專利名稱：適應(yīng)于無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的mdck來源的細(xì)胞系與利用該細(xì)胞制備疫苗病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的MDCK來源的細(xì)胞系(MDCK-derived cell line),該MDCK來源的細(xì)胞系可以通過無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)且不需要依附于載體(carriers)而制得，制備所述MDCK來源的細(xì)胞系的方法，以及利用所述MDCK來源的細(xì)胞系制備疫苗病毒的方法。
背景技術(shù)：
通常利用受精卵、鼠腦、原代細(xì)胞以及已建立的細(xì)胞系作為疫苗制備的來源。然而，這種傳統(tǒng)的疫苗來源存在許多問題。例如，當(dāng)試圖將已受精的雞卵用于疫苗制備時，在飼養(yǎng)雞、管理依賴于疫苗生產(chǎn)計劃的受精卵以及提純來源于卵蛋白的成分方面存在阻礙。通常加入胎牛血清作為生長因子用于細(xì)胞培養(yǎng)。然而，血清容易受到朊病毒和病毒污染的影響并且血清的商品化產(chǎn)品可能存在質(zhì)量的差異。而且，來自于澳大利亞和新西蘭牛犢(calves)的高質(zhì)量的胎牛血清產(chǎn)品的定價高，致使生產(chǎn)成本增加。MDCK細(xì)胞系為已建立的細(xì)胞系，可以利用其增殖多種病毒。由于MDCK細(xì)胞系表現(xiàn)出較強的附著于其他表面的傾向，因此大規(guī)模培養(yǎng)依賴于大面積的培養(yǎng)器皿和載體，從而產(chǎn)生大量的費用。特別地，用于培養(yǎng)儀器或載體的投資費用是巨大的并且需要處理步驟來移除附著于載體上的細(xì)胞，從而構(gòu)成了細(xì)胞損失和細(xì)胞損傷的風(fēng)險。因此，需要一種可以通過無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)制備并且進而以經(jīng)濟和安全的方式適用于通過動物細(xì)胞培養(yǎng)物制備疫苗的細(xì)胞系。美國專 利N0.6，825，036公開了一種可以在沒有固體載體的無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)中生長的MDCK來源的細(xì)胞系。該美國專利采用了兩個方式使得細(xì)胞系適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)。根據(jù)第一個方式，通過直接在旋轉(zhuǎn)瓶(spinner flask)中懸浮培養(yǎng)來獲得MDCK來源的細(xì)胞。在這個情況下，細(xì)胞密度沒有達到1.0X IO6個細(xì)胞/毫升(工業(yè)規(guī)模制備所需的水平)。根據(jù)第二種方式，在作為載體的珠子的存在下培養(yǎng)原始MDCK細(xì)胞而獲得MDCK來源的細(xì)胞系，擴大了培養(yǎng)規(guī)模并且在沒有載體的存在下使培養(yǎng)的細(xì)胞生長。第二種方式存在培養(yǎng)過程相對復(fù)雜的缺陷。有許多報道稱原始MDCK細(xì)胞系是致瘤的(tumorigenic)。因此，將原始MDCK細(xì)胞系用于疫苗制備時，存在潛在的致瘤性的危險。在這些情況下，需要開發(fā)一種新的能夠通過無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)制備并且優(yōu)選具有極低致瘤性或無致瘤性的細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題設(shè)計本發(fā)明用于解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，因此本發(fā)明的目的是提供一種可以方便地通過無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)制備、與可以用于培養(yǎng)疫苗病毒的原始MDCK細(xì)胞系相比具有極低致瘤性或無致瘤性的MDCK來源的細(xì)胞系。本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用所述細(xì)胞系制備病毒特別是流感病毒的方法。
問題的解決方案相關(guān)申請的交叉引用根據(jù)35USC119(a)，本申請要求2010年9月6日提交的PCT專利申請N0.PCT/KR2010/006041以及2011年8月26日在韓國提交的韓國專利申請N0.10-2011-0085902的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用的方式并入本文中。 技術(shù)方案為了達到以上目的，本發(fā)明提供了一種特定的馬丁達比犬腎傳代細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney, MDCK)來源的細(xì)胞系，該MDCK來源的細(xì)胞系來源于保藏的編號為ATCC CCL-34的MDCK細(xì)胞，該MDCK來源的細(xì)胞系不需要用于細(xì)胞生長的血清并且可以通過懸浮培養(yǎng)制備而不需要依附于載體。本發(fā)明的MDCK來源的細(xì)胞系可以通過以下步驟制備:S1)用無血清培養(yǎng)基(serum-free medium)馴化原始MDCK細(xì)胞系，以制備適應(yīng)于無血清培養(yǎng)的細(xì)胞系；和S2)在不經(jīng)載體馴化的情況下，直接用懸浮培養(yǎng)馴化適用于無血清培養(yǎng)的細(xì)胞系，并篩選目的細(xì)胞系。更特別地，制備本發(fā)明所述的MDCK來源的細(xì)胞系的方法可以包括(a)準(zhǔn)備保藏的編號為ATCC CCL-34的原始MDCK細(xì)胞，(b)用化學(xué)成分確定的無血清培養(yǎng)基馴化所述原始MDCK細(xì)胞，以使原始MDCK細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長，以及(c)在不經(jīng)載體馴化的情況下，在化學(xué)成分確定的無血清培養(yǎng)基中誘導(dǎo)步驟(b)中馴化的附著的MDCK細(xì)胞直接適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)，以使MDCK細(xì)胞在沒有載體的懸浮狀態(tài)下生長。通過所述方法新建立的MDCK來源的細(xì)胞系可以通過無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)制備。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的MDCK來源的細(xì)胞系選自已于2011年I月27日保藏在德國布倫瑞克德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)的 MDCKSkyl023(DSM ACC3112)、MDCK Skyl0234(DSMACC3114)和 MDCKSky3851(DSM ACC3113)。本文中所使用的術(shù)語“無血清培養(yǎng)基”表示基本沒有添加血清并且可以通過培養(yǎng)制備本發(fā)明建立的細(xì)胞系的培養(yǎng)基。短語“基本沒有添加血清”表示血清以低于0.5體積％的量存在，優(yōu)選0.1體積％以下，更優(yōu)選0.01體積％以下，最為優(yōu)選的是完全不存在。美國專利N0.6，825，036采用兩種方式在無血清培養(yǎng)基中通過懸浮培養(yǎng)制備MDCK來源的細(xì)胞系。第一種方式嘗試在旋轉(zhuǎn)瓶中直接懸浮培養(yǎng)原始MDCK細(xì)胞系。在這種情況中，細(xì)胞密度沒有達到1.0X IO6個細(xì)胞/毫升(工業(yè)規(guī)模制備所需的水平。根據(jù)第二種方式，在存在載體的條件下培養(yǎng)原始MDCK細(xì)胞并且在不存在載體的條件下使培養(yǎng)的細(xì)胞生長而獲得MDCK來源的細(xì)胞系。相反的，本發(fā)明嘗試直接在旋轉(zhuǎn)瓶中不經(jīng)載體馴化地培養(yǎng)原始MDCK細(xì)胞，以制備可以通過懸浮培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中制備的新建立的細(xì)胞系。美國專利N0.6，825，036建立的細(xì)胞系B-702在一周內(nèi)達到了 1.0X IO6個細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度，而本發(fā)明建立的細(xì)胞系在大約3天內(nèi)達到了至少1.0X IO6個細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度，表現(xiàn)出更優(yōu)良的增殖潛力。一些報道指出目前已知的MDCK細(xì)胞系是致瘤的。相反的，與已知的MDCK細(xì)胞系相比較時，本發(fā)明所建立的細(xì)胞系具有極低致瘤性或無致瘤性。特別地，通過在裸鼠中利用細(xì)胞系、細(xì)胞裂解物和細(xì)胞DNAs測試，與已存在的MDCK細(xì)胞系相比，實施例中制備的新建立的MDCK來源的細(xì)胞系被證實具有極低致瘤性或無致瘤性。通過這些測試結(jié)果，可以總結(jié)的是，本發(fā)明的MDCK來源的細(xì)胞系用于疫苗制備是足夠穩(wěn)定的。更優(yōu)選地，本發(fā)明的MDCK來源的細(xì)胞系可以通過無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)制備。本發(fā)明也提供了利用所述MDCK來源的細(xì)胞系制備疫苗病毒的方法?？梢杂肕DCK來源的細(xì)胞系培養(yǎng)的病毒的例子包括流感病毒(influenza viruses)、麻疫病毒(measlesviruses)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis viruses)、腿腺炎病毒(mumpsviruses)、風(fēng)疫病毒(rubella viruses)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio viruses)、單純抱疫病毒-KHSV-1)、單純皰疹病毒-2(HSV-2)、狂犬病毒(rabies viruses)、呼吸道合胞病毒(RSviruses)、3 型呼吸道腸道病毒(reovirus type3)、黃熱病毒(yellow fever virus)、細(xì)小病毒(parvoviruses)、柯薩奇病毒(coxsackie viruses)^I 至 47 型腺病毒(adenovirus)、拉沙病毒(Lassa viruses)和痘苗病毒(vacciniaviruses)。本發(fā)明的MDCK來源的細(xì)胞系最適合用于流感病毒的制備。更特別地，本發(fā)明提供了一種從細(xì)胞培養(yǎng)物中制備流感病毒的方法，該方法包括:(a)將MDCK來源的細(xì)胞以大約I X IO4個細(xì)胞/毫升至I X IO6個細(xì)胞/毫升的濃度接種于無血清培養(yǎng)基中；(b)使MDCK來源的細(xì)胞在一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長，直至細(xì)胞密度至少達到約5X IO6個細(xì)胞/毫升,包括在保持選自由約40rpm至約IOOrpm的攪拌速率、約
6.5至約7.5的pH以及約35%至約100%的溶解氧(DO)濃度組成的的組中的一個或多個培養(yǎng)條件下培養(yǎng)MDCK來源的細(xì)胞；(c)用流感病毒感染培養(yǎng)的MDCK來源的細(xì)胞；(d)在使流感病毒繁殖的條件下培養(yǎng)已感染的培養(yǎng)的MDCK來源的細(xì)胞；和(e)從細(xì)胞培養(yǎng)混合物中分離流感病毒。優(yōu)選地，本發(fā)明的流感病毒制備方法進一步包括在步驟(b)中往細(xì)胞培養(yǎng)物中添加新鮮的培養(yǎng)基或用新鮮培養(yǎng)基替換部分培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了由病毒制備方法制得的病毒或病毒抗原。本發(fā)明也提供了包括病毒抗原的免疫原性藥物組合物。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的新的MDCK來源的細(xì)胞系可以通過無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)制備并具有極低致瘤性或無致瘤性的優(yōu)點。并且，本發(fā)明的新的MDCK來源的細(xì)胞系可以有效地用于病毒增殖。另外，本發(fā)明新的MDCK來源的細(xì)胞系適用于制備病毒，特別是流感病毒。
附圖簡介附圖與上述公開的內(nèi)容相結(jié)合介紹了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，用于提供對本發(fā)明技術(shù)思路的進一步理解。然而，本發(fā)明并不被理解為限制于附圖。

圖1表示MDCK來源的細(xì)胞系在旋轉(zhuǎn)瓶中懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞生長曲線；圖2為顯示典型的流感病毒純化過程的流程圖；和圖3表示利用在MDCK來源的細(xì)胞系中生長的病毒純化樣品的動物試驗中獲得的HI血清測試結(jié)果。
具體實施例方式
提供以下實施例以幫助進一步理解本發(fā)明。然而，這些實施例可以有許多其他形式，并且本發(fā)明的范圍并不被理解為限制于此。這些實施例僅用于為有本發(fā)明所屬領(lǐng)域常識的人提供對本發(fā)明更加全面的解釋。<實施例1>通過無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)制備MDCK來源的細(xì)胞系MDCK細(xì)胞系中的CCL-34，由ATCC提供。在T-25瓶中，在添加有10%血清的EMEM培養(yǎng)基中于37°C和5%C02下培養(yǎng)CCL-34。在細(xì)胞擴增后，將細(xì)胞在由EMEM培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基(50%)組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中確認(rèn)細(xì)胞的生長是否正常。當(dāng)確認(rèn)細(xì)胞生長正常時，將生長的細(xì)胞在含有無血清培養(yǎng)基(75%)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。重復(fù)該過程以獲得適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基(100%)的細(xì)胞系。EX-CELL MDCK (Sigma)、UltraMDCK (Lonza)以及VP-SFM (Invitrogen)可以作為無血清培養(yǎng)的培養(yǎng)基。在T形瓶(T-flask)中充分地擴增適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞系。而后，在旋轉(zhuǎn)瓶(Corning)中在37°C和5%C02下以40_80rpm的速率攪拌使擴增的細(xì)胞系適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基的PH下降或細(xì)胞生長高于預(yù)計的水平時，將培養(yǎng)基替換為新的培養(yǎng)基或?qū)⒓?xì)胞傳代(subculture)。在適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)3_6個月后，細(xì)胞濃度達到2X IO6個細(xì)胞/毫升以上。細(xì)胞活力為95%以上并且可以觀察到懸浮培養(yǎng)至單個細(xì)胞。EX-CELL302CH0 (Sigma)、UltraCHO (Lonza)以及SMIF-6 (Invitrogen)可以作為懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的結(jié)果是獲得了三種MDCK來源的細(xì)胞系，且稱為MDCK Skyl023、MDCK Skyl0234和 MDCK Sky3851。<實施例2>細(xì)胞系增殖潛力的評估在表I所示的條件下培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)制得的MDCK來源的細(xì)胞系。評估MDCK來源的細(xì)胞系的增殖潛力。MDCK細(xì)胞系(ATCCCCL-34)作為陰性對照培養(yǎng)于添加了10%血清的培養(yǎng)基中。表I[表 I][表]
權(quán)利要求
1.一種馬丁達比犬腎傳代細(xì)胞(MDCK)來源的細(xì)胞系，該MDCK來源的細(xì)胞系來源于保藏的編號為ATCC CCL-34的MDCK細(xì)胞，該MDCK來源的細(xì)胞系不需要用于細(xì)胞生長的血清并且通過懸浮培養(yǎng)制備而不需要依附于載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDCK來源的細(xì)胞系，其中，與原始MDCK細(xì)胞系相比，所述MDCK來源的細(xì)胞系具有低致瘤性或無致瘤性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDCK來源的細(xì)胞系，其中，所述MDCK來源的細(xì)胞系為MDCKSkyl023(DSM ACC3112)、MDCK Skyl0234(DSM ACC3114)或 MDCK Sky3851 (DSM ACC3113)。
4.一種利用權(quán)利要求1-3中任意一項所述的MDCK來源的細(xì)胞系制備疫苗病毒的方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述病毒選自由流感病毒、麻疹病毒、日本腦炎病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹病毒-1、單純皰疹病毒_2、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、3型呼吸道腸道病毒、黃熱病毒、細(xì)小病毒、柯薩奇病毒、I至47型腺病毒、拉沙病毒和痘苗病毒所組成的組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述病毒為流感病毒。
7.一種從細(xì)胞培養(yǎng)物中制備流感病毒的方法，該方法包括: Ca)將根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的MDCK來源的細(xì)胞以IX IO4個細(xì)胞/毫升至I X IO6個細(xì)胞/毫升的濃度接種于無血清培養(yǎng)基中； (b)使MDCK來源的細(xì)胞在一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長，直至細(xì)胞密度至少達到 5X IO6個細(xì)胞/毫升，包括在保持選自由40rpm至IOOrpm的攪拌速率、6.5至7.5的pH和35%至100%的溶解氧(DO)濃度所組成的組中的一個或多個培養(yǎng)條件下培養(yǎng)MDCK來源的細(xì)胞； (c)用流感病毒感染培養(yǎng)的MDCK來源的細(xì)胞； (d)在使流感病毒繁殖的條件下培養(yǎng)已感染的培養(yǎng)的MDCK來源的細(xì)胞；和 Ce)從細(xì)胞培養(yǎng)混合物中分離流感病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述方法進一步包括在步驟(b)中往細(xì)胞培養(yǎng)物中添加新鮮的培養(yǎng)基或用新鮮培養(yǎng)基替換部分培養(yǎng)基。
9.權(quán)利要求7或8所述的方法制得的病毒或病毒抗原。
10.一種制備MDCK來源的細(xì)胞系的方法，所述MDCK來源的細(xì)胞系不需要用于細(xì)胞生長的血清并且通過懸浮培養(yǎng)制備而不需要依附于載體，該方法包括: Ca)準(zhǔn)備保藏的編號為ATCC CCL-34的原始MDCK細(xì)胞； (b)用無血清培養(yǎng)基馴化所述原始MDCK細(xì)胞，以使所述原始MDCK細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長；和 (c)用無血清培養(yǎng)基馴化步驟(b)中馴化的附著的MDCK細(xì)胞，以使MDCK細(xì)胞在不需要載體的懸浮狀態(tài)下生長。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種馬丁達比犬腎傳代細(xì)胞(MDCK)來源的細(xì)胞系。該MDCK來源的細(xì)胞系來源于保藏的編號為ATCC CCL-34的MDCK細(xì)胞。所述MDCK來源的細(xì)胞系可以通過無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)制備。優(yōu)選地，所述MDCK來源的細(xì)胞系具有低致瘤性或無致瘤性。優(yōu)選所述MDCK來源的細(xì)胞系選自MDCK Sky1023、MDCK Sky10234和MDCK Sky3851。進一步公開的是培養(yǎng)所述MDCK來源的細(xì)胞的培養(yǎng)方法以及利用所述MDCK來源的細(xì)胞制備疫苗病毒的方法。
文檔編號C12N5/02GK103154238SQ201180042923
公開日2013年6月12日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者樸容郁, 李建世, 李峰鏞, 樸萬勛, 金勛, 金允熙, 李受陳 申請人:Sk化學(xué)公司