專利名稱：諾如病毒衍生的免疫原性組合物和方法
諾如病毒衍生的免疫原性組合物和方法本申請要求2010年7月6日提交的美國臨時申請61/361，581的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用納入本文以用于所有目的。諾如病毒(Norovirus)(先前稱為諾沃克類病毒、NVL或諾沃克病毒)是成人和兒童中急性病毒性胃腸炎的主要病因。諾如病毒有高度傳染性(infectious)，并且通過攝入污染食物例如牡蠣和水?dāng)U散。諾如病毒也在半封閉社區(qū)(如醫(yī)院、學(xué)校、療養(yǎng)院和大型游輪)中通過糞口途徑(fecal-oral route)人際傳播而快速蔓延。這些特性使諾如病毒成為主要的公眾健康問題。例如，僅在美國，諾如病毒造成大于95%病毒性胃腸炎的爆發(fā)，和估計的每年 2 千 3 百萬例胃腸炎(Fankhauser 等(2002) J.1nfect.Dis.186:1-7;MMWR Morb.Mortal Weekly Rep.(2000)49:207-211)。諾如病毒傳染(infectious)的癥狀包含腹瀉和嘔吐以及傷寒、頭疼、寒顫和胃疼。這種癥狀的原因可以與諾如病毒和小腸表皮細(xì)胞糖受體結(jié)合有關(guān)，所述結(jié)合造成了離子轉(zhuǎn)移中的不平衡(Marionneau 等(2002)Gastroenterologyl22:1967-1977;Hutson 等(2003)J.Virol.77:405-415).極易傳染的諾如病毒能用少至10個病毒顆粒傳染引起疾病。盡管其他方面健康，傳染諾如病毒的人可以在2-4天內(nèi)恢復(fù)，但其在癥狀開始后仍傳播病毒多至2周。約30-40%傳染的人可以保持無癥狀，但是通過向更容易傳染的其他人傳播病毒來擴(kuò)散傳染(Hutson 等(2004) Trends Microbiol.12(6):279-287)。諾如病毒是杯狀病毒(Caliciviridae)家族成員，所述杯狀病毒是小的、無包膜、二十四面體病毒，直徑27-40nm，包含單鏈正義RNA。系統(tǒng)發(fā)生研究顯示了諾如病毒屬由至少40種不同的毒株組成,根據(jù)序列相似性分成5個基因群(genogroup), G1-GV。這5個基因群中，GI和GII是對人類傳染最重要的基因群。每個基因群進(jìn)一步分成基因型。當(dāng)前GI包含8種不同的基因型，和GII有至少17種不同的基因型。在基因組水平，基因群中的毒株有51-56%核苷酸序列相同性,和基因型中的毒株有69-70%核苷酸序列相似性(Donaldson等，Nat.Rev.Microbiol.2010年2月2日[在線提前發(fā)表])。諾如病毒RNA包含了編碼所述病毒結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的三個開放閱讀框(ORF)。諾如病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是病毒蛋白I (VPl)。其完全由諾如病毒RNA的0RF2編碼，并且形成諾如病毒衣殼結(jié)構(gòu)。所述諾如病毒衣殼由180個拷貝的VPl單體組成。當(dāng)重組表達(dá)VPl時，其能自體組裝成缺乏病毒基因組的二十四面體衣殼結(jié)構(gòu)，并稱為病毒樣顆粒(VLP)。X射線晶體學(xué)研究揭示了各衣殼蛋白VPl由2個不同的結(jié)構(gòu)域組成:殼⑶結(jié)構(gòu)域和突出(protruding) (P)結(jié)構(gòu)域。這兩個結(jié)構(gòu)域通過短的柔性接頭或鉸鏈栓在一起。VPl單體的S結(jié)構(gòu)域共同形成諾如病毒VLP的核心，并且P結(jié)構(gòu)域在VLP表面輻射狀延伸，并且包含大量已知諾如病毒抗原表位部分。所述P結(jié)構(gòu)域(aa226-530,諾沃克株編號)分成兩個亞結(jié)構(gòu)域Pl和P2。所述P2結(jié)構(gòu)域呈輻射狀位于病毒顆粒(或VLP)的最外表面，并且認(rèn)為序列上高度可變。(參見例如Chen等，(2004) J.Virol.78:6469-6479)。所述P2結(jié)構(gòu)域是諾如病毒株中VPl最不保守的區(qū)域，并且 認(rèn)為在受體結(jié)合和免疫反應(yīng)中起重要作用。(Kitamoto等(2002)J.Cl in.Microbiol.40:2459-2465;Prasad 等(1999)Science286:287-290;Tan等(2003)J.Virol.77:12562-12571;White 等(1996)J.Virol.70:6589-6597;Vance 等(2005)J.General Virol.86:2799-2806)。結(jié)構(gòu)研究顯示了不同諾如病毒P2亞結(jié)構(gòu)域形狀和大小的多樣性，這與觀察到的P2亞結(jié)構(gòu)域序列可變性一致。Chen等(2004)J.Virology78(12):6469-6479。使用桿狀病毒傳染的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(Jiang等(1992)J.Virol.66:6527-6532)且隨后使用委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒載體傳染的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(Baric等(2002) J.Virol.76:3025-3030)第一次顯示了諾沃克病毒VLP的表達(dá)和自體組裝。當(dāng)在真核表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)時，諾沃克病毒中VPl單體和某些其他諾如病毒自體組裝成結(jié)構(gòu)上模仿天然諾如病毒顆粒的VLP。VLP保持了病毒蛋白衣殼的可靠構(gòu)型，但是缺乏諾如病毒遺傳材料。當(dāng)注射到動物中時，諾如病毒VLP能引起合適的宿主免疫反應(yīng)。盡管已經(jīng)知道了關(guān)于諾如病毒的抗原屬性，開發(fā)針對諾如病毒的有效疫苗緩慢并且有挑戰(zhàn)性。有數(shù)個原因造成開發(fā)有效針對廣泛諾如病毒株(包含從不同基因群和基因型中地域分離(field isolate))的諾如病毒疫苗是一個挑戰(zhàn)。一個原因是在不同的諾如病毒株中存在的復(fù)雜抗原多樣性?；蛐妥儺惸墚a(chǎn)生新的配體結(jié)合特性和抗原屬性(Donaldson等，Nat.Rev.Microbiol.2010年2月2日[在線提前發(fā)表])。第二個原因是優(yōu)勢(dominant)循環(huán)諾如病毒株的順序取代(Siebenga 等(2007) J.Virol81:9932-9941)。第三個原因是缺乏人諾如病毒的細(xì)胞培養(yǎng)模型，阻止了中和試驗(yàn)的發(fā)展。第四個原因是缺乏人諾如病毒的動物模型，限制了疫苗功效的臨床前測試并且妨礙了解諾如病毒病因和免疫的研究(Donaldson 等(2010) Nature Rev.Microbiol.8:231-241)。為了呈現(xiàn)優(yōu)勢免疫諾如病毒表位作為疫苗，先前制備了包含來自僅一種諾如病毒株的一種類型VPl蛋白的VLP (也稱為單價VLP)或來自兩種或更多種諾如病毒株的非嵌合VPl蛋白的混合物(也稱為多價VLP)。見例如W02009039229。單價VLP可能針對廣泛諾如病毒株的有效性小于多價VLP。當(dāng)前多價VLP可限制在來自不同株的VPl范圍中，所述不同株能由于株之間VPl-VPl相互作用表面的差異而共組裝。由于這些問題，上述疫苗系統(tǒng)都不適合針對由于病毒進(jìn)化而出現(xiàn)的新型諾如病毒的快速定制。諾如病毒經(jīng)歷了抗原類 型的累進(jìn)變化，用新的抗原變體代替更舊的抗原變體。因此，可能需要周期性改變諾如病毒疫苗的毒株組成，如現(xiàn)在對季節(jié)性流感疫苗所完成的。在不同的效率水平發(fā)生來自不同諾如病毒株VPl的VLP組裝，并且所得VLP有不同水平的產(chǎn)率和穩(wěn)定性。株之間的這種變化會妨礙諾如病毒疫苗組合物中所需株改變的速度、可靠性和便利性。因此，仍需要改善諾如病毒疫苗的開發(fā)方法，所述方法使具有來自任意所需諾如病毒株(包含新的地域(field)和/或臨床分離)的有效制備、穩(wěn)定和合適呈現(xiàn)的諾如病毒免疫原性材料的毒株組成快速改變。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分提供了包含諾如病毒抗原和材料的免疫原性組合物，以及能用于快速開發(fā)這種組合物的方法。本發(fā)明的諾如病毒抗原包含嵌合諾如病毒VPl蛋白，其中全部或部分P結(jié)構(gòu)域用來自不同諾如病毒株的全部或部分P結(jié)構(gòu)域取代。一方面，本發(fā)明涉及嵌合諾如病毒的病毒蛋白I (VPl)，所述病毒蛋白包含來自第一諾如病毒株VPl的S結(jié)構(gòu)域和至少一部分來自第二諾如病毒株VPl的P結(jié)構(gòu)域,和可選操作性連接所述S結(jié)構(gòu)域和P結(jié)構(gòu)域的接頭肽。當(dāng)存在時，所述接頭肽能是任意合適的接頭，例如來自第一諾如病毒株、來自第二諾如病毒株或來自第三諾如病毒株的VPl的接頭肽。所述嵌合VPl能有如式⑴所述的結(jié)構(gòu):A— S — L一P — B(I)。
在式(I)中，A和B各自缺失，或是任意所需的氨基酸序列；S是來自第一諾如病毒株VPl的S結(jié)構(gòu)域；L不存在或是接頭肽；并且P是諾如病毒VPl的P結(jié)構(gòu)域；其中至少一部分P結(jié)構(gòu)域來自第二諾如病毒株。在一些實(shí)施方式中，P是來自第二諾如病毒株的P結(jié)構(gòu)域。在其他實(shí)施方式中，P包含來自第一諾如病毒株的Pl亞結(jié)構(gòu)域或其部分，和來自第二諾如病毒株的P2亞結(jié)構(gòu)域。所述嵌合VPl蛋白能包含數(shù)個部分，如來自任意所需諾如病毒株如表I所列舉的諾如病毒株的S結(jié)構(gòu)域、P結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述S結(jié)構(gòu)域來自雪山(SnowMountain)株。在這些實(shí)施方式中,所述P結(jié)構(gòu)域或其部分(如P2亞結(jié)構(gòu)域)能來自任意其他諾如病毒株，如表I所列舉的那些。在特定實(shí)施方式中，所述S結(jié)構(gòu)域來自雪山株，和所述P結(jié)構(gòu)域或其部分(如P2亞結(jié)構(gòu)域)來自基因群GII的不同諾如病毒株、基因群GI的諾如病毒株或基因群GIV的諾如病毒株。在更特定的實(shí)施方式中，所述S結(jié)構(gòu)域來自雪山株，和所述P結(jié)構(gòu)域或其部分(如P2亞結(jié)構(gòu)域)來自諾沃克病毒、GI1.4.2006a或新奧爾良(New Orleans)病毒。在另一方面，本發(fā)明涉及包含本文所述嵌合VPl蛋白的諾如病毒病毒樣顆粒(VLP)。所述VLP能是單價或多價。所述多價VLP能包含如本文所述的兩種或更多種嵌合VPl蛋白。所述多價VLP能包含本文所述嵌合VPl蛋白和天然產(chǎn)生的諾如病毒VPl蛋白。本發(fā)明也涉及編碼本文所述嵌合諾如病毒VPl蛋白的重組核酸。所述重組核酸能是例如RNA或DNA，并且若需要能包含載體。在一些實(shí)施方式中，所述重組核酸是自體復(fù)制的，例如自體復(fù)制RNA。另一方面，本發(fā)明涉及包含本文所述嵌合諾如病毒VPl蛋白、本文所述VLP或其組合的免疫原性組合物。本發(fā)明也涉及包含編碼本文所述嵌合諾如病毒VPl蛋白的重組核酸的免疫原性組合物。另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼本文所述嵌合諾如病毒VPl蛋白的重組核酸的重組宿主細(xì)胞。例如所述宿主細(xì)胞能是昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、禽類細(xì)胞、細(xì)菌、酵母細(xì)胞、四膜蟲細(xì)胞和其組合。本發(fā)明也涉及生成嵌合諾如病毒VPl蛋白和/或VLP的方法，所述方法包含在表達(dá)所述重組核酸和生成嵌合VPl蛋白的條件下培養(yǎng)本文所述重組宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，在適于形成VLP的條件下維持所述重組宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包含從培養(yǎng)基和/或所述重組宿主細(xì)胞中分離所述嵌合諾如病毒VPl蛋白和/或VLP。附圖簡要說明

圖1描述適合亞克隆和擴(kuò)增本發(fā)明所述嵌合VPl寡核苷酸的載體PMADC5的圖。圖2描述適合在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)嵌合VPl蛋白和VLP的載體PBS24.1 的圖。圖3是來自三個不同諾如病毒株(諾沃克(norw)基因型Gl.1 (SEQ ID NO: 11)、雪山(雪(snow))基因型 GI1.2 (SEQ ID NO: 12)和 2006a(g2.4)GI1.4 (SEQ ID NO: 13) ) ^VPl蛋白的氨基酸比對。如所示，所述殼結(jié)構(gòu)域(S結(jié)構(gòu)域)是殘基1-221，所述接頭肽是殘基222-230，和所述突出結(jié)構(gòu)域(P結(jié)構(gòu)域)是殘基231-530。圖4A描述諾如病毒株雪山中0RF2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 14),所述核苷酸序列在所述株中編碼VPl蛋白。圖4B顯示了由雪山0RF2編碼的VPl蛋白的經(jīng)翻譯的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。圖5描述編碼嵌合VPl蛋白的核酸(SEQ ID NO: 15)，所述蛋白的S結(jié)構(gòu)域衍生自雪山株，和P結(jié)構(gòu)域衍生自諾沃克株。圖6描述編碼嵌合VPl蛋白的核酸(SEQ ID NO: 16)，所述蛋白的S結(jié)構(gòu)域衍生自雪山株，和P結(jié)構(gòu)域衍生自GI1.42006a株。圖7顯示了 24種本發(fā)明示例性嵌合VPl蛋白的初級結(jié)構(gòu)的示意圖。所述變體A、
S、L、Pl-1、P2、P1-2和B如本文所述。圖8A-8E顯示了數(shù)個諾如病毒株的VPl序列的多個氨基酸比對。見Hansman等
(2006)J.General Virology87:909-919。這些圖中指不了下列區(qū)域:N末端區(qū)(線)；S結(jié)構(gòu)域(填充框)，Ph亞結(jié)構(gòu)域(空心框)；P2亞結(jié)構(gòu)域(XXX) $-2亞結(jié)構(gòu)域(空心框)和C末端區(qū)(線)。星號表示保守氨基酸。所示序列來自下列諾如病毒株:#8(SEQID NO:17)(AB058547, GI/11 株);SeV(SEQ ID NO:18) (AB031013,GI/1 株);258 (SEQID NO:19)(AB078335, GI/2 株)；645(SEQ ID NO:20)(BD011871, GI/3 株)；CV(SEQ IDNO:21)(AB042808, GI/4 株)；WUG1(SEQ ID NO:22)(AB081723,GI/8 株)；HV(SEQ IDN0:23) (U07611,GII/1 株);485(SEQ ID NO:24)(DQ093065, GII/1 株);Ina(SEQ IDNO:25)(AB195225,GII/2 株);809(SEQ ID NO:26)(BD011876, GII/3 株);Sh5 (SEQ IDNO: 27) (AB195226, GII/3 株);18-3(SEQ ID NO: 28) (DQ093062, GII/3 株);336 (SEQID N0:29)(DQ093063，GII/3 株)；1152(SEQ ID NO:30)(DQ0930);104(SEQ ID N0:31)(AB078336, GI1/4 株);754 (SEQ ID NO:32)(BD011877, GII/5 株);7k(SEQ ID NO:33)(AB078337，GII/6 株)；445(SEQ ID NO:34)(DQ093064, GII/6 株)；10-25(SEQ ID NO:35)(9BD011881,GII/7 株);U25(SEQ ID NO:36)(AB039780, GII/8 株);026(SEQ ID NO:37)(AF504671，GII/10 株)；CHV(SEQ ID NO:38)(AB032758, GII/12 株)；47(SEQ ID NO:39)(AB078334, GII/14 株);Hiro(SEQ ID NO:40)(AB044366,GII/12 株);Alph23(SEQ IDN0:41)(DQ093067, GII/17 株)。圖9 是顯示由 Chakavarty 等(2005) J.Virology, 79 (I): 554-568 鑒定的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基來自區(qū)分不同的已知和提示抗原性諾如病毒株和種類的S和P結(jié)構(gòu)域。圖1OA是有深灰色S結(jié)構(gòu)域(內(nèi)部)和淺灰色P結(jié)構(gòu)域(外部)的諾沃克病毒樣顆粒的X射線結(jié)構(gòu)。圖1OB是圖1OA中彩色的單個單體的視圖。圖1lA是描述雪山VLP的純化蛋白的圖像。圖1lB是雪山VLP的電子顯微照片。圖12A是描述雪山/諾沃克VLP嵌合體的純化蛋白的圖像。圖12B是雪山/諾沃克嵌合VLP的電子顯微照片。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了生產(chǎn)和使用嵌合諾如病毒VPl蛋白的組合物和方法。本發(fā)明還提供了包含含有所述VPl蛋白 的諾如病毒VLP的免疫原性組合物，其中所述S結(jié)構(gòu)域獲自第一諾如病毒株和全部或部分所述P結(jié)構(gòu)域獲自第二諾如病毒株。本發(fā)明的其他方面包含核酸和多肽，以及制備和純化這種核酸和多肽的方法。下面更詳細(xì)描述了本發(fā)明的這些方面與本發(fā)明的VLP和其在免疫原性組合物中的應(yīng)用以及這種組合物在治療或預(yù)防諾如病毒中的使用方法。1.定義除非另外說明，本申請中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語的含義具有本領(lǐng)域通用的含義。本申請使用的下列單詞或短語有特定含義。如本文所用，“一個”、“一種”和“該”包括單數(shù)和復(fù)數(shù)指代形式，除非文中另有明確說明。因此，例如提及“一種多核苷酸”包括兩種或更多種多核苷酸的混合物等。與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語“約”表示，例如x+10%。本文使用的術(shù)語〃諾如病毒〃和〃諾沃克樣病毒〃指正義單鏈RNA包膜病毒的杯狀病毒家族的諾如病毒屬成員(Green等，Human Caliciviruses (人杯狀病毒)，F(xiàn)ieldsVirology(《費(fèi)氏病毒學(xué)》)，卷I，第841-874頁(Knipe和Howley,主編，第4版，利平科特威廉斯.威爾金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)2001))。術(shù)語諾如病毒包含所有病毒基因群中的毒株。當(dāng)前，諾如病毒株分成5個基因群(G1-GV)，再分成至少20個基因簇或基因型。特別地，術(shù)語諾如病毒包括但不限于:物種諾沃克病毒(NV)、Lordsdale病毒(LV)、墨西哥病毒(MV)、夏威夷病毒(HV)、雪山病毒(SMV)、沙漠風(fēng)暴病毒(DSV)和南安普頓病毒(SV)。大量諾如病毒分離物被部分或完全測序。見例如GenBank數(shù)據(jù)庫(ncb1.nlm.nih.gov)、國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)的分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(Taxonomy Database) (ncb1.nlm.nih.gov)或杯狀病毒的 pathosystems資源整合中心數(shù)據(jù)庫(PathoSystems Resource Integration Center Database) (patric.vb1.vt.edu)。術(shù)語諾如病毒也包含在提交時間沒有定性的分離物。術(shù)語〃多肽〃和〃蛋白〃指氨基酸殘基的聚合物，且不限于產(chǎn)物的最小長度。因此，該定義中包含肽、寡肽、二聚體、多聚體等。該定義包含全長蛋白和其片段。所述術(shù)語也包含多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。另外，出于本發(fā)明的目的，"多肽"指包含對天然序列修飾例如缺失、加入和取代(通常性質(zhì)上保守)的蛋白，只要所述蛋白維持了所需活性。這些修飾可以是有意的，例如通過定點(diǎn)誘變，或者可以是意外的，例如通過產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主突變或PCR擴(kuò)增所致的誤差?！ɑ炯兓ㄍǔＶ肝镔|(zhì)(化合物、多核苷酸、蛋白、多肽、多肽組合物)的分離，從而所述物質(zhì)包含大部分其駐留的樣品。通常樣品中，基本純化成分包含樣品的50%，優(yōu)選80%-85%，更優(yōu)選90-95%。純化感興趣的多核苷酸和多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域熟知，并且包含例如離子交換層析、親和層析和密度沉降。當(dāng)涉及多肽時，〃分離的〃指所示分子是從全生物體中分離和分開(discrete)，所述全生物體中天然發(fā)現(xiàn)所述分子或者所述分子在基本沒有相同類型的其他生物大分子情況下存在。對多核苷酸而言，術(shù)語〃分離的〃是全部或部分沒有其天然相關(guān)(associate)序列的核酸分子；或者如其天然存在的一種序列，但是有與之關(guān)聯(lián)的異源序列；或者從染色體解離的分子。

本文用于描述核酸分子的“重組”指基因組、cDNA、病毒、半合成或合成來源的多核苷酸，由于其來源或操作，所述多核苷酸與其天然相關(guān)(associate)的全部或部分多核苷酸不關(guān)聯(lián)。對蛋白或多肽而言，使用術(shù)語“重組”指由重組多核苷酸表達(dá)生成的多肽。通常，克隆感興趣基因并且然后在如下面進(jìn)一步所述的轉(zhuǎn)化生物體中表達(dá)。所述宿主生物體表達(dá)外源基因以生成表達(dá)條件下的蛋白。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將外源多核苷酸插入到宿主細(xì)胞，而不考慮使用插入的方法。例如，包含直接攝取、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或f匹配。所述外源多核苷酸可維持為非整合載體例如質(zhì)粒，或者可以整合到宿主基因組中?！爸亟M宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”、“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”和其他這種術(shù)語表示培養(yǎng)的微生物或高等真核細(xì)胞系，因?yàn)閱渭?xì)胞實(shí)體指能用作或者已經(jīng)用作重組載體或其他轉(zhuǎn)移DNA的受體，并且包含已轉(zhuǎn)染原始細(xì)胞的初始后代?！熬幋a序列”或“編碼”選定多肽的·序列是置于合適調(diào)節(jié)序列(或“控制元件”)控制下時體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(DNA情況中)和翻譯(mRNA情況中)成多肽的核酸分子。編碼序列的邊界能由5’(氨基)末端起始密碼子和3’(羧基)末端翻譯終止密碼子確定。編碼序列能包括但不限于來自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，來自病毒或原核DNA或RNA的基因組DNA序列，和甚至合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列可以位于編碼序列的3’端。通?！翱刂圃卑ǖ幌抻谵D(zhuǎn)錄啟動子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止信號、聚腺苷酸化序列(位于翻譯終止密碼子的3')、翻譯起始優(yōu)化序列(位于編碼序列的5')和翻譯終止序列。術(shù)語“核酸”包括DNA和RNA，以及其類似物，如含有修飾主鏈的類似物(如硫代磷酸酯等)，及肽核酸(PNA)等。本發(fā)明包含與上述那些互補(bǔ)的序列的核酸(例如出于反義或探針目的)。術(shù)語“自體復(fù)制”指編碼聚合酶、包含能使聚合酶復(fù)制所述核酸分子的核苷酸序列元件、并且優(yōu)選也編碼所需多肽如嵌合諾如病毒VPl的核酸分子。所述自體復(fù)制核酸優(yōu)選是自體復(fù)制RNA分子。例如自體復(fù)制RNA分子能基于α病毒基因組，并且編碼能指導(dǎo)所述RNA分子復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白，包含足以使RNA分子復(fù)制的復(fù)制識別序列，還編碼所需靶標(biāo)多肽例如嵌合諾如病毒VPl。可選地，從自體復(fù)制RNA分子中刪除或省略一種或多種結(jié)構(gòu)病毒基因(如衣殼和/或包膜糖蛋白)。能用于生成自體復(fù)制RNA分子的合適α病毒包含辛德畢斯病毒、西門利克森林病毒、東部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等。(關(guān)于自體復(fù)制 RNA 分子，參見例如 EP1751289Bl;Ying 等(1999) Nat.Med.5 (7): 823-827; Racanelli 等
(2004)Immunity, 20(I):47-58)。〃操作性連接〃指配置所述組件以便行使其常見功能的元件排列。因此，當(dāng)存在合適的酶時，操作性連接到編碼序列的給定啟動子能影響編碼序列的表達(dá)。啟動子可不必與編碼序列毗連，只要其發(fā)揮指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的功能。因此，例如，間插非翻譯和尚未轉(zhuǎn)錄序列可啟動子序列和編碼序列之間出現(xiàn)，仍可認(rèn)為該啟動子序列“操作性連接”該編碼序列?！坝伞幋a”指編碼多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分包含至少3個氨基酸的氨基酸序列?！氨磉_(dá)盒”或“表達(dá)構(gòu)建物”指能指導(dǎo)感興趣序列或基因表達(dá)的組件。表達(dá)盒一般包括上述控制元件，例如操作性連接到感興趣序列或基因的啟動子(以指導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄)，并且通常還包括聚腺苷酸化序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本文所述的表達(dá)盒可以包含在質(zhì)粒構(gòu)建物中。除了表達(dá)盒的成分，所述質(zhì)粒構(gòu)建物可以包含一種或多種選擇標(biāo)記、使質(zhì)粒構(gòu)建物作為單鏈DNA存在的信號(如復(fù)制的M13起點(diǎn))、至少一個多克隆位點(diǎn)和復(fù)制的“哺乳動物”起點(diǎn)(如復(fù)制的SV40或腺病毒起點(diǎn))?！凹兓亩嗪塑账帷敝父信d趣多核苷酸或其片段，其基本沒有所述多核苷酸天然結(jié)合(associate)的蛋白，例如包含少于約50%、優(yōu)選少于約70%、和更優(yōu)選少于約至少90%的所述蛋白。純化感興趣多核苷酸的技術(shù)為本領(lǐng)域熟知，并且包含例如用離液劑破壞包含多核苷酸的細(xì)胞，和通過離子交換層析、親和層析和密度沉降分離多核苷酸和蛋白?！拜d體”能轉(zhuǎn)移核酸序列到靶細(xì)胞(如病毒載體、非病毒載體、特定運(yùn)載體和脂質(zhì)體)?！ㄝd體構(gòu)建物"、〃表達(dá)載體〃和〃基因轉(zhuǎn)移載體〃通常指能指導(dǎo)感興趣核酸表達(dá)并能將核酸序列轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的核酸構(gòu)建物。因此，該術(shù)語包括克隆和表達(dá)運(yùn)載體以及病毒載體。本文使用的術(shù)語“表位”通常指由T細(xì)胞受體和/或抗體識別的抗原上位點(diǎn)。其可以是衍生自蛋白抗原或是作為蛋白抗原一部分的短肽。所述表位的三維結(jié)構(gòu)對其功能可以重要或不重要。然而所述術(shù)語也意在包含有糖肽和糖表位的肽。單個抗原分子可以載有數(shù)個不同的表位。術(shù)語“表位”也包含刺激識別全生物體反應(yīng)的氨基酸或糖的修飾序列。如果選定表位是造成傳染性(infectious)疾病的傳染劑的表位,那么這是有利的。對于各種諾如病毒衣殼表位的描述，參見例如Hardy等，美國專利申請
發(fā)明者E·塞滕布里, A·梅迪納-塞爾比, D·科伊特, P·道米策 申請人:諾華有限公司