，表皮生長因子，皮質(zhì)類固醇，環(huán)孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水楊酸鹽，6-巰基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制劑，美沙拉秦，奧沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化劑，血栓燒抑制劑，IL-1受體拮抗劑,抗IL-1 β mAbs,抗IL-6或IL-6受體mAbs,生長因子，彈性蛋白酶抑制劑，吡啶基-咪唑化合物，TNF.LT, IL-1、IL-2、IL_6、IL_7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-11、GM_CSF、FGF 和 PDGF 的抗體或激動(dòng)劑，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90 或其配體的抗體，氨甲蝶呤，環(huán)孢菌素，F(xiàn)K506，雷帕霉素，霉酚酸酯，來氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮質(zhì)類固醇，強(qiáng)的松龍，磷酸二酯酶抑制劑，腺苷激動(dòng)劑，抗凝劑，補(bǔ)體抑制劑，腎上腺素能藥，IRAK, NIK, IKK,p38，MAP激酶抑制劑，IL-1 β轉(zhuǎn)換酶抑制劑，TNF α轉(zhuǎn)換酶抑制劑，T細(xì)胞信號(hào)傳遞抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巰基嘌呤，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，可溶性細(xì)胞因子受體，可溶性p55 TNF受體，可溶性p75 TNF受體，sIL-lR1、sIL-lRI1、sIL_6R，抗炎細(xì)胞因子，IL-4、IL-10、IL-1U IL-13或者TGF0。在具體實(shí)施方案中，本文公開的藥物組合物經(jīng)由以下方式給患者施用:腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intrarticular)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視剛莫內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、大劑量(bolus)、陰道、直腸、口腔含化、舌下、鼻內(nèi)、或者經(jīng)皮施用。還提供了至少一種本發(fā)明的至少一種結(jié)合蛋白的抗獨(dú)特型抗體?？躬?dú)特型抗體包括包含分子的任何蛋白或肽，所述分子包含至少部分免疫球蛋白分子，例如但不限于，重或輕鏈的至少一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分，重鏈或輕鏈可變區(qū)，重鏈或輕鏈恒定區(qū)，框架區(qū)，或其可以摻入本文提供的結(jié)合蛋白內(nèi)的任何部分。附圖簡沭


圖1A是雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)-1g構(gòu)建體的示意圖示，且顯示了從2種親本抗體產(chǎn)生DVD-1g的策略；
圖1B是構(gòu)建體DVDl-1g、DVD2-1g，以及來自雜交瘤克隆2D13.E3 (抗-1L-1 α )和13F5.G5 (抗-1L-1 β )的2種嵌合單特異性抗體的示意圖示。

迸述提供了能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的多價(jià)和/或多特異性結(jié)合蛋白。雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白(DVD-1g)，和其藥物組合物，以及用于制備這種DVD-1g的核酸、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。還提供了在體外或體內(nèi)使用DVD-1g來檢測(cè)特定抗原的方法。除非本文另有定義，本文使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語的含義和范圍應(yīng)當(dāng)清晰，然而，在任何潛在不明確性的情況下，本文提供的定義優(yōu)先于任何字典或外來定義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。在本申請(qǐng)中，除非另有說明，“或”的使用意味著“和/或”。此外，術(shù)語“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同樣，除非另有具體說明，術(shù)語例如“元件”或“組分”涵蓋包含一個(gè)單位的元件和組分以及包含超過一個(gè)亞單位的元件和組分。一般地，連同本文描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)以及蛋白和核酸化學(xué)和雜交使用的命名法和其技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知和通常使用的那些。除非另有說明，本文提供的方法和技術(shù)一般根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知，且如各種一般和更具體的參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法來進(jìn)行，所述參考文獻(xiàn)在本說明書自始至終引用和討論。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)制造商的說明書、如本領(lǐng)域通常實(shí)現(xiàn)的或如本文所述來進(jìn)行。連同本文描述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)以及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)使用的命名法、以及其實(shí)驗(yàn)室程序和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知和通常使用的那些。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制、和遞送、以及患者治療。為了本發(fā)明可以更容易地理解，選擇的術(shù)語在下文定義。如本文使用的，術(shù)語“多肽”指氨基酸的任何聚合鏈。術(shù)語“肽”和“蛋白”可與術(shù)語多肽互換使用，且同樣指氨基酸的聚合鏈。術(shù)語“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽類似物。多肽可以是單體或聚合的。除非另外與上下文矛盾，此處使用“多肽”意在包含多肽和其片段及變體(包括變體的片段)。對(duì)于抗原多肽，多肽片段任選含有至少一個(gè)連續(xù)或非線性多肽表位。可以使用本領(lǐng)域普通方法確定至少一個(gè)表位片段的精確邊界。該片段包含至少約5個(gè)鄰接氨基酸，例如至少約10個(gè)鄰接氨基酸、至少約15個(gè)鄰接氨基酸、或至少約20個(gè)鄰接氨基酸。多肽變體如本文所述。術(shù)語“分離的蛋白”或“分離的多肽”是這樣的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或來源不與天然結(jié)合的組分結(jié)合，所述天然結(jié)合的組分在其天然狀態(tài)下與其伴隨；基本上不含來自相同物種的其他蛋白；由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)；或在自然界中不存在。因此，化學(xué)合成或在不同于其天然起源的細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽將是與其天然結(jié)合的組分“分離的”。還可以通過分離，使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白純化技術(shù)，使得蛋白基本上不含天然結(jié)合的組分。如本文使用的，術(shù)語“回收”指通過分離，例如使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白純化技術(shù)，使得化學(xué)種類例如多肽基本上不含天然結(jié)合的組分的過程。
如本文使用的，“生物學(xué)活性”指分子的任一項(xiàng)或多項(xiàng)固有生物學(xué)特性(無論是如體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的那樣天然存在的，還是通過重組方法提供或使成為可能的)。生物學(xué)特性包括但不限于結(jié)合受體；誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，和酶促活性。生物學(xué)活性也包括Ig分子的活性。如本文使用的，關(guān)于抗體、蛋白、或肽與第二種化學(xué)種類相互作用的術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異地結(jié)合”，意指相互作用取決于化學(xué)種類上特定結(jié)構(gòu)(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體識(shí)別且與特定蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合而不是一般地與蛋白結(jié)合。如果抗體對(duì)表位“A”特異，那么在包含標(biāo)記的“A”和抗體的反應(yīng)中，包含表位A的分子(或游離的，未標(biāo)記的A)的存在將減少與抗體結(jié)合的標(biāo)記的A的量。如本文使用的，術(shù)語“抗體”廣泛地指包含4條多肽鏈一 2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位結(jié)合特征的任何功能片段、突變體、變體或衍生。此種突變體、變體或衍生抗體形式是本領(lǐng)域已知的。其非限制性實(shí)施方案在下文討論。在全長抗體中，每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含I個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，用稱為框架區(qū)(FR)的較保守區(qū)域點(diǎn)綴。每個(gè)VH和VL由3個(gè)⑶Rs和4個(gè)FRs組成，以下列順序從氨基末端到羧基末端排列:FR1、⑶R1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、種類(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類。術(shù)語“Fe區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)域，它可以通過完整抗體的木瓜蛋白酶消化來產(chǎn)生。Fe區(qū)可以是天然序列Fe區(qū)或變體Fe區(qū)。免疫球蛋白的Fe區(qū)一般包含2個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域一 CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，且任選包含CH4結(jié)構(gòu)域。Fe部分中改變抗體效應(yīng)子功能的氨基酸殘基替換是本領(lǐng)域已知的(Winter等人，美國專利號(hào)5，648，260和5，624，821)?？贵w的Fe部分介導(dǎo)幾種重要的效應(yīng)子功能，例如細(xì)胞因子誘導(dǎo)、ADCC、吞噬作用、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)以及抗體和抗原-抗體復(fù)合物的半衰期/清除率。取決于治療目的，在一些情況下這些效應(yīng)子功能對(duì)于治療抗體是所需的，但在其他情況下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同種型，特別是IgGl和1863，經(jīng)由分別與？(:￥1^和補(bǔ)體Clq結(jié)合介導(dǎo)ADCC和⑶C。新生Fe受體(FcRn)是決定抗體循環(huán)半衰期的關(guān)鍵組分。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸殘基在抗體恒定區(qū)例如抗體Fe區(qū)中進(jìn)行替換，從而使得抗體的效應(yīng)子功能被改變。免疫球蛋白的2條相同重鏈的二聚化由CH3結(jié)構(gòu)域的二聚化來介導(dǎo)，且通過鉸鏈區(qū)內(nèi)的二硫鍵來穩(wěn)定(Huber等人，Nature ；264:415-20 ；Thies等人，1999 J Mol Biol ；293:67-79.)。鉸鏈區(qū)內(nèi)的半胱氨酸殘基突變以阻止重鏈-重鏈二硫鍵將使CH3結(jié)構(gòu)域的二聚化不穩(wěn)定。負(fù)責(zé)CH3 二聚化的殘基已得到鑒定(Dall’Acqua 1998Biochemistry 37:9266-73.)。因此,可能產(chǎn)生單價(jià)半_Ig。有趣的是，已在自然界中發(fā)現(xiàn)關(guān)于 IgG 和 IgA 亞類的這些單價(jià)半 Ig 分子(Seligman 1978 Ann Tmmunol 129:855-70;Biewenga 等人，1983 Clin Exp Tmmunol 51:395-400)。FcRn:Ig Fe 區(qū)的化學(xué)計(jì)量已測(cè)定為 2:1 (West 等人，2000 Biochemistry 39:9698-708)，且半 Fe 足以介導(dǎo) FcRn 結(jié)合(Kim 等人，1994 Eur J Immunol ；24 =542-548.)。破壞CH3結(jié)構(gòu)域二聚化的突變可能對(duì)其FcRn結(jié)合沒有更大的不利作用，因?yàn)閷?duì)于CH3 二聚化重要的殘基位于CH3 b折疊結(jié)構(gòu)的內(nèi)界面上，而負(fù)責(zé)FcRn結(jié)合的區(qū)域位于CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的外界面上。然而，由于其比常規(guī)抗體的那種更小的尺寸，半Ig分子可 以在組織穿透中具有某些優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸殘基在本文提供的結(jié)合蛋白的恒定區(qū)例如Fe區(qū)中進(jìn)行替換，從而使得重鏈的二聚化被破壞，從而產(chǎn)生半DVD Ig分子。IgG的抗炎癥活性取決于IgG Fe片段N-連接的聚糖的唾液酸化作用。已經(jīng)確定了對(duì)抗炎癥活性準(zhǔn)確的聚糖要求，這樣就可以生成合適的IgGl Fe片段，從而生成具有大大增強(qiáng)的能力的完全重組的唾液酸化IgGl Fe (Anthony, R.Μ.，等人(2008)Science 320:373-376)。如本文使用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡單地“抗體部分”)，指保留與抗原特異性結(jié)合的能力的一種或多種抗體片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段來進(jìn)行。此種抗體實(shí)施方案也可以是雙特異性、雙重特異性、或多特異性形式；與2種或更多不同抗原特異性結(jié)合。包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii) F (ab’)2片段，包含由鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(V) dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546, Winter 等人，PCT 公開 WO 90/05144 Al，通過引用并入本文)，它包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域；和(Vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開的基因編碼，但它們可以使用重組方法通過合成接頭來連接，所述合成接頭使得它們能夠作為單條蛋白鏈制備，在所述單條蛋白鏈中VL和VH區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱為單鏈 Fv (scFv);參見，例如，Bird 等人,(1988)Science2A2:423-426 ;和 Huston等人，(1988)/￥oc.Natl.Acad.Sc1.l/SA85:5879-5883)。此種單鏈抗體也預(yù)期包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。也包含其他形式的單鏈抗體例如雙抗體。雙抗體是二價(jià)、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用的接頭太短而不允許相同鏈上的2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的配對(duì)，從而促使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)且產(chǎn)生2個(gè)抗原結(jié)合部位(參見例如，Holliger, P.等人，(1993)/ ^.Natl.Acad.Sc1.USA9O:6444-6448 ；Poljak, R.J.等人，(1994)Structure2:1121-1123) 此種抗體結(jié)合部分是本令頁域已知的(Kontermann 和 Dubel eds.,Antibody Engineering(2001) Springer-Verlag.New York.第790頁(ISBN 3-540-41354-5)。此外，單鏈抗體還包括包含一對(duì)串聯(lián)Fv區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)的“線性抗體”，所述串聯(lián)Fv區(qū)段連同互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)域(Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995);和美國專利號(hào) 5，641，870)。術(shù)語“多價(jià)結(jié)合蛋白”在本說明書自始至終用于指包含2種或更多抗原結(jié)合部位的結(jié)合蛋白。在 一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)結(jié)合蛋白經(jīng)工程改造為具有3個(gè)或更多抗原結(jié)合部位，且一般不是天然存在的抗體。術(shù)語“多特異性結(jié)合蛋白”指能夠結(jié)合2種或更多相關(guān)或無關(guān)靶的結(jié)合蛋白。本文提供的雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)結(jié)合蛋白包含2個(gè)或更多抗原結(jié)合部位，且是四價(jià)或多價(jià)結(jié)合蛋白。DVDs可以是單特異性的，即能夠結(jié)合一種抗原，或多特異性的，即能夠結(jié)合2種或更多抗原。包含2條重鏈DVD多肽和2條輕鏈DVD多肽的DVD結(jié)合蛋白稱為DVD-1g。每一半DVD-1g包含重鏈DVD多肽，和輕鏈DVD多肽，和2個(gè)抗原結(jié)合部位。每個(gè)結(jié)合部位包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)抗原結(jié)合部位總共6個(gè)涉及抗原結(jié)合的⑶Rs。如本文使用的，術(shù)語“雙特異性抗體”指通過下述產(chǎn)生的全長抗體，四源雜交瘤技術(shù)(參見 Milstein, C.和 A.C.Cuello, Nature, 1983.305 (5934):第 537-40 頁)，2 種不同單克隆抗體的化學(xué)綴合(參見Staerz, U.D.等人，Nature, 1985.314(6012):第628-31頁),或結(jié)進(jìn)孔或在Fe區(qū)中引入突變的類似方法(參見Holliger, P., T.Prospero和G.Winter, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993.90(14):第 6444-8.18 頁)，從而導(dǎo)致其中只有一種是功能性雙特異性抗體的多種不同免疫球蛋白種類。通過分子功能，雙特異性抗體結(jié)合其2個(gè)結(jié)合臂之一(I對(duì)HC/LC)上的一種抗原(或表位)，且結(jié)合其第二個(gè)臂(不同對(duì)的HC/LC)上的不同抗原(或表位)。通過這個(gè)定義，雙特異性抗體具有2個(gè)不同的抗原結(jié)合臂(在特異性和CDR序列中)，且對(duì)于其結(jié)合的每種抗原是單價(jià)的。如本文使用的，術(shù)語“雙重特異性抗體”指可以在其2個(gè)結(jié)合臂的每一個(gè)中(一對(duì)HC/LC)結(jié)合2種不同抗原(或表位)的全長抗體(參見PCT公開WO 02/02773)。因此，雙重特異性結(jié)合蛋白具有2個(gè)相同的抗原結(jié)合臂，具有相同的特異性和相同的CDR序列，且對(duì)于其結(jié)合的每種抗原是二價(jià)的。結(jié)合蛋白的“功能性抗原結(jié)合部位”是能夠結(jié)合靶抗原的結(jié)合部位?？乖Y(jié)合部位的抗原結(jié)合親和力不必與抗原結(jié)合部位由其衍生的親本抗體一樣強(qiáng)，但結(jié)合抗原的能力必須是可使用已知用于評(píng)估與抗原結(jié)合的抗體的多種方法中的任何一種測(cè)量的。此外，本文的多價(jià)抗體的每個(gè)抗原結(jié)合部位的抗原結(jié)合親和力無需在量上相同。術(shù)語“細(xì)胞因子”是由一種細(xì)胞群體釋放的蛋白的一般術(shù)語，所述蛋白作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一種細(xì)胞群體。此種細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子、和傳統(tǒng)的多肽激素。在細(xì)胞因子中包括的是生長激素例如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素、和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促卵胞激素(FSH)，促甲狀腺激素(TSH)，和黃體生成素(LH);肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子α和β ;米勒抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子例如NGF-α ;血小板生長因子；胎盤生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGFs)例如TGF-α和TGF-β ;胰島素樣生長因子-1和-11 ;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；干擾素例如干擾素-α、_β和-Y集落刺激因子(CSFs)例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF);和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白介素(ILs)例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL_5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10, IL-1U IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21、IL-22、IL-23、IL-33 ;腫瘤壞死因子例如TNF-a或TNF-β ;及其他多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。如本文使用的，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)的蛋白，以及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等價(jià)物。術(shù)語“接頭”用于指包含通過肽鍵連接的2個(gè)或更多氨基酸殘基的多肽，且用于連接一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合部分。此種接頭多肽是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，Holliger, P.等人，(1993)/￥0<^.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 ;Poljak, R.J.等人，(1994)Sirwcitfre2:1121-1123)。示例性接頭包括但不限于，AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO:1) !AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:2) ；AKTTPKLGG (SEQ ID NO:3) ；SAKTTPKLGG (SEQID NO:4) ； SAKTTP(SEQ ID NO:5) ； RADAAP(SEQ ID NO:6) ；RADAAPTVS(SEQ ID NO:7)；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:8) ；RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO:9) ；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQID NO:10) ；ADAAP(SEQ ID NO:11) ;ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO:12) ；TVAAP(SEQ ID NO:13)；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:14) ；QPKAAP(SEQ ID NO:15) ；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:16)；AKTTPP(SEQ ID NO:17) ；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO:18) ；akttap (SEQ ID NO: 19)；akttapsvyplap (SEQ ID NO: 20) ；ASTKGP(SEQ ID NO:21) !ASTKGPSVFPLAP (SEQ IDNO: 22)，GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) ; GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24);GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25) ;以及 GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26)。
免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域指重或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。人IgG重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的。如本文使用的，術(shù)語“單克隆抗體”或“mAb”指從基本上均質(zhì)抗體群體中獲得的抗體，即構(gòu)成群體的個(gè)別抗體是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突變。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一抗原。此外，與一般包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑形成對(duì)照，每種mAb針對(duì)抗原上的單一決定簇。修飾語“單克隆”不應(yīng)解釋為需要通過任何具體方法生產(chǎn)抗體。如本文使用的，術(shù)語“人抗體”預(yù)期包括具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。本文提供的人抗體可以包括例如在CDRs且特別是CDR3中，不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，在體外通過隨機(jī)或位點(diǎn)專一誘變或在體內(nèi)通過體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，如本文使用的，術(shù)語“人抗體”不預(yù)期包括其中來源于另一種哺乳動(dòng)物物種例如小鼠種系的CDR序列已接枝到人框架序列上的抗體。如本文使用的，術(shù)語“重組人抗體”預(yù)期包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體(在下文部分II C中進(jìn)一步描述)，從重組、組合人抗體文庫中分離的抗體(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.15:62-70 ；Azzazy H.和Highsmith ff.E.，(2002)C/i/ .Biochem.35:425-445 ；Gavilondo J.V.和 Larrick J.ff.{2QQ2)BioTechniques 29:128-145 ;Hoogenboom H.和Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378),從對(duì)于人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)中分離的抗體(參見Taylor,L.D.等人，(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295 ；KeIlermann S-A.矛口 Green L.L.{2QQ2)Current Opinion in Biotechnology13:593-597 ；Little M.等人，{2QQQ)Immunology Today 21:364-370)，或通過包括使人免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列剪接的任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。此種重組人抗體具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案中，對(duì)此種重組人抗體實(shí)施體外誘變(或，當(dāng)使用對(duì)于人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，且因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是，盡管來源于人種系VH和VL序列且與人種系VH和VL序列相關(guān)，但可能在體內(nèi)的人抗體種系譜內(nèi)非天然存在的序列?！坝H和力成熟的”抗體是在其一個(gè)或多個(gè)⑶Rs中具有一種或多種改變的抗體，與沒有這些改變的親本抗體相比較，所述改變導(dǎo)致抗體對(duì)抗原的親和力改善。示例性的親和力成熟的抗體將對(duì)靶抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗體通過本領(lǐng)域已知的程序來產(chǎn)生。等k，BidlTechnology 10:779-783 (1992)描述了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力成熟。CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變由下述描述:Barbas 等人，/7TOC Nat.Acad.Sci, USA 91:3809-3813 (1994) ;Schier 等人，Gene 169:147- 155(1995) ;Yelton 等人，J.1mmunol.155:1994-2004 (1995) Jackson 等人，J.1mmunol.154(7):3310-9(1995) ;Hawkins 等人，7； Mol.BioL 226:889-896(1992)以及如美國專利US6914128B1中所述的由活性增強(qiáng)氨基酸殘基在選擇性誘變位置、接觸或高變位置的選擇性突變。
術(shù)語“嵌合抗體”指包含來自一個(gè)物種的重和輕鏈可變區(qū)序列以及來自另一個(gè)物種的恒定區(qū)序列的抗體，例如具有與人恒定區(qū)連接的鼠重和輕鏈可變區(qū)的抗體。術(shù)語“⑶R接枝的抗體”指包含來自一個(gè)物種的重和輕鏈可變區(qū)序列的抗體，但其中VH和/或VL的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)域的序列用另一個(gè)物種的CDR序列替換，例如具有鼠重和輕鏈可變區(qū)的抗體，其中一個(gè)或多個(gè)鼠⑶Rs (例如，⑶R3)已用人⑶R序列替換。術(shù)語“人源化抗體”指包含來自非人物種(例如，小鼠)的重和輕鏈可變區(qū)序列的抗體，但其中至少部分VH和/或VL序列已改變成更“人樣”，即更類似于人種系可變序列。一種類型的人源化抗體是CDR接枝的抗體，其中將人CDR序列引入非人VH和VL序列以替換相應(yīng)的非人CDR序列。術(shù)語“人源化抗體”也是抗體或其變體、衍生物、類似物或片段，其與目的抗原免疫特異性結(jié)合，且包含基本上具有人抗體的氨基酸序列的框架(FR)區(qū)、和基本上具有非人抗體的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。如此處使用的，在CDR上下文中的術(shù)語“基本上”指具有的氨基酸序列至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %等同于非人抗體⑶R的氨基酸序列的⑶R。人源化抗體包含基本上所有至少一個(gè)、且一般為2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(Fab、Fab’、F (ab’)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR區(qū)對(duì)應(yīng)非人免疫球蛋白(即，供體抗體)的那些，且所有或基本上所有框架區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體也包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，一般為人免疫球蛋白的那種。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈以及至少重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?？?體還可以包括重鏈的CHl、鉸鏈、CH2、CH3、和CH4區(qū)。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體只包含人源化輕鏈。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體只包含人源化重鏈。在具體實(shí)施方案中，人源化抗體只包含輕鏈的人源化可變結(jié)構(gòu)域和/或人源化重鏈。術(shù)語“Kabat編號(hào)”、“Kabat定義”和“Kabat標(biāo)記”在本文中可互換使用。本領(lǐng)域眾所周知的這些術(shù)語指氨基酸殘基編號(hào)系統(tǒng)，所述氨基酸殘基比抗體或其抗原結(jié)合部分的重和輕鏈可變區(qū)中的其他氨基酸殘基更可變(即高變)(Kabat等人，(mi)Ann.NY Acad,Sc1.190:382-391 和 Kabat, Ε.Α.等人，(1991)5^^/(9/7( ^ of Proteins of IimunologicalInterest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH
發(fā)明者T.哈于爾, J.劉 申請(qǐng)人:Abbvie 公司