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基于在北美狗中循環(huán)的犬瘟熱病毒的免疫原性組合物、疫苗和診斷方法

文檔序號(hào):391972閱讀:805來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:基于在北美狗中循環(huán)的犬瘟熱病毒的免疫原性組合物、疫苗和診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明一般地涉及新鑒別出的犬瘟熱病毒(⑶V)的分離株(isolate)。具體地,本發(fā)明提供了改進(jìn)的CDV免疫原性組合物、疫苗和診斷方法,它們含有或考慮了這些新發(fā)現(xiàn)的分離株,并描述了基于基因構(gòu)成來(lái)選擇用于免疫原性組合物、疫苗和診斷方法中的廣譜分離株的系統(tǒng)方法。
背景技術(shù)
犬瘟熱病毒(CDV)是一種影響所有年齡的狗的單鏈RNA麻疹病毒。CDV會(huì)造成多系統(tǒng)感染,所述感染可能涉及眼、呼吸道、胃腸道、體被和神經(jīng)系統(tǒng),且通常是快速致命的。盡管該疾病對(duì)于狗而言是破壞性的問(wèn)題,其它物種也易感該病毒,例如,浣熊、狐貍、山狗、狼、 各種毛皮動(dòng)物和大型非馴養(yǎng)寵物,諸如獅子、豹、獵豹和老虎。在過(guò)去,已經(jīng)證實(shí)疫苗可以有效地減少CDV感染的發(fā)病率。但是,似乎存在CDV發(fā)病率的再現(xiàn),甚至在充分接種疫苗的動(dòng)物中。CDV的血凝素(H)蛋白是一種參與宿主細(xì)胞-病毒結(jié)合的病毒表面蛋白,該蛋白的突變會(huì)影響宿主細(xì)胞-病毒相互作用。認(rèn)為H蛋白是CDV的致病因子。H蛋白的氨基酸序列在CDV分離株中表現(xiàn)出顯著的(例如約10%)變化,該變化的系統(tǒng)發(fā)生分析用作將病毒分離株分成7個(gè)譜系的基礎(chǔ)美洲-1、美洲_2、北極樣、亞洲-1、亞洲-2、歐洲和歐洲野生 (wildlife) (McCarthy, A. J. , Μ. A. Shaw,禾口 S. J. Goodman. 2007. Proc. Biol. Sci. 274:3165-3174)??笻蛋白的抗體會(huì)提供抗感染保護(hù),因而可能是疫苗效能的基礎(chǔ)。但是, 抗體不一定在譜系之間交叉反應(yīng)。因此,基于特定分離株的疫苗可能為疫苗受體提供或不提供針對(duì)其它分離株感染的保護(hù)。在下述情況下,這是特別有問(wèn)題的1)諸如CDV等RNA 病毒表現(xiàn)出高突變率,和2、狗在國(guó)家之間的全球運(yùn)輸增加,這會(huì)促進(jìn)新譜系向以前不知道它們的領(lǐng)域中的引入。此外,對(duì)于用特定CDV分離株接種的狗而言,暴露于遺傳上遙遠(yuǎn)的 CDV可能導(dǎo)致輸入性CDV病毒停留在免疫特殊部位(例如腦、神經(jīng)節(jié)、脊髓、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、 自主神經(jīng)系統(tǒng)、鼻空腔(plenum)和膀胱上皮),允許遺傳上遙遠(yuǎn)的⑶V傳播和擴(kuò)散而不被檢測(cè)出,因?yàn)樯窠?jīng)學(xué)征狀可能被獸醫(yī)從業(yè)人員忽略,這是由于缺乏診斷測(cè)試靈敏度和神經(jīng)學(xué)患者長(zhǎng)期治療的費(fèi)用。不幸的是,目前在使用中的CDV疫苗在約60年來(lái)沒(méi)有更新(Woma等人, 2010. Phylogenetic analysis of the hemagglutinin gene of current wild-type canine distemper viruses from South Africa: Lineage Africa. Vet. Microbiol. doi:10. 1016/jvet-mic. 2009. 11. 013),且沒(méi)有與這些變化保持同步。這些過(guò)時(shí)的疫苗的使用,可能是最近的CDV感染暴發(fā)的原因,因?yàn)檫@些疫苗不可能提供針對(duì)新出現(xiàn)的CDV譜系的感染的保護(hù)。此外,PCR測(cè)序已經(jīng)揭示,在一種商業(yè)疫苗中使用的疫苗分離株被錯(cuò)誤鑒別 (Demeter 等人,2009 Controversial results of the genetic analysis of a canine distemper vaccine strain. Vet. Microbiol.在線公開(kāi)),這使確定如何最好地檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和預(yù)防CDV感染和傳播的問(wèn)題進(jìn)一步復(fù)雜化。顯然,需要調(diào)查CDV臨床病例的增加的流行病學(xué)研究,也需要開(kāi)發(fā)考慮了新出現(xiàn)的CDV分離株的新的免疫學(xué)和疫苗組合物和診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面,本發(fā)明提供了新鑒別出的犬瘟熱病毒(CDV)的分離株。因此,本發(fā)明另外提供了更新的免疫原性組合物和疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗組合物被設(shè)計(jì)為提供針對(duì)新出現(xiàn)的CDV形式的廣譜保護(hù)。另外,本發(fā)明提供了更新的檢測(cè)CDV感染的診斷方法和試劑盒。所述診斷方法和試劑盒會(huì)提供檢測(cè)該病毒的新進(jìn)化形式的能力。本發(fā)明的組合物和診斷方法和試劑盒至少部分地基于以前未知的CDV變體的發(fā)現(xiàn),并考慮了現(xiàn)有的疫苗制劑和診斷方法不能勝任的病毒突變形式的出現(xiàn)。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供了用于選擇抗原 (例如,病原性分離株或其一部分)的系統(tǒng)方法,所述抗原對(duì)應(yīng)著抗原的廣譜來(lái)源(例如病原體分離株或其一部分)的基因構(gòu)成,并用于這樣的組合物和診斷方法中。本發(fā)明另外提供了歐洲野生(EW)譜系的一種分離的犬瘟熱病毒(CDV),其包含 CDV 9041474B CDV-EW (ATCC保藏號(hào)PTA-10596)的特征。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了從⑶V株⑶V 9041474B⑶V-EW (ATCC保藏號(hào)PTA-10596)或其后代株已經(jīng)在其中繁殖的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出的CDV減毒株。在該類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中,可以通過(guò)噬斑法純化CDV減毒株。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物或疫苗,其包含含有⑶V 9041474B⑶V-EW (ATCC保藏號(hào)PTA-10596)的特征的分離的⑶V或其后代。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了美洲-2 (AM-2)譜系的一種分離的犬瘟熱病毒(CDV),其具有CDV 08021509 CDV-AM-2 (ATCC保藏號(hào)PTA-10597)的特征。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了從⑶V株⑶V 08021509⑶V_AM_2 (ATCC保藏號(hào)PTA-10597)或其后代株已經(jīng)在其中繁殖的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出的CDV減毒株。在該類型的一個(gè)具體實(shí)施方案中,可以通過(guò)噬斑法純化CDV減毒株。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物或疫苗,其包含具有CDV 08021509 CDV-AM-2 (ATCC保藏號(hào)PTA-10597)的特征的分離的⑶V或其后代。本發(fā)明也提供了在有此需要的對(duì)象中引起針對(duì)犬瘟熱病毒的免疫應(yīng)答的方法。 一種這樣的方法包括給所述對(duì)象施用免疫原性組合物或疫苗,其包含含有⑶ν 9041474B ⑶V-EW (ATCC保藏號(hào)PTA-10596)的特征的分離的⑶V或其后代。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,所述方法包括給所述對(duì)象施用免疫原性組合物或疫苗,其包含具有CDV 08021509 ⑶V-AM-2 (ATCC保藏號(hào)PTA-10597)的特征的分離的⑶V或其后代。本發(fā)明也提供了診斷試劑盒。一個(gè)這樣的實(shí)施方案包括寡核苷酸引物,其特異性地用于擴(kuò)增在SEQ ID N0: 42中所述的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述診斷試劑盒包含寡核苷酸引物,其特異性地用于擴(kuò)增在SEQ ID N0: 43中所述的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到,這樣的引物是基于要擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列(例如被靶向的序列)的核苷酸序列。在有些實(shí)施方案中,引物與靶序列的獨(dú)特序列同源或互補(bǔ)。本發(fā)明另外提供了本發(fā)明的重組的和/或分離的核酸分子。一種這樣的核酸編碼 SEQ ID NO: 44的氨基酸序列和/或其核酸互補(bǔ)體。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,所述核酸分子包含SEQ ID NO: 42的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)體。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,分離的核酸分子包含與SEQ ID NO: 42的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)體具有大于99. 5%同一性的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述重組的和/或分離的核酸分子編碼SEQ ID NO: 45的氨基酸序列和/或其核酸互補(bǔ)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述核酸分子包含SEQ ID NO: 43 的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)體。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,分離的核酸分子包含與SEQ ID N0: 43的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)體具有大于95%同一性的核苷酸序列。本發(fā)明另外提供了表達(dá)載體,其可以包含任一種本發(fā)明的分離的核酸分子。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,所述表達(dá)載體包含編碼SEQ ID N0: 44的氨基酸序列的分離的核酸分子和/或其互補(bǔ)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了表達(dá)載體,其包含編碼SEQ ID N0: 45的氨基酸序列的分離的核酸分子或其互補(bǔ)體。本發(fā)明另外提供了免疫原性組合物和疫苗,其可以包含任一種本發(fā)明的表達(dá)載體。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,所述免疫原性組合物或疫苗包含表達(dá)載體,該表達(dá)載體包含編碼SEQ ID N0: 44的氨基酸序列的分離的核酸分子和/或其互補(bǔ)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述免疫原性組合物或疫苗包含表達(dá)載體,該表達(dá)載體包含編碼SEQ ID N0: 43的氨基酸序列的分離的核酸分子和/或其互補(bǔ)體。本發(fā)明另外提供了本發(fā)明的所有分離的和/或重組的蛋白、多肽、肽、融合蛋白和嵌合蛋白。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,所述多肽包含SEQ ID N0: 44的氨基酸序列。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中,所述多肽由SEQ ID N0: 42的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了免疫原性組合物和疫苗,其包含編碼血凝素蛋白的⑶V病毒體。在有關(guān)的實(shí)施方案中,所述血凝素可以部分地由包含SEQ ID N0: 1-33 所述的核苷酸序列的核酸編碼。在其它有關(guān)的實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了通過(guò)給對(duì)象施用一種或多種這樣的免疫原性組合物或疫苗,在有此需要的對(duì)象中引起針對(duì)犬瘟熱病毒的免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明另外提供了選擇用于免疫原性組合物中的一種或多種病原體分離株的方法,其中所述分離株使用一種或多種最常用的密碼子來(lái)編碼選擇的目標(biāo)免疫原性的蛋白、 多肽或肽。一種這樣的方法包括下述步驟1)對(duì)于多種病原體分離株中的每種分離株,測(cè)定編碼所述選擇的目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列;2)對(duì)于在測(cè)定步驟中得到的核苷酸序列,得到所述目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽中一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基的密碼子選擇數(shù)據(jù),由此得到密碼子選擇頻率數(shù)據(jù);3)從所述密碼子選擇頻率數(shù)據(jù),鑒別出目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽中每一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基的最常用的密碼子;和4)從多種病原體分離株中,選擇使用一種或多種最常用的密碼子來(lái)編碼目標(biāo)蛋白、多肽或肽的一種或多種分離株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述病原體是犬瘟熱病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了選擇用于免疫原性組合物中的核酸(其可以來(lái)自病原體的分離株)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的方法。所述核酸使用一種或多種最常用的密碼子來(lái)編碼選擇的目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽。所述方法包括下述步驟1)(例如從多種病原體分離株中)測(cè)定編碼選擇的目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽的多個(gè)核苷酸序列;2)對(duì)于在測(cè)定步驟中得到的核苷酸序列,得到所述目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽中一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基的密碼子選擇數(shù)據(jù),由此得到密碼子選擇頻率數(shù)據(jù);3)從所述密碼子選擇頻率數(shù)據(jù),鑒別出目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽中每一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基的最常用的密碼子;和4)從多個(gè)核苷酸序列中,選擇使用一種或多種最常用的密碼子來(lái)編碼目標(biāo)蛋白、多肽或肽的核苷酸序列。


圖 1.分離株 07091030 (SEQ ID NO: 1,CDV 的 H 基因的核苷酸(nt) 438-1302)。 該分離株來(lái)自具有癲癇發(fā)作史、并表現(xiàn)出具有多個(gè)胞漿內(nèi)包含體的嗜中性粒細(xì)胞的狗。該 ⑶V分離株在表達(dá)犬信號(hào)傳遞淋巴細(xì)胞-活化分子的Vero細(xì)胞系(Vero + SLAM)中形成大的、多核的合胞體?;贖蛋白序列,這是歐洲野生譜系分離株。該CDV分離株可以特別地用作例如攻擊病毒。圖 2·分離株 O7O9IO3I (SEQ ID NO: 2,H 基因的核苷酸 440_1494)。圖 3·分離株 O7O9IO32 (SEQ ID NO: 3,H 基因的核苷酸 440-12 )。圖4.分離株07101508 (SEQ ID NO: 4,H基因的核苷酸427_13;35)。該分離株與歐洲野生(EW)遺傳譜系具有高同一性,但是來(lái)自具有Onderst印ort疫苗接種史的南加利福尼亞狗。該分離株在Vero+SLAM細(xì)胞中生成大合胞體。該分離株與來(lái)自小熊貓(lesser panda)和丹麥貂(Danish mink)的CDV具有高同一性,但是不與Ondersteport疫苗分離株密切相關(guān)。圖5.分離株07100609 (SEQ ID N0: 5,N基因的核苷酸833-1213)。編碼來(lái)自海洋哺乳動(dòng)物(海豹)的該CDV-樣病毒的基因的核衣殼序列與來(lái)自美國(guó)的犬分離株 164071 (EU716337)相匹配。圖 6.分離株 07110098 (SEQ ID N0: 6,H 基因的核苷酸 439-U86)。圖 7.分離株 07111080 (SEQ ID N0: 7,H 基因的核苷酸 630-1501)。圖 8·分離株 O8OlO939 (SEQ ID N0: 8,H 基因的核苷酸 44:3-1 3)。圖 9.分離株 08011277A (SEQ ID N0: 9,H 基因的核苷酸 423-1556)。圖 10.分離株 08011277B (SEQ ID N0: 10,H 基因的核苷酸 1530-410)。圖 11.分離株 08011277C (SEQ ID N0: 11,H 基因的核苷酸 433-1230)。圖12.分離株08011277D (SEQ ID N0: 12,核衣殼基因的核苷酸833-1578)。不能擴(kuò)增該分離株的H基因。擴(kuò)增的缺少指示在引物結(jié)合序列中的遺傳變異(并因此,缺少同源性)。核衣殼基因序列與CDV分離株的序列相匹配。圖 13.分離株 08011671 (SEQ ID N0: 13,H 基因的核苷酸 422-1589。圖 14.分離株 08021509 (SEQ ID N0: 14,H 基因的核苷酸 441-686)。圖 15.分離株 08030074 (SEQ ID N0: 15,H 基因的核苷酸 447-U82)。圖 16.分離株 08030776 (SEQ ID N0: 16,H 基因的核苷酸 422-1541)。圖 17.分離株 08030777 (SEQ ID N0: 17,H 基因的核苷酸 411-1537)。圖 18.分離株 08031346 (SEQ ID N0: 18,H 基因的核苷酸 436-1059)。圖 19.分離株 08040383 (SEQ ID N0: 19,H 基因的核苷酸 1486-620)。
圖 20.分離株 08050180A (SEQ ID NO: 20,H 基因的核苷酸 418-1552)。圖 21.分離株 08060351 (SEQ ID NO: 21,H 基因的核苷酸 412-1536)。圖 22·分離株 O8O6O352 (SEQ ID NO: 22,H 基因的核苷酸 408_1553)。圖 23.分離株 08080696 (SEQ ID NO: 23,H 基因的核苷酸 423-7 )。圖 24.分離株 O8O8OMl (SEQ ID NO: 24,H 基因的核苷酸 3S7-I522)。圖 25.分離株 08081112 (SEQ ID N0: 25,H 基因的核苷酸 411-1207)。圖 26.分離株 08120827 (SEQ ID N0: 26,H 基因的核苷酸 413-1535)。圖 27.分離株 08120857 (SEQ ID N0: 27,H 基因的核苷酸 724-1522)。圖 28·分離株 09011024 (SEQ ID NO: 28,H 基因的核苷酸 578_161;3)。圖 29.分離株 09020504-3 (SEQ ID N0: 29,H 基因的核苷酸 418-1549)。圖 30.分離株 0904U89 (SEQ ID N0: 30,H 基因的核苷酸 889-1646)。圖 31.分離株 09041303 (SEQ ID N0: 31,H 基因的核苷酸 394-1526)。圖32.分離株09041474A (SEQ ID NO: 32,H基因的核苷酸410-1539)。在田納西州的大庇護(hù)所(shelter)內(nèi)的充分接種疫苗的狗(用商業(yè)的Ondersteport CDV疫苗接種疫苗2次)發(fā)生了上呼吸道疾病、高熱、綠鼻涕、咳嗽和最終的神經(jīng)學(xué)征狀(例如顫搐)。55只狗中有約20只死亡,包括從它得到分離株09041474A和09041474B的4月齡的雌性狗(參見(jiàn)圖37)。圖 33·分離株 09040826 (SEQ ID NO: 33,H 基因的核苷酸 418_1δ46)。圖34A-F.顯示來(lái)自野外分離株的犬瘟熱病毒血凝素(H)密碼子序列的密碼子表,使用BioEdit程序,將所述序列與⑶V-H疫苗和參照株密碼子序列相比對(duì)。序列 Ondersteport = CDV疫苗序列;ΑΥ964110 =參照歐洲野生(Eff)株);AF112189 =參照美洲-2 (ΑΜ-2)株;ΑΥ962112 =參照北極(Ar)株。用陰影表示密碼子中的差異。圖35.顯示美國(guó)和GenBank參照序列中的許多最近的美國(guó)⑶V分離株的遺傳親緣關(guān)系的系統(tǒng)樹(shù)(標(biāo)有下劃線)。使用MEGA4. 1程序(可以在位于megasoftware. net 的網(wǎng)站免費(fèi)得到;Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4. 0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599),構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。圖36.顯示來(lái)自⑶V感染的狗(0ADDL: 07091030)的⑶V的紅細(xì)胞包涵體的血膜。 在嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)可以看到CDV包涵體(箭頭)。(水性Romanowsky染色;條 =10微米)。圖37.來(lái)自09041474B的H基因的完整序列(SEQ ID N0: 42),包括終止密碼子。圖38.來(lái)自08021509的H基因的完整序列(SEQ ID N0: 43),包括終止密碼子。圖39.來(lái)自09041474B的H基因的完整氨基酸序列(SEQ ID N0: 44)。圖40.來(lái)自08021509的H基因的完整氨基酸序列(SEQ ID N0: 45)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了引起針對(duì)CDV的免疫原性應(yīng)答的組合物、設(shè)計(jì)為提供針對(duì)CDV感染的保護(hù)的疫苗組合物、和CDV診斷方法。所述組合物含有新發(fā)現(xiàn)的CDV變體。所述新變體會(huì)反映CDV的進(jìn)化趨勢(shì),并提供目前在美國(guó)循環(huán)的主要CDV菌株的指示。所述變體部分地分離自以前已經(jīng)針對(duì)CDV接種疫苗的狗,但是所述狗仍然感染了 CDV并患病,即所述狗是疫苗接種失敗的受害者。為了終止或縮短CDV的傳播,并防止疫苗接種失敗,應(yīng)當(dāng)將這些新變體中的一種或多種摻入新的疫苗方案中。本發(fā)明也提供了新診斷方法,其用于檢測(cè)新的 CDV分離株以及用于區(qū)分由疫苗施用造成的犬瘟熱和由新出現(xiàn)的病毒(其未包含在疫苗中, 且疫苗不能提供針對(duì)它的保護(hù))造成的犬瘟熱。另外,本發(fā)明提供了分析RNA病毒野外分離株和新出現(xiàn)的病原體的方法,以便確定哪種分離株可能用于包含在廣譜免疫原性的和疫苗組合物中。幾種新的分離株屬于歐洲野生CDV譜系;其它屬于美洲-2 (AM-2)和北極遺傳譜系。已經(jīng)分離了 34種⑶V病毒,在細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖,并已經(jīng)對(duì)病毒的H基因進(jìn)行部分地或完全地測(cè)序。這些病毒來(lái)自美國(guó)的不同州(例如俄克拉荷馬州、佛羅里達(dá)州、喬治亞州、 加利福尼亞州、密蘇里州、得克薩斯州、堪薩斯州和田納西州)。圖1-33顯示了與來(lái)自分離株的H基因互補(bǔ)的cDNA的部分序列;圖37和38分別顯示了分離株09041474B和08021509 的完整H基因序列,包括終止序列(二者都是TGA);且圖39和40分別顯示了來(lái)自分離株09041474B和08021509的H蛋白的對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。在所述氨基酸序列中,在來(lái)自 09041474B的序列的位置5處的氨基酸是谷氨酰胺,在來(lái)自08021509的序列的位置5處的氨基酸是精氨酸。本發(fā)明也提供了重組的和/或分離的核酸,其編碼任一種本發(fā)明的H-蛋白,但是它們不包含信號(hào)序列(在H蛋白的氨基端處的前12個(gè)氨基酸殘基)和/或終止密碼子,和 /或包含替代信號(hào)序列和/或替代終止密碼子。在本發(fā)明中也包括包含這樣的核酸的表達(dá)載體,以及由這些核酸編碼的表達(dá)的重組多肽(包括分離的重組多肽)。圖34A-F顯示了與⑶V-H疫苗序列和參照株相比對(duì)的來(lái)自幾種野外分離株的⑶V 血凝素(H)序列。該數(shù)據(jù)的分析用作開(kāi)發(fā)分析和選擇用于疫苗中的廣譜病原體分離株的相對(duì)優(yōu)選的密碼子選擇(RPCU)方法/概念的基礎(chǔ)。該方法是基于在本文中公開(kāi)的病原體中的新識(shí)別的RPCU模式。盡管該方法可以廣泛地適用于許多病原性生物體(下文詳細(xì)討論),本文描述了用于分析RNA病毒分離株的一種示例性應(yīng)用。本文使用的“分離株”(例如其可以是病原體,例如,RNA病毒)已經(jīng)從生物樣品基本上分離和純化,且可以已經(jīng)在合適的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行傳代和/或繁殖?;蛘?,所述分離株可以已經(jīng)從純的培養(yǎng)物(例如從 ATCC保藏物)得到。為了實(shí)現(xiàn)RPCU方法,從在一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)群體中得到的動(dòng)物對(duì)象(包括人)的生物樣品分離出代表性數(shù)目的目標(biāo)分離株。在特定目標(biāo)地理區(qū)域或地區(qū)內(nèi),和/或從疑似攜帶病原體的動(dòng)物對(duì)象,可以得到分離株。合適的生物樣品是在病原體感染的急性期內(nèi)收集的、含有最高濃度病毒的生物樣品,且包括不同的組織樣品、體液或排泄物(痰、唾液、血液、尿、糞便、拭子[為多類樣品的通用術(shù)語(yǔ)]等)。通過(guò)RPCU可以分析的合適的病原體 (例如新出現(xiàn)的病原體)的實(shí)例包括、但不限于各種病毒,諸如RNA病毒、單鏈DNA病毒、 流感病毒、HIV病毒等;各種細(xì)菌性病原體,諸如分枝桿菌屬、耶爾森菌屬、立克次體屬和巴爾通體屬物種;各種真菌;和各種原生動(dòng)物病原體,諸如瘧疾、錐蟲(chóng)屬、弓形蟲(chóng)屬、內(nèi)阿米巴屬、賈第蟲(chóng)屬和隱孢子蟲(chóng)屬物種等。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到,病原體分離株的“代表性數(shù)目”可以變化,但是通常是在至少20-25、通常至少30-35的范圍內(nèi),且可以無(wú)限制地是分離株(或序列)的任意數(shù)目,這取決于生物樣品的可用性、可進(jìn)行該目的的資源的可用性等。
“目標(biāo)群體”通常是易感目標(biāo)病原體的個(gè)體的群體,且可以包括當(dāng)被病毒感染時(shí)表現(xiàn)出疾病征狀的個(gè)體,或可以是幾乎不具有或不具有征狀、但是仍然被病原體感染的攜帶病毒的“載體”。目標(biāo)地理區(qū)域或地區(qū)可以是例如被地理和/或法律邊界限定的區(qū)域或地區(qū),例如,國(guó)家、洲、州、縣等;或被地理屏障隔開(kāi)的區(qū)域,諸如水體(河、湖、海等)、山脈、沙漠等; 或具有共同的氣候或氣象模式(例如類似的平均溫度或降水、有或沒(méi)有雪和冰等)的區(qū)域/ 地區(qū)。選擇所有分離株共有的至少一種目標(biāo)蛋白、多肽或肽,進(jìn)行詳細(xì)的基因序列分析。 通常,這樣的目標(biāo)蛋白、多肽或肽是已知具有免疫原性的?!懊庖咴缘摹笔侵?,當(dāng)所述蛋白、 多肽或肽存在于宿主中時(shí)(例如當(dāng)包含所述蛋白、多肽或肽的病原體感染宿主時(shí)),所述蛋白、多肽或肽在宿主中引起免疫應(yīng)答(例如抗體生產(chǎn))。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方法中的任一種,可以確定主要的免疫原,所述方法包括對(duì)來(lái)自康復(fù)患者的血清進(jìn)行蛋白印跡分析,所述康復(fù)患者已經(jīng)恢復(fù),并被保護(hù)免于病原體的進(jìn)一步感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到,使用RP⑶,可以分析一種或超過(guò)一種這樣的蛋白、多肽或肽,但是選擇至少一種。另夕卜,可以系統(tǒng)地選擇更多用于分析,但是基于例如蛋白印跡分析占優(yōu)勢(shì)的那種可以是良好的起點(diǎn)。通過(guò)MALDI-T0FF,可以對(duì)未知的免疫原性的蛋白測(cè)序。這有助于設(shè)計(jì)引物來(lái)擴(kuò)增序列。選擇合適的蛋白、多肽或肽以后,使用非常確定的技術(shù),例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)測(cè)序等,測(cè)定編碼所述蛋白、多肽或肽的核苷酸序列?;蛘?,使用該方法對(duì)比的序列可以從生物樣品直接得到而無(wú)需分離病毒,或者它們可以是從數(shù)據(jù)庫(kù)(例如GenBank或其它)得到的已知序列。然后對(duì)核苷酸序列進(jìn)行分析,以鑒別三聯(lián)密碼子和比對(duì)在正確的翻譯(閱讀)框中的密碼子。使用多種核苷酸分析程序中的任一種,可以進(jìn)行序列分析,包括但不限于使用BioEdit軟件的CLUSTAL W分析,由Baylor醫(yī)學(xué)院提供的多序列比對(duì)程序(MAP)等。通常,分析的序列是cDNA序列,盡管所述方法不限于使用cDNA,例如,也可以分析DNA、RNA等。 任選地,在分析中包括來(lái)自一個(gè)或多個(gè)參照序列(例如RNA病毒參照株)的對(duì)應(yīng)序列。通常,參照株會(huì)代表例如以前在研究的群體和/或區(qū)域中占優(yōu)勢(shì)(例如以高頻率存在)的病原體類型(例如病毒譜系)。這樣的參照株可以是例如已經(jīng)在針對(duì)RNA病毒感染的疫苗中使用的RNA病毒。參照序列的優(yōu)選候選物是,當(dāng)使用例如BLASTn和BLASTp程序分析時(shí),表現(xiàn)出與病原體(例如新出現(xiàn)的病原體)的核苷酸和蛋白序列的最高同源性和同一性水平的那些。同源性和/或同一性水平可以是至少約90%或95%或甚至至少約99%或更大。以可以容易地對(duì)比的形式(包括但不限于以表格形式,例如,在Excel表中),在框架內(nèi)比對(duì)指定來(lái)自分離株(和任選地,一個(gè)或多個(gè)參照序列)的氨基酸的三聯(lián)密碼子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知,三聯(lián)體密碼是眾多的,超過(guò)一個(gè)密碼子可以編碼相同的氨基酸。對(duì)于與目標(biāo)蛋白、多肽或肽中的氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的每個(gè)位置,指出編碼來(lái)自每個(gè)分離株的殘基的3個(gè)核苷酸的身份,并在所有分離株中進(jìn)行對(duì)比。例如,在假定的目標(biāo)蛋白中,如果位置 50是亮氨酸,該殘基的可能的密碼子包括tta和ttg。指出在所有分離株的位置50處的實(shí)際密碼子,并與在所有其它分離株中存在的密碼子相對(duì)比。從該對(duì)比,可以確定相對(duì)優(yōu)選的密碼子選擇(RP⑶)。例如,如果75%的分離株使用“tta”來(lái)編碼Leu殘基且25%的分離株使用“ttg”,則tta的RPCU值是75%,ttg的RPCU值是僅25%。因而,tta是在該殘基處優(yōu)選的(即最常出現(xiàn)的或使用的)密碼子。以此方式,確定對(duì)于目標(biāo)序列的每個(gè)目標(biāo)殘基而言最常使用的或優(yōu)選密碼子??梢葬槍?duì)序列的所有殘基,或僅針對(duì)殘基的子集(例如已知參與關(guān)鍵的病原體活性的殘基,或已知屬于表位或抗原區(qū)的一部分的殘基,或與毒力有關(guān)的殘基等),進(jìn)行該分析。RPCU方法的目標(biāo)是鑒別出用于廣譜疫苗制品中的分離株,所述分離株的核苷酸序列具有高百分比的優(yōu)選密碼子。這可以通過(guò)幾種方法中的任一種來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如,可以測(cè)定僅包含最優(yōu)選密碼子的理論的“理想”序列,并可以將分離株的實(shí)際序列與該理論序列相對(duì)比。計(jì)算每個(gè)分離株和理想序列之間的同源性水平。與理想序列表現(xiàn)出最高同源性水平 (例如量、百分比等)的分離株是使用最高數(shù)目的優(yōu)選密碼子的分離株。該分離株與理想物最好地“擬合”,并被選作疫苗組分?;蛘撸梢圆粶y(cè)定理想序列,但是如上所述制表或計(jì)算在每個(gè)位置的密碼子選擇,并通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法(例如通過(guò)簡(jiǎn)單的目檢),在序列之間進(jìn)行對(duì)比,以從分離株中鑒別出使用非常高水平或最高水平的優(yōu)選密碼子數(shù)目的序列。不受理論的約束,該選擇與下述理解相一致當(dāng)在編碼殘基的3-核苷酸序列中發(fā)生突變時(shí),只有當(dāng)含有該突變的病原體(例如RNA病毒)與不含有該突變的病原體相比具有某種選擇優(yōu)勢(shì)時(shí),該突變才可能永存或變得分布廣泛的(widespread)。例如,有些密碼子比其它密碼子更快速地或更高準(zhǔn)確度地翻譯,具有這樣的突變的病原體可能比非突變型病原體更成功地再生和感染新宿主。因此,由于自然選擇,這些密碼子最終以更高的頻率存在于病原體群體中。具有高百分比的常用密碼子的分離株可能具有與所述密碼子有關(guān)的累積優(yōu)點(diǎn),且可能表現(xiàn)出由所述密碼子賦予的有利特征,因而,當(dāng)包含在疫苗制品中時(shí),可能提供廣譜保護(hù)。RPCU考慮了與基因組核酸相互作用的病原體(諸如病毒)的內(nèi)部蛋白表位(Pepin KM, J Domsic,禾口 R McKenna. 2008. Genomic evolution in a virus under specific selection for host recognition. Infection, genetics, and evolution.: 825-834)。RP⑶會(huì)影響諸如⑶V等RNA病毒的生物學(xué)功能。密碼子(核苷酸的三聯(lián)體)是最基礎(chǔ)的生物學(xué)單位,因?yàn)樗鼈兙幋a氨基酸,所述氨基酸形成蛋白的功能單位,包括表位(例如約6-7個(gè)氨基酸)和抗原區(qū)或序列基序,它們直接地參與引起針對(duì)抗原蛋白(諸如CDV的 H蛋白)的宿主免疫應(yīng)答。因而,基于RPCU來(lái)選擇CDV分離株,會(huì)反映病毒的表型/功能, 諸如病毒的基因表達(dá)、H-蛋白表達(dá)和滴度。密碼子選擇也可以影響蛋白表達(dá)的寬度,并從而影響在其中表達(dá)病毒或蛋白的組織。在初步分析中,CDV的H蛋白表達(dá)的基于凝膠的PCR 分析證實(shí),與大多數(shù)EW分離株相比,大多數(shù)美洲-2分離株具有一致地更低的(低約8-10 倍)H-基因PCR產(chǎn)物表達(dá)。該結(jié)果可能反映了大多數(shù)EW CDV分離株中穩(wěn)健的且生物學(xué)上有利的H-基因密碼子組成,這導(dǎo)致犬群體中更高的EW CDV分離株頻率。在下面的實(shí)施例 4中,顯示了該方法適用于⑶V RNA病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到,可以開(kāi)發(fā)計(jì)算機(jī)執(zhí)行的軟件(電腦程序)來(lái)執(zhí)行RPCU 方法。這樣的軟件包括或編碼指令,所述指令造成計(jì)算機(jī)執(zhí)行RPCU方法,且可以包括,例如,用于輸入序列和其它有關(guān)數(shù)據(jù)(例如分離株的名稱、密碼子比對(duì)特征等)的裝置、用于顯示輸入的數(shù)據(jù)的裝置、用于表示分析結(jié)果的裝置(例如顯示在屏幕上,或以合適的形式輸出[“硬拷貝”]結(jié)果,例如作為序列、作為一種或多種數(shù)字指示器(諸如“序列#4”或 “#4”作為最好的結(jié)果),以圖形形式、表格形式等)。在計(jì)算機(jī)程序中也可以包含用于統(tǒng)計(jì)分析的工具,且所述分析可以提供結(jié)果的分級(jí),即該程序可以以從可能最合適的那些至最低可能的那些的方式排列候選序列,和/或可以簡(jiǎn)單地提供一個(gè)或多個(gè)最高排序(最合適的)序列。計(jì)算機(jī)程序可以包括指令,所述指令用于實(shí)現(xiàn)執(zhí)行分析所用的算法。RPFU方法因而是選擇和/或得到用于免疫原性組合物和疫苗中的病原體分離株的方法??梢赃x擇或以其它方式得到(例如,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的基因工程技術(shù)進(jìn)行修飾)這樣的分離株,其具有編碼目標(biāo)蛋白、多肽或肽(通常是免疫原)的優(yōu)選密碼子。RPFU方法可以包括下述步驟從來(lái)自被病原體感染的多個(gè)不同動(dòng)物的生物樣品, 得到多個(gè)病原體(例如RNA病毒)分離株;選擇與所述RNA病毒有關(guān)的目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽;針對(duì)多個(gè)分離株中的每個(gè)分離株,測(cè)定編碼目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列;在編碼目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽的每個(gè)核苷酸序列中,鑒別編碼目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽中的目標(biāo)氨基酸殘基的密碼子;通過(guò)對(duì)比編碼目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列,測(cè)定目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽中每個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基的密碼子選擇數(shù)據(jù)的頻率;從所述的密碼子選擇數(shù)據(jù)的頻率,鑒別出目標(biāo)免疫原性的蛋白、 多肽或肽中每個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基的最常用的密碼子;并從多個(gè)病原體分離株中,選擇使用一種或多種最常用的密碼子來(lái)編碼目標(biāo)蛋白、多肽或肽的分離株。在有些RNA病毒中,通過(guò) RPCU軟件,可以分析免疫原的擬-群體。圖35顯示了分離株的遺傳親緣關(guān)系的系統(tǒng)樹(shù),它基于H基因的序列。在該樹(shù)中, 非常密切相關(guān)的CDV分離株群體已經(jīng)出現(xiàn),即屬于歐洲野生譜系的“優(yōu)勢(shì)CDV群體”。通過(guò)用2個(gè)其它譜系(北極和美洲,即“次要CDV群體”)的其它次要的CDV病毒進(jìn)行挑戰(zhàn),可以檢查這些歐洲野生病毒。保護(hù)性地抗歐洲-野生以及北極和美洲-2譜系病毒中的一種或另一種(或兩種)的一種或多種廣泛反應(yīng)性的優(yōu)勢(shì)分離株可以用于制備CDV免疫原性組合物,用作對(duì)目前在美國(guó)或其它合適的地方循環(huán)的所有CDV譜系有效的疫苗。換而言之,所述免疫原性組合物應(yīng)當(dāng)引起針對(duì)歐洲野生譜系病毒和針對(duì)北極和美洲-2譜系病毒中的一種或兩種的免疫反應(yīng)(例如抗體生產(chǎn))。本發(fā)明的疫苗應(yīng)當(dāng)保護(hù)性地抗歐洲野生譜系病毒、 和抗北極和美洲-2譜系病毒中的一種或兩種。在這樣的免疫原性組合物或疫苗中使用的 CDV含有核酸序列,所述核酸序列編碼以前僅在歐洲野生病毒中發(fā)現(xiàn)且認(rèn)為是其特有的抗原(抗原區(qū)、抗原決定簇等),以及以前僅在北極或美洲譜系病毒(或優(yōu)選地,北極和美洲-2 譜系病毒)中發(fā)現(xiàn)且認(rèn)為是其特有的抗原。這樣的病毒的一個(gè)實(shí)例是分離株09041474B,其完整血凝素基因序列如SEQ ID NO: 42所述。使用幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇該CDV分離株作為疫苗候選物。首先,形成一組當(dāng)前的 ⑶V分離株(在歷史上,基于公開(kāi)的報(bào)道,僅可以得到幾個(gè)分離株。此外,研究⑶V疫苗接種失敗問(wèn)題的報(bào)道很少)。其次,進(jìn)行血凝素測(cè)序和⑶V基因分型。使用BALSTn、CLUSTAL-W 的全核苷酸分析和系統(tǒng)發(fā)生分析允許對(duì)譜系中的CDV分離株進(jìn)行聚簇和表征,并確定 09041474B屬于EW譜系。然后,根據(jù)上述的相對(duì)優(yōu)選的密碼子選擇(RP⑶)分析方法,使用密碼子選擇表(顯示在圖34A-F中)來(lái)選擇⑶V疫苗分離株09041474B。來(lái)自分離株09041474B的H基因序列(完整序列,圖37)在幾個(gè)方面不同于參照 EW序列(圖34A-F中的AY964110)。首先,使用組織樣品,得到AY964110的H基因的核苷酸序列,即未分離具有該序列的CDV病毒。相反,從已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)和繁殖的分離的 ⑶V,得到來(lái)自本文所述的09041474B的H基因序列。2個(gè)序列的密碼子選擇也不同。對(duì)于 09041474B,在位置187處的密碼子是CGA,在位置201處的密碼子是CTG,在位置236處的密碼子是CCT,在位置303處的密碼子是TCA。進(jìn)一步與AY964110相比較,在09041474B序列中,在位置303處的密碼子編碼絲氨酸,而不是亮氨酸(參見(jiàn)圖34A-F)。分離株09041474B 在細(xì)胞培養(yǎng)物中表現(xiàn)出穩(wěn)健生長(zhǎng),且在施用具有該序列的病毒體的對(duì)象中引起免疫應(yīng)答方面,在位置303處的絲氨酸可能賦予優(yōu)點(diǎn)。標(biāo)記為09041474B⑶V-EW的09041474B⑶V分離株的保藏物(完整的活病毒,在2-3的低傳代)被保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC), Manassas, VA,保藏號(hào)為PTA-10596,保藏日期為2010年1月21日。第二種目標(biāo)⑶V分離株 08021509 (美洲-2,標(biāo)記為 08021509 CDV-AM-2)也保藏在 ATCC,保藏號(hào)為 PTA-10597, 保藏日期為2010年1月21日。兩種保藏物都是完整病毒。本發(fā)明包括病毒,其具有保藏的分離株的特征,例如本文公開(kāi)的核苷酸序列;毒力和繁殖性質(zhì);合胞體性質(zhì)(例如大小、 形狀、數(shù)目、外觀([例如邊界清楚的、模糊的等)、合胞體中核的數(shù)目等;以及其它。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中,采用多價(jià)的CDV免疫原性組合物和/或疫苗(例如歐洲野生和美洲-2)。這2個(gè)⑶V譜系可以組合在單個(gè)制品中,或作為2個(gè)單獨(dú)的劑量單獨(dú)施用,例如,如果它們干擾CDV免疫的誘導(dǎo)。本發(fā)明提供了本文公開(kāi)的所有分離株,以及從所述分離株和/或從本文所述的分離株的抗原部分(例如包含在SEQ ID NO: 1-33和42-43中所述的核苷酸序列的核酸和/或由它們編碼的蛋白、多肽或肽)制備的疫苗和免疫原性組合物。本發(fā)明的疫苗可以以任何合適的方式配制,包括但不限于使用完整病毒(例如殺死的或減毒的,如下面詳細(xì)描述的)。 在該實(shí)施方案中,本文公開(kāi)的任一種新穎的CD病毒可以用于制備疫苗。通常,可以如下鑒別這樣的病毒從具有CDV感染征狀的狗(特別是以前已經(jīng)接種CDV疫苗的狗)的組織樣品中分離出病毒,對(duì)病毒基因組測(cè)序,并與已知序列進(jìn)行對(duì)比(即與本發(fā)明之前分離的CDV、 特別是目前在疫苗中使用的CDV分離株進(jìn)行對(duì)比)。具體地,這樣的新的病毒分離株可以具有H基因序列,該序列含有與分離株09041474B (—種示例性的分離株)相同或同源的區(qū)域。通常,這樣的病毒具有這樣的H基因(或其一部分),其與本文公開(kāi)的核酸序列或其互補(bǔ)體具有至少約75%、優(yōu)選約80%、更優(yōu)選約85%、最優(yōu)選約90%或甚至95、96、97、98、99 或100%同源性(和/或同一性)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述CDV分離株包含這樣的H-基因,其核苷酸序列與SEQ ID NO: 42 (即,分離株09041474B的序列)具有大于99%同源性(和/或同一性)。在一個(gè)有關(guān)的實(shí)施方案中,所述CDV分離株包含這樣的 H-基因,其核苷酸序列與SEQ ID NO: 42 ( S卩,分離株09041474B的序列)具有大于99. 5% 同源性(和/或同一性)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述⑶V分離株包含這樣的H-基因,其核苷酸序列與SEQ ID NO: 43 (即,分離株08021509的序列)具有大于95%同源性(和/或同一性)。在一個(gè)有關(guān)的實(shí)施方案中,所述CDV分離株包含這樣的H-基因,其核苷酸序列與SEQ ID NO: 43 (即,分離株08021509的序列)具有大于99%同源性(和/或同一性)。或者,這樣的病毒可以編碼H蛋白,該H蛋白含有與本文公開(kāi)的核酸序列編碼的氨基酸序列具有至少約75%、優(yōu)選約80%、更優(yōu)選約85%、最優(yōu)選約90%或甚至95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知計(jì)算%同源性或%同一性的方法。這樣的變體病毒可以具有編碼與本文公開(kāi)的那些不同的序列的H基因,所述不同是因?yàn)榉蛛x株中的天然變化,或由于故意引入(例如通過(guò)基因工程技術(shù))的變化。換而言之,所述病毒可以是重組的。在其它實(shí)施方案中,僅本文所述病毒的抗原部分存在于本發(fā)明的免疫原性的或疫苗組合物中。使用例如在SEQ ID NO: 1-33和42-43中所示的編碼抗原性肽或蛋白的核酸,或來(lái)自那些序列的肽或蛋白的抗原性表位或區(qū)域,可以配制這樣的組合物。例如,本發(fā)明的疫苗制品可以包含含有本文所述序列或其互補(bǔ)體的核酸序列和/或由這樣的序列編碼的蛋白、多肽或肽。另外,也包括具有這樣的序列的某些變化的疫苗。盡管所述序列代表 cDNA,本發(fā)明也包括對(duì)應(yīng)的ssRNA、ssDNA、雙鏈(ds) DNA、dsRNA、互補(bǔ)的DNA和任意形式的 RNA (例如mRNA、RNA/DNA雜合體等),其基于或源自這些序列或與這些序列互補(bǔ)。這樣的序列可以是有義或反義序列。此外,也預(yù)見(jiàn)到與本文公開(kāi)的CDV的核酸序列表現(xiàn)出至少約 90%同源性或甚至約95、96、97、98或99%或更大同源性的序列用于疫苗中。這樣的序列的差別可以是例如,在一個(gè)或多個(gè)位置處含有編碼相同氨基酸的替代密碼子,以便使表達(dá)最大化。另外,也預(yù)見(jiàn)到這些序列的編碼例如H蛋白的表位或抗原區(qū)的部分,以及與這樣的氨基酸序列表現(xiàn)出70%或甚至更優(yōu)選約80、90或95%或甚至更大同一性(例如96、97、98或 99%同一性)的序列。通常,約6-8個(gè)氨基酸構(gòu)成表位。這樣的序列的差別可以是例如, 含有保守的或非保守的氨基酸置換或刪除(尤其是氨基或羧基端刪除)、或各種插入等,只要得到的蛋白/肽具有本文所述的抗原性。這樣的抗原區(qū)的長(zhǎng)度優(yōu)選是至少約10個(gè)氨基酸,但是可以更長(zhǎng),例如包括整個(gè)蛋白諸如H蛋白。此外,也預(yù)見(jiàn)到在嚴(yán)謹(jǐn)條件(尤其是高嚴(yán)謹(jǐn)性條件)下與本文公開(kāi)的序列(或那些序列的一部分)雜交的核酸序列。嚴(yán)謹(jǐn)條件是指允許核酸序列與特定序列雜交的雜交條件。一般而言,高嚴(yán)謹(jǐn)條件是指這樣的雜交條件在約65°C、在包含約1 M鹽(優(yōu)選6 χ SSC)的溶液或具有相當(dāng)離子強(qiáng)度的任何其它溶液中,允許至少50個(gè)核苷酸和優(yōu)選約200個(gè)或更多個(gè)核苷酸的核酸序列與特定序列雜交,并在65°C、在包含約1 M鹽或更低(優(yōu)選0.2 χ SSC)的溶液或具有相當(dāng)離子強(qiáng)度的任何其它溶液中洗滌。這些條件允許檢測(cè)具有約90% 或更高序列同一性的序列。本發(fā)明包括的核酸,例如具有在SEQ ID NO: 1_33和42_43中所述的核苷酸序列 (和本文所述的它們的變體)的那些,可以以不同的方式得到。例如,可以從天然來(lái)源諸如從病毒分離株得到它們;或者,可以合成地生產(chǎn)它們。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解,本領(lǐng)域存在合成地生產(chǎn)非常大的序列(例如整個(gè)病毒或細(xì)菌基因組(例如支原體屬))的能力,本發(fā)明包括包含本文公開(kāi)的序列的任意起源或產(chǎn)品的序列、以及從所述序列表達(dá)的蛋白、多肽和/ 或肽。本發(fā)明也提供了重組構(gòu)建體諸如重組病毒、載體和表達(dá)載體,它們表達(dá)本文所述的蛋白/多肽/肽(即由SEQ ID NO: 1-33和42-43所述的核酸序列編碼的氨基酸序列, 或其變體)。這樣的構(gòu)建體包括已經(jīng)如下生產(chǎn)的那些例如,通過(guò)將一種或多種本文公開(kāi)的序列克隆進(jìn)載體或宿主(例如質(zhì)粒、粘粒、諸如腺病毒和痘病毒載體等病毒載體、或細(xì)菌載體等)中。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述構(gòu)建體是包括以前指出的核酸和/或其片段的表達(dá)載體。在本發(fā)明中使用的重組表達(dá)載體通常是自主復(fù)制的DNA或RNA構(gòu)建體,其包含編碼本發(fā)明的⑶V血凝素和/或其抗原性片段的核酸,其通??刹僮鞯剡B接到能夠調(diào)節(jié)所述核酸在適合的宿主細(xì)胞中的表達(dá)的合適的遺傳控制元件上。遺傳控制元件可以包括原核啟動(dòng)子系統(tǒng)或真核啟動(dòng)子表達(dá)控制系統(tǒng),且通常包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、任選的控制轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的操縱基因、用于升高mRNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、編碼合適的核糖體結(jié)合部位的序列、和終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。表達(dá)載體也可以含有允許載體獨(dú)立于宿主細(xì)胞地復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方法中的任一種,可以構(gòu)建重組表達(dá)載體。例如,已知可以取出目標(biāo)序列(例如從起始分離株諸如病毒中)并連接進(jìn)合適的表達(dá)載體中的基因工程技術(shù)?;蛘?,可以合成地制備表達(dá)載體的一部分或整個(gè)表達(dá)載體;或可以采用連接和合成方法的組
I=I ο另外,可以在本文所述的構(gòu)建體中包含其它有用的元件。例如,所述構(gòu)建體可以編碼各種序列,諸如組氨酸標(biāo)簽或用于促進(jìn)蛋白分離的其它標(biāo)簽,諸如谷胱甘肽-S移換酶 (GST),和麥芽糖結(jié)合蛋白;各種接頭或間隔物序列;各種佐劑和增加蛋白的抗原性的序列 (例如半抗原);引入希望的/方便的限制性酶切割位點(diǎn)或編碼希望的蛋白酶切割位點(diǎn)的序列;編碼熒光的或其它可檢測(cè)的標(biāo)記的序列,或標(biāo)志或標(biāo)記序列(例如綠熒光蛋白(GFP)或其部分);指導(dǎo)編碼的蛋白的定位、輸出或加工的各種序列(例如前導(dǎo)序列);異源信號(hào)序列(即在自然界中通常與CDV H蛋白無(wú)關(guān)的信號(hào)序列);等。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉其它可能性,且也意圖包括在本發(fā)明中。當(dāng)在構(gòu)建體中包含這樣的序列時(shí),如果它們與本文所述的病毒序列似乎鄰近的,可以將整個(gè)編碼序列翻譯成融合或嵌合蛋白/多肽/肽,且可以對(duì)翻譯后修飾敏感或不敏感(取決于序列)。本發(fā)明也提供了本發(fā)明的表達(dá)的重組蛋白/多肽 /肽和它們的對(duì)應(yīng)的融合或嵌合蛋白/多肽/肽。在具體實(shí)施方案中,也分離了這樣的重組蛋白/多肽/肽和它們的對(duì)應(yīng)的融合或嵌合蛋白/多肽/肽。另外,本發(fā)明提供了包含這樣的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞任選地是原核生物或真核生物宿主細(xì)胞。通過(guò)常規(guī)方法,可以在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)編碼本發(fā)明的 ⑶V血凝素的核酸。本發(fā)明的疫苗和免疫原性組合物可以包含本文所述的序列的任一種來(lái)源,例如病毒分離株、減毒的病毒、重組構(gòu)建體等。幾種制備適用于針對(duì)CDV的疫苗接種的疫苗的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn),例如,Appel等人的美國(guó)專利4,193,990和4,193,991,Carmichael 等人的美國(guó)專利4,303,645,Wood等人的美國(guó)專利4,971,793 ;Valdes等人的美國(guó)專利 5,882,652,和Parrish等人的美國(guó)專利5,885,585和5,814,510,它們各自提供了合適的疫苗配制方案的變化。這些專利各自的完整內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。通常,為了生產(chǎn)疫苗, 采用含有本發(fā)明的遺傳序列(天然地,或由于基因工程)的病毒或其它載體。這樣的病毒載體的實(shí)例包括這樣的病毒和病毒體(例如CDV),其“被殺死”、滅活或以其它方式減毒,因而在與合適的生理載體一起施用它的動(dòng)物中不會(huì)造成嚴(yán)重的疾病征狀。通過(guò)使用化學(xué)試劑諸如福爾馬林、二乙烯胺、β丙內(nèi)酯,通過(guò)使用Y輻照或熱,或通過(guò)本領(lǐng)域已知的其它方法, 可以滅活CDV病毒(使其不能復(fù)制)。可以如下實(shí)現(xiàn)減毒例如通過(guò)在合適的宿主細(xì)胞中重復(fù)傳代病毒分離株,并隨后分離得到的克隆分離株。在有些實(shí)施方案中,減毒的病毒保留在宿主內(nèi)復(fù)制的能力,盡管這不是嚴(yán)格地必然的。優(yōu)選地,給藥不會(huì)引起疾病征狀。但是, 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到,許多有效的疫苗組合物在給藥后會(huì)造成某種不適或相對(duì)次要的痛苦。但是,保護(hù)免于充分發(fā)展的疾病的益處遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)該可能性。減毒的病毒可以是天然地含有本發(fā)明核酸序列的病毒(例如CDV),或所述病毒可以是重組體,其中通過(guò)基因工程將所述核酸序列插入病毒中。在重組疫苗的情況下,可與將核酸序列摻入除了 CDV以外的病毒中,以形成異型重組疫苗。這樣的病毒的實(shí)例包括、但不限于,各種皰疹病毒、腺病毒、 痘病毒、非病原性的“孤兒病毒”、腸病毒諸如腸道病毒和本領(lǐng)域眾所周知的其它病毒。另夕卜,可以在細(xì)菌、酵母或寄生物重組系統(tǒng)中表達(dá)H基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述病毒是活的、減毒的(修飾的)高滴度CDV,且所述核酸是ssRNA。另外,也預(yù)見(jiàn)到其它形式的疫苗。例如,也預(yù)見(jiàn)到“空”病毒體顆粒疫苗(沒(méi)有核酸),以及包含抗原性病毒體或沒(méi)有裝配成殼體的其它CDV蛋白的疫苗。另外,本發(fā)明的疫苗可以是多價(jià)的,包括多種病毒?;蛘撸ㄟ^(guò)重組技術(shù),通過(guò)交換編碼區(qū)(這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的),可以構(gòu)建遺傳地工程化成含有編碼來(lái)自2種或更多種新穎CDV的蛋白的核酸的單個(gè)病毒。在本文所述的組合物中使用的CDV通常是減毒的且安全的,即當(dāng)施用給合適的宿主動(dòng)物時(shí),不產(chǎn)生或產(chǎn)生極少的疾病征狀。CDV疫苗應(yīng)當(dāng)不會(huì)在宿主的腦脊液中引起抗體生產(chǎn)。但是,減毒的CDV的施用仍然會(huì)導(dǎo)致針對(duì)CDV免疫原(諸如H蛋白)的免疫應(yīng)答(例如保護(hù)性的免疫應(yīng)答)。最常用的生產(chǎn)減毒的活病毒疫苗的方法是,在細(xì)胞培養(yǎng)物中連續(xù)傳代病毒。例如,可以在原代犬細(xì)胞培養(yǎng)物中,或在不攜帶癌基因的犬細(xì)胞系中,傳代病毒, 盡管也可以使用其它細(xì)胞系(例如雞胚胎或成纖維細(xì)胞、VER0-SLAM細(xì)胞、嬰倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系以及其它倉(cāng)鼠細(xì)胞系(Sultan S, NT Lan, T Ueda, R Yamaguchi, K Maeda, and K Kai. 2009. Propagation of Asian isolates of canine distemper virus (CDV) in hamster cell lines. Acta Veterinaria Scandinavica 51:38 doi: 10.1186/1751-0147-51-38) 等)。通常,對(duì)于第一次傳代,用選擇的CDV接種物,感染細(xì)胞培養(yǎng)物。得到明顯的病毒復(fù)制證據(jù)(例如,感染的細(xì)胞中病毒-誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)[CPE])以后,使用第一代的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基或感染的細(xì)胞或二者的等分試樣來(lái)感染第二代細(xì)胞培養(yǎng)物。重復(fù)該過(guò)程,直到病毒基因組中的一種或多種突變?cè)斐勺銐虻臏p毒,使得病毒可以安全地用作疫苗。傳代次數(shù)可以稍微變化,例如使用至少約20次、通常約50次傳代,但是可以使用多至例如150次傳代。此時(shí),病毒被充分地減毒(即,毒力或造成疾病的能力降低)至用于疫苗制劑中。通常通過(guò)將天然宿主暴露于逐漸更大的傳代水平的病毒,以經(jīng)驗(yàn)為主地確定減毒的程度。通過(guò)在逐漸降低的溫育溫度重復(fù)傳代,使用或不使用誘變化學(xué)試劑,也可能減弱 ⑶V病毒。通常,在37°C繁殖⑶V病毒。但是,在連續(xù)降低的溫育溫度傳代例如50次以后, 生成例如病毒的克隆株,其不再具有在核心體溫(37°C)或以上復(fù)制的能力。這樣的病毒保留在通常表現(xiàn)出更低溫度的身體區(qū)域(例如鼻腔)中復(fù)制的能力,但是不會(huì)在核心體溫復(fù)制。例如,在一個(gè)實(shí)施方案中,冷適應(yīng)的溫度CDV在約至約34°C的溫度在組織培養(yǎng)細(xì)胞中繁殖,但是在非允許的約37°C的溫度不繁殖(美國(guó)專利申請(qǐng)2006121521,Dowling和 Younger,其整個(gè)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)。這些病毒因此可以非常安全地用于動(dòng)物使用的 CDV疫苗中,所述動(dòng)物包括野生和高度敏感的物種(諸如大型貓科動(dòng)物、水貂和雪貂)。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知其它合適的疫苗組分(例如藥理學(xué)上可接受的載體),以及用作疫苗的這樣的組合物的制備。通常,這樣的組合物被制備成液體溶液或懸浮液,但是也預(yù)見(jiàn)到固體形式例如片劑、丸劑、散劑等。也可以制備適合于在給藥前溶解或懸浮于液體中的固體形式。制劑也可以被乳化?;钚猿煞挚梢耘c藥學(xué)上可接受的、并與活性成分相容的賦形劑混合。適合的賦形劑是例如水、鹽水、右旋糖、甘油等或其組合。另外,組合物可以含有小量的輔助物質(zhì),例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖劑等。如果需要施用口服形式的組合物,可以加入各種增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑等。本發(fā)明的組合物可以含有任何這樣的附加成分,從而提供適合于給藥形式的組合物。可翻譯的核酸在制劑中的最終量可以變化。但是,一般而言,該量是約1_99%。所述組合物可以另外包含佐劑,所述佐劑的合適的實(shí)例包括、但不限于,Seppic, Quil A、鋁膠(Alhydrogel)、水包油乳劑、磷酸鋁、聚羧乙烯、Emulsigen等。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的許多合適的方式中的任一種,可以施用本發(fā)明的免疫原性的/疫苗制品,所述方式包括但不限于通過(guò)注射、口服、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、攝入含有抗原的食品、通過(guò)肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、透皮和真皮內(nèi)途徑、滴眼劑或使用噴霧器或無(wú)針器械等。但是,在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述給藥模式是通過(guò)注射。另外,所述組合物可以單獨(dú)施用,或與其它藥劑或免疫原性組合物組合施用,例如作為多組分疫苗的一部分。具體地,所述免疫原性的CDV可以與下述物質(zhì)相組合狂犬病病毒、伯氏疏螺旋體iBorrelia burgdorferi)、犬埃里希體(Mhrlichia ca/?眾)、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒、 犬副流感病毒、犬冠狀病毒、犬巴貝蟲(chóng)iMbesia can is )、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體Urmp Iasma /7A^"OC_FtoMi7i )、賈第蟲(chóng)屬物種、利什曼原蟲(chóng)屬物種、鉤端螺旋體屬物種或它們的任意組合等。此外,施用可以是單個(gè)事件,或可以不同的時(shí)間間隔施用多個(gè)加強(qiáng)劑量(屬于相同或不同株),以增加免疫應(yīng)答。另外,施用可以是預(yù)防性的(即在已經(jīng)暴露于病毒或疑似已經(jīng)暴露之前,或在事實(shí)之后,即在已知的或疑似的暴露之后)或治療性的(例如在發(fā)生與病毒感染有關(guān)的疾病征狀以后)。本發(fā)明也提供了不同類型的重組載體和/或表達(dá)載體,其含有和表達(dá)本文公開(kāi)的核酸序列(或其編碼抗原性肽和/或多肽的部分)。這樣的載體和表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括、但不限于各種細(xì)菌(例如埃希氏大腸桿菌(federidia coli))或基于益生菌的(例如乳桿菌屬)表達(dá)載體;腺病毒載體、桿狀病毒、畢赤酵母和其它酵母表達(dá)系統(tǒng);痘載體諸如浣熊痘載體;等。這樣的重組載體和表達(dá)系統(tǒng)也可以用于疫苗制品中?;蛘撸鼈兛梢杂糜谄渌康?,諸如用于所述序列的實(shí)驗(yàn)室操作,或用于研究或診斷目的。本發(fā)明提供了通過(guò)給對(duì)象施用本發(fā)明的組合物,在有此需要的對(duì)象(例如哺乳動(dòng)物)中免疫或預(yù)防CDV感染征狀的方法。通常,以足以在小狗和/或成年狗中提供主動(dòng)免疫的量,施用所述CDV疫苗。優(yōu)選地,所述免疫應(yīng)答可以保護(hù)性地抗將來(lái)暴露于CDV,即與未接種疫苗的對(duì)照相比,所述組合物的施用會(huì)預(yù)防與CDV感染有關(guān)的疾病征狀。但是,如果免疫應(yīng)答簡(jiǎn)單地減輕或減少疾病征狀的嚴(yán)重性,即使所有征狀未消除,也可以獲得更多益處。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,使用本發(fā)明的疫苗接種的動(dòng)物是馴養(yǎng)的狗,包括成年狗和小狗。但是,也預(yù)見(jiàn)到其它潛在⑶V宿主的疫苗接種。其它潛在宿主包括其它犬屬諸如野生犬屬(例如狼、野狗物種等)、更大的貓科動(dòng)物物種(馴化的或野生的)、水貂、小熊貓、狐貍、獅子和虎、雪貂、兔、山羊等、以及其它一般的肉食動(dòng)物。雪貂高度易感 CDV0因而,可以使用高度減毒的、修飾的活病毒疫苗或重組CDV疫苗。根據(jù)美洲雪貂協(xié)會(huì) (American Ferret Association,MD),可以將3種CDV疫苗施用給8、11和14周齡的健康雪貂。盡管所述疫苗當(dāng)然地用于馴養(yǎng)的動(dòng)物,野生的或部分地馴化的動(dòng)物也可以從這樣的疫苗接種獲益,例如在動(dòng)物園或保護(hù)區(qū)、公園、研究場(chǎng)所等中的動(dòng)物。尤其可以用殺死的CDV疫苗接種野生動(dòng)物,因?yàn)樗鼈儗?duì)修飾的活病毒疫苗更易感,例如通過(guò)使用含有疫苗組分的可食用誘餌。通過(guò)接種本文提供的疫苗制品,攜帶⑶V變體(無(wú)論所述病毒是否在宿主中造成疾病征狀)的任意動(dòng)物可以獲益。給病毒感染后無(wú)征狀的動(dòng)物(即沉默載體)接種疫苗是有益的,以便減少病毒向更易感群體的傳播。本發(fā)明也提供了抗體,其特異性地或選擇性地結(jié)合本文公開(kāi)的CDV的抗原性決定簇或抗原區(qū)。在有些實(shí)施方案中,所述抗體是中和抗體,其可以中和病毒并從而預(yù)防感染。 這樣的有差別的抗體可以是多克隆的或單克隆的,盡管單克隆抗體通常是優(yōu)選的。所述抗體可以屬于犬起源。通過(guò)將病毒(例如殺死的病毒、蛋白或編碼蛋白的核酸)注射進(jìn)小鼠或另一種合適的宿主(諸如兔或犬宿主)中,可以制備單克隆抗體。在3次強(qiáng)化后,收獲脾, 并與骨髓瘤細(xì)胞融合。通過(guò)ELISA、HA-HI和間接的熒光抗體實(shí)驗(yàn),可以篩選生產(chǎn)單克隆抗體的克隆。保存與本文所述的病毒或與從所述病毒分離的蛋白反應(yīng)的克隆,用于開(kāi)發(fā)CDV 診斷試驗(yàn)。通過(guò)將一種或多種跨氨基酸密碼子的肽(它們是優(yōu)選的抗原靶標(biāo)例如H蛋白)注射進(jìn)兔子中,可以制備多克隆抗體。本發(fā)明也提供了用于檢測(cè)本文所述的CDV變體的診斷方法和試劑盒。這樣的試劑盒包括,例如,特異性地?cái)U(kuò)增(例如通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR)本文公開(kāi)的核酸序列的寡核苷酸引物?;蛘?,這樣的試劑盒可以包括抗體(例如單克隆的或多克隆的),所述抗體選擇性地或特異性地結(jié)合所述新穎的CDV變體展示的獨(dú)特抗原性決定簇。所述試劑盒可以用于監(jiān)測(cè)⑶V狀態(tài),例如,易感⑶V的任意動(dòng)物、尤其是犬的⑶V狀態(tài)。所述試劑盒特別適用于監(jiān)測(cè)從一個(gè)區(qū)域出口或運(yùn)輸?shù)搅硪粋€(gè)區(qū)域的小狗和狗的CDV狀態(tài)。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的診斷測(cè)試和方法被用于檢測(cè)CDV在已經(jīng)充分接種疫苗、但是仍然已經(jīng)發(fā)生CDV感染征狀的狗(或其它動(dòng)物)中的存在。使用本發(fā)明的方法,可能確定疾病的病原因子的基因型, 并確定疾病征狀是由疫苗株造成的,還是由疫苗接種未中和的遺傳變體的重復(fù)感染造成的 (即所述疫苗沒(méi)有提供針對(duì)遺傳變體的保護(hù))。下面的實(shí)施例進(jìn)一步例證了本發(fā)明,所述實(shí)施例不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1. 7種⑶V分離株的初步研究
犬瘟熱病毒(CDV)是一種高度傳染性的病毒,其造成狗的多系統(tǒng)疾病。接收了來(lái)自美國(guó)的狗中的7個(gè)⑶V病例。這些⑶V分離株在表達(dá)犬信號(hào)傳遞淋巴細(xì)胞-活化分子(SLAM) 的Vero細(xì)胞系中形成大的、多核的合胞體(下面描述)。基于血凝素基因序列,來(lái)自3個(gè)州 (CA、MO和0K)的⑶V分離株形成2個(gè)⑶V遺傳組組I (主要的,6/7)由與⑶V的歐洲野生譜系密切相關(guān)的⑶V分離株組成。組II (次要的,1/7)在遺傳上與⑶V的北極-樣譜系有關(guān)。但是,兩個(gè)⑶V組都在遺傳上不同于目前的疫苗菌株,后者屬于老的(1930-1950) ⑶V分離株的美洲-1譜系。在該研究中,使用H基因序列,進(jìn)行來(lái)自美國(guó)的7種CDV分離株的進(jìn)化和遺傳分析。使用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),研究H基因序列變化的生物學(xué)效應(yīng)。死前樣品包括眼拭子、 鼻拭子和用EDTA抗凝的末梢血。將所述拭子接收進(jìn)1-2 ml冷的生理鹽水,在收集后M h 內(nèi),放在冰上過(guò)夜遞送。未測(cè)試尿樣。死后樣品來(lái)自扁桃體、腦、膀胱和肺(Kubo,T., Y.Kagawaj H. Taniyamaj 禾口 A. Hasegawa. 2007. Distribution of inclusion bodies in tissues from 100 dogs infected with canine distemper virus. J. Vet. Med. Sci. 69:527-5 )。將大約2-5 g每個(gè)組織接收進(jìn)試管中,放在冰上過(guò)夜遞送,用于病毒學(xué)檢測(cè)。 從來(lái)自美國(guó)3個(gè)州的7個(gè)CD疑似病例(俄克拉荷馬,4個(gè);密蘇里州,1個(gè);和加利福尼亞, 2個(gè)),得到樣本。為了直接的熒光抗體檢測(cè),以8-μπι厚度切割組織,并用丙酮(75%)-甲醇(25%) 混合物在室溫固定。Veterinary Medical Research and Development(VMRD), Pullman, WA, USA供給預(yù)滴定的、批次之間檢驗(yàn)過(guò)的綴合物,用于獸醫(yī)診斷用途。作為質(zhì)量控制/質(zhì)量保證的一部分,在用于陰性和已知的陽(yáng)性CDV對(duì)照之前,測(cè)試綴合物。加入現(xiàn)成即可使用的、預(yù)稀釋的、熒光素異硫氰酸酯-標(biāo)記的抗-CDV單克隆抗體(VMRD,Pullman, WA)或多克隆抗體綴合物(VMRD,Pullman, WA)以后,在37°C溫育切片30 min。洗滌未結(jié)合的抗體綴合物以后,用伊文思藍(lán)復(fù)染色切片15 min0在緩沖的甘油(pH 9.4)中固定化以后,通過(guò)熒光顯微術(shù),檢查切片。陽(yáng)性的細(xì)胞顯示出在細(xì)胞質(zhì)中的蘋果綠熒光,陰性細(xì)胞是紅棕色。為了分離,將來(lái)自CDV-感染的樣品的組織剁碎,凍融兩次,以釋放病毒,并在 8,000 χ g離心。通過(guò)0.22 μ m注射過(guò)濾器,過(guò)濾澄清的上清液。Vero細(xì)胞系源自在日本的正常成年非洲綠猴(Cfer印iiAecm)的腎。如%1^等人以前所述(kki,F(xiàn)., N. 0no, R. Yamaguchi,禾口 Y. Yanagi. 2003. Efficient isolation of wild strains of canine distemper virus in Vero cells expressing canine SLAM (CD 150) and their adaptability to marmoset B95a cells. J. Virol. 77:9943-9950),通過(guò)用犬信號(hào)傳遞淋巴細(xì)胞活化分子(SLAM,也稱作⑶150)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,衍生出重組細(xì)胞系。在37°C, 溫育接種物(約1 ml/25-cm2培養(yǎng)瓶)1 h,每20分鐘進(jìn)行搖動(dòng)。在接種表達(dá)犬SLAM的重組Vero細(xì)胞系以后,加入含有5%胎牛血清的約3. 5 ml Dulbecco氏改良的伊格爾培養(yǎng)基 (Cellgro, Hendron, VA)。每天檢查細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)(多核的-合胞體形成)(kki, 同上)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),表達(dá)犬SLAM的Vero細(xì)胞可以用于⑶V的初步分離(Lan,N. T., R. Yamaguchi, K. Uchida, S. Sugano,禾口S. Tateyama. 2005. Growth profiles of recent canine distemper isolates on Vero cells expressing canine signaling lymphocyte activation molecule (SLAM). J. Comp. Path. 133:77-81)。為了從樣本提取總RNA (宿主和病毒RNA),使用QIAmp病毒RNA提取試劑盒 (Qiagen Inc. , CA)。使用Nonodrop 分光光度計(jì)(Nanodrop Technologies, CA),通過(guò)Aa50/ A28tl,檢查RNA的質(zhì)量和數(shù)量。為了檢測(cè)⑶V RNA,使用基于核衣殼(N)基因的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT) -PCR (Kim, Y. H·, K. W. Cho, H. Y. Youn, H. S. Yoo,和 H. R. Han. 2001. Detection of canine distemper virus (CDV) through one step RT-PCR combined with nested PCR. J. Vet. Sci. 2:59-6;3)。該方法會(huì)提供高靈敏度,這是由于靶基因的嵌套擴(kuò)增(nested amplificationXN基因的高拷貝數(shù)、和⑶V分離株中N-基因的保守序列。簡(jiǎn)而言之,使用正向引物(引物 1:5,-ATTTGGGATTGCTTAGGA-3,,SEQ ID N0: 34)和反向引物(引物 2: 5,-GGCGCTCATCTTGGACAT-3,,SEQ ID N0: ;35),擴(kuò)增第一輪產(chǎn)物。該方法是在 45°C反轉(zhuǎn)錄1小時(shí)、95°C 3 min ;30個(gè)在94°C變性30 S、在退火30 S、并在72°C延伸1 min的 PCR循環(huán);最后在72°C延伸7 min,將反應(yīng)混合物保持在4°C。對(duì)第一輪反應(yīng)的小部分(1_微升)產(chǎn)物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,其中使用引物3 (5‘-GTTAGCTAGTTTCATCCT-3‘, SEQ ID NO: 36) 和引物 4 ( 5,-GGTCCTCTGTTGTCTTGG-3,,SEQ ID NO: 37)。第二輪的方法是在 95°C變性3 min ;30個(gè)在94°C變性30 S、在退火30 S、并在72°C延伸1 min的循環(huán)。最后在 72°C延伸7 min,并在電泳之前,將反應(yīng)混合物保持在4°C。第二輪擴(kuò)增子的大小是419堿基對(duì),這通過(guò)在瓊脂糖凝膠分析中包含分子大小標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)驗(yàn)證。為了 CDV基因分型,使用H基因作為靶標(biāo)(Martelh,V. , G. Elia, M.S. Lucente, N. Decaro, Ε. Lorusso, K. Banyai, Μ. Blixenkrone-MolIer, N. Τ. Lan, R. Yamaguchi, F. Cirone, L. Ε. Carmichael,禾口 C. Buonavoglia. 2007. Canine distemper virus (CDV) by hemi-nested multiplex PCR provides a rapid approach for investigation of CDV outbreaks. Vet. Microbiol. 122:32-42)。正向引物(引物 204+,核苷酸 388-409,5,-GAATTCGACTTCCGCGATCTCC-3,,SEQ ID NO: 38)和反向引物 (引物 232b-,核苷酸 1543-1519,5,-TAGGCAACACCACTAATTTRGACTC-3,,SEQ ID N0: 39) 產(chǎn)生1160堿基對(duì)的擴(kuò)增子。H-基因RT-PCR方法是在50°C反轉(zhuǎn)錄30 min,并在94°C 2 min。PCR 方法是;35 個(gè) 94°C 1 min,50°C 1 min 和 72°C 3 min 的循環(huán),最后在 72°C延伸 10 min,將反應(yīng)混合物保持在4°C。在檢測(cè)(N基因)和基因分型(H基因)RT-PCR方法的每個(gè)運(yùn)行中,包含陽(yáng)性和陰性CDV對(duì)照。對(duì)于H基因序列的系統(tǒng)發(fā)生分析,在俄克拉荷馬州俄克拉荷馬城的俄克拉荷馬醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)(Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK)處,對(duì)擴(kuò)增子測(cè)序。對(duì)序列進(jìn)行核苷酸的基礎(chǔ)局部比對(duì)搜索工具 (Basic Local Alignment Search Tool for Nucleotides (BLASTN))分析(Altschul, S. F. , Τ. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller,禾口D. J. Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nuc. Acid Res. 25:3389-3402),并與來(lái)自全球不同物種和地理區(qū)域的CDV分離株的GenBank H基因序列相對(duì)比。記錄H基因序列的同一性百分比。此外,對(duì)H基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析,并與保藏在GenBank中的疫苗CDV分離株(Onderst印ort、Convac, Lederle和Snyder Hill CDV分離株)的H基因序列進(jìn)行序列對(duì)比。與已知序列的前100 個(gè)匹配比對(duì)被用于進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析,其中使用Jukes-Cantor方法(NCBI,MD)進(jìn)行鄰域連接。使用水性Romanowsky染色,對(duì)來(lái)自2個(gè)CD病例樣品(0ADDL 07091030和OADDL 07091031)的末梢血膜進(jìn)行染色,并通過(guò)光學(xué)顯微術(shù)進(jìn)行檢查。兩種血膜都揭示在嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的眾多嗜酸性粒細(xì)胞性結(jié)構(gòu),與CDV包涵體相一致(圖36)。 通過(guò)在兩個(gè)病例中直接的熒光-抗體檢驗(yàn),證實(shí)CDV包涵體的存在。在含有犬SLAM/⑶150的Vero細(xì)胞系中,成功地分離出了 7個(gè)⑶V陽(yáng)性樣品中的 6個(gè)。CDV分離株的細(xì)胞病變效應(yīng)的特征在于,在接種后1-2天形成的多核合胞體。通過(guò)血凝素基因的RT-PCR,進(jìn)一步檢測(cè)⑶V的存在。1個(gè)⑶V樣品(0ADDL 07061535)僅通過(guò)H基因的RT-PCR和測(cè)序進(jìn)行檢驗(yàn);沒(méi)有足夠的樣品用于病毒分離?;贖基因的RT-PCR和隨后的測(cè)序,在CDV分離株(0K-1、0K-2、0K-3、0K-4、CA_1 和CA-2 ;主要組I)中,與來(lái)自密蘇里州的犬⑶V分離株19876的同一性水平最高,所述犬 CDV分離株19876與丹麥貂CDV分離株在遺傳上最相關(guān)(Pardo,I. D. R.,G. C. Johnson, 禾口 S. B. Kleiboeker. 2005. Phylogenetic characterization of canine distemperviruses detected in naturally infected dogs in North America. J. Clin. Microbiol. 43:5009-5017)。因而,它是該研究中的主要CDV變體(7個(gè)分離株中的6個(gè))。 這6個(gè)⑶V分離株屬于⑶V分離株的歐洲野生譜系。但是,發(fā)現(xiàn)1個(gè)分離株(M0-1 ;次要組 II)在遺傳上與來(lái)自密蘇里州的犬⑶V分離株21沈0最類似(Pardo,同上),后者與小熊貓CDV分離株密切相關(guān)。該CDV分離株屬于CDV分離株的北極-樣譜系。在表1中總結(jié)了關(guān)于2007 OADDL⑶V分離株的信息,在圖1_7中提供了這些分離株的H基因的部分核苷酸序列。表1. OADDL犬瘟熱病毒(⑶V)分離株
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1I -不完全疫苗接種;NV =未接種疫苗;V =接種疫苗
2所有分離株與當(dāng)前的疫苗分離株(Onderst印ort、Lederle和Convac)具有小于90% 同一性
3所有分離株與美國(guó)MO 19876 CDV分離株具有小于90%同一性,但是MO-I除外,其屬于北極譜系
4在支持療法后,動(dòng)物完全恢復(fù) 5Eff =歐洲野生;A =北極 6nd =沒(méi)有進(jìn)行。CDV分離株中的血凝素糖蛋白相差大約10%,包膜蛋白H決定了病毒的細(xì)胞病理學(xué)禾口趨性(von Messling, V. G. Zimmer, G. Herrler, L. Haas,禾口R. Cattaneo. 2001)。 在初步分析中,將OADDL⑶V分離株與GenBank中的所有H序列相對(duì)比,發(fā)現(xiàn)⑶V分離株簇集在地理上不同的譜系中。例如,所有阿根廷⑶V分離株形成一個(gè)獨(dú)特簇?;诘乩韺W(xué)和H基因種系發(fā)生,南美洲⑶V分離株未被包含在最近的⑶V分離株分析中(McCarthy, 同上)。但是,它們形成一個(gè)獨(dú)特的南美洲簇。在最近的文章中,術(shù)語(yǔ)基因型、簇和譜系已經(jīng)被不同的研究人員互換使用,但是關(guān)于CDV種系發(fā)生的結(jié)果在所有研究中是類似的(Martella,V.,F(xiàn). Cironej G. Eliaj E. Lorussoj N. Decaroj M. Campoloj C. Desarioj M. S. Lucentej A. L Bellaciccoj M. Blixenkrone-Mollerj L E. Carmichaelj 禾口C. Buonavoglia. 2006. Heterogeneity within the hemagglutinin genes of canine distemper virus (CDV) strains in Italy. Vet. Microbiol. 116:301-309; McCarthy, supra; Mochizuki. M.,Μ. Hashimoto, S. Hagiwaraj Y. Yoshidaj 禾口 S. Ishiguro.1999. Genotypes of canine distemper virus determined by analysis of the hemagglutinin genes of recent isolates from dogs in Japan. J. Clin. Microbiol. 37:29364942),包括本分析,因?yàn)樗醒芯咳藛T使用GenBank登記序列。已經(jīng)提出,⑶V 的特定基因型的一個(gè)成員在H基因序列的核苷酸中具有超過(guò)95%同一性(Mochizuki,同上),且因而,基因型內(nèi)變化小于5% (Martella,同上)。從來(lái)自俄克拉荷馬的3-月齡雌性混合品種接種疫苗的狗得到CDV分離株OK-I (0ADDL 07061535),所述狗具有結(jié)膜炎史、鼻涕和體重減輕。所述狗尚未完成疫苗接種的完整過(guò)程,且具有漫游和咬食垃圾史。該⑶V分離株與⑶V分離株19876 (GenBank登錄號(hào) AY964110. 1)具有最大同一性(98%)?;贖基因分析,⑶V分離株19876與0K-1 —起屬于CDV分離株的歐洲野生譜系。從來(lái)自俄克拉荷馬的11-月齡未接種疫苗的西伯利亞雪撬犬的組織庫(kù),得到CDV 分離株0K-2 (0ADDL 07091030)。在尸檢后,結(jié)膜和氣管上皮含有胞質(zhì)內(nèi)的、嗜酸性包涵體,其被透明的暈圈包圍。在扁桃體中,存在顯著的淋巴消耗和許多在上皮中的包涵體。該分離株與CDV分離株19876 (犬起源,密蘇里州)具有最大同一性(98%),與來(lái)自匈牙利(GenBank 登錄號(hào) EF095750. 1)、丹麥貂 C47759. 1)和小熊貓(AF178039. 1)的 CDV 分離株、CDV株A75/17 (AF164967. 1)和來(lái)自德國(guó)雪貂分離株的麻疹病毒(X84999. 1) 具有94%同一性。來(lái)自美國(guó)的CDV分離株A75/17被視作野外CDV分離株的毒力原型 (Simon-Martinez,同上)。H基因與疫苗分離株(Convac、Lederle 禾口 Ondersteport)的同一性水平是89%。從在俄克拉荷馬庇護(hù)所中的狗,得到⑶V分離株0K-3 (0ADDL 07091031)。得到血液管(blood tube),但是不可得到該病例的其它歷史。在末梢血膜上的白細(xì)胞中,觀察到與 ⑶V —致的包涵體,并通過(guò)直接熒光-抗體檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。通過(guò)病毒分離,血樣是⑶V 陽(yáng)性的。對(duì)H基因測(cè)序,且與⑶V犬分離株19876 (GenBank登錄號(hào)AY964110. 1)具有99% 同一性,與來(lái)自匈牙利(EF095750. 1)、丹麥貂(Z47759. 1)和小熊貓(AF178039. 1)的CDV 分離株、⑶V病毒株A75/17、⑶V分離株0H641和德國(guó)雪貂麻疹病毒株(X84999. 1)具有 95%同一性。從來(lái)自俄克拉荷馬動(dòng)物庇護(hù)所收養(yǎng)的狗的組織庫(kù)(膀胱和肺),得到CDV分離株OK-4 (0ADDL 07091032)。該CDV分離株與CDV分離株19876 (GenBank登錄號(hào) AY964110. 1)具有最大同一性(96%)。以遞減次序,它與來(lái)自匈牙利(EF095750. 1)、小熊貓 (AF178039. 1)和丹麥貂(Z47759. 1)的⑶V分離株具有93%同一性;與疫苗分離株具有84%
同一性;與海豹瘟熱病毒具有70%同一性。從死于CD的來(lái)自加利福尼亞的10-周齡雄性接種疫苗的美洲牛頭犬的組織庫(kù),得到⑶V分離株CA-I (0ADDL 07101508)。4個(gè)同胞仔中的3個(gè)死于⑶,具有呼吸道征象、角化過(guò)度和癲癇發(fā)作。在3個(gè)死亡的同胞仔中,可以得到1個(gè)同胞仔的尸檢報(bào)告。尸檢時(shí),它的肺是堅(jiān)硬且充血的。4個(gè)同胞仔之一的尸檢結(jié)果是完全正常的。H基因序列與犬起源CDV 分離株19876 (GenBank登錄號(hào)AY964110. 1)具有98%同一性。所述⑶V分離株與匈牙利 CDV分離株、小熊貓分離株(AF178039. 1)和CDV株A75/17 (AF164967)具有94%同一性。 CDV H基因序列與CDV分離株01-2641 (AY526496. 1)具有93%同一性。該CDV分離株的H 基因缺少在所有疫苗CDV分離株中存在的I3St I位點(diǎn)(Demeter,Ζ.,B. Lakatos, Ε. Α.Paladej Τ. Kozmaj P. Forgachj 禾口Μ· Rusvai. 2007. Genetic diversity of Hungarian canine distemper virus strains. Vet. Microbiol. 122:258-269)。從具有與CD —致的臨床征象的CDV疫苗接種的10-周齡德國(guó)魏犬的鼻和結(jié)膜拭子,得到⑶V分離株MO-I (0ADDL 07110098)。所述狗發(fā)生‘口香糖,癲癇發(fā)作、增厚的腳墊、咳嗽、鼻涕和充血的肺。在安樂(lè)死之前收集拭子,并在細(xì)胞培養(yǎng)物中分離CDV。CDV分離株H基因與來(lái)自密蘇里州的CDV分離株2U61和18133具有最大同一性(98%),與來(lái)自意大利(48/05 和 179/94)和匈牙利(H06Bpl0S、H06Bp8F、H05Bp7F、H05Bp6F 和 H05BpBp5F)的 CDV分離株具有97%同一性。該CDV分離株的H基因序列與來(lái)自格陵蘭狗的CDV分離株具有95%同一性,與⑶V 19876僅具有90%同一性。它與疫苗⑶V分離株具有89%同一性,與海豹瘟熱病毒H基因具有70%同一性。此外,該CDV分離株缺少在所有疫苗CDV分離株中存在的I^st I限制位點(diǎn)(Demeter,同上)?;谙到y(tǒng)發(fā)生分析,該分離株屬于⑶V分離株的北極-樣譜系。從具有嘔吐、腹瀉和淋巴細(xì)胞減少史的32-月齡的閹割的雄性的接種疫苗的邊界柯利犬的鼻、咽、扁桃體和結(jié)膜拭子的組合,得到⑶V分離株CA-2 (0ADDL 07111080)。H 基因序列與CDV分離株19876具有最大同一性(96%)。該分離株與匈牙利CDV分離株、小熊貓⑶V分離株和丹麥貂⑶V分離株具有93%同一性;與⑶V株A75/17 (GenBank登錄號(hào) AF164967. 1)具有92%同一性;與德國(guó)雪貂⑶V分離株具有92%同一性?;谙到y(tǒng)發(fā)生分析,該CDV分離株與歐洲野生譜系的CDV分離株聚簇。該狗在治療后恢復(fù),且已經(jīng)在最后的 3個(gè)月中在臨床上是健康的。在天然暴露于歐洲野生譜系的CDV分離株以后,該狗的存活可能是由于基于年齡的抗性、遺傳抗性和用商業(yè)的CDV疫苗完整接種以后的免疫。在從CDV 感染恢復(fù)后3個(gè)月,通過(guò)⑶V血清中和,該狗具有1 16的⑶V滴度。發(fā)現(xiàn)6種OADDL 2007⑶V分離株中的5種會(huì)在表達(dá)犬SLAM受體的Vero細(xì)胞系中生成多核的合胞體。已經(jīng)提出,合胞體大小與⑶V分離株的毒力程度有關(guān)(Cosby,S. L., C. Lyons, S. P. Fitzgerald, S. J. Martin, S. Pressdee, I. V. Allen. 1981. J. Gen. Virol. 52:345-353),因?yàn)樗c⑶V在細(xì)胞之間傳播的能力有關(guān)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中的侵入性傳播、在天然地表達(dá)SLAM/⑶150的犬淋巴細(xì)胞中生成大量包涵體的能力、和在接種疫苗的狗中造成致命感染的能力指示,歐洲野生譜系的這些犬分離株對(duì)狗是有毒力的。該實(shí)施例表明,EW譜系正在作為美國(guó)的優(yōu)勢(shì)CDV分離株而出現(xiàn)。實(shí)施例2.其它的⑶V分離株
使用在實(shí)施例1中所述的方法,鑒別出其它的CDV分離株,并列出在表2中。表2. OADDL犬瘟熱病毒(⑶V)分離株
權(quán)利要求
1.一種分離的歐洲野生(EW)譜系的犬瘟熱病毒(⑶V),其包含⑶V 9041474B⑶V-EW (ATCC保藏號(hào)PTA-10596)的特征。
2.—種CDV減毒株,其從如權(quán)利要求1所述的CDV株或其后代株已經(jīng)在其中繁殖的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出。
3.一種免疫原性組合物,其包含如權(quán)利要求1所述的分離的CDV或其后代。
4.一種在有此需要的對(duì)象中引起針對(duì)犬瘟熱病毒的免疫應(yīng)答的方法,所述方法包括下述步驟給所述對(duì)象施用如權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物。
5.一種診斷試劑盒,其包含特異性地用于擴(kuò)增在SEQ ID NO: 42中所述的核苷酸序列的寡核苷酸引物。
6.一種編碼SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的分離的核酸分子或其互補(bǔ)體。
7.如權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子,其包含SEQID NO: 42的核苷酸序列或其互補(bǔ)體。
8.—種表達(dá)載體,其包含如權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子。
9.一種免疫原性組合物,其包含如權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體。
10.一種分離的多肽,其包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列。
11.一種歐洲野生(EW)譜系的分離的犬瘟熱病毒(⑶V),其編碼包含SEQ ID NO: 44 的氨基酸序列的多肽。
12.—種美洲-2 (AM-2)譜系的分離的犬瘟熱病毒(⑶V),其具有⑶V 08021509 CDV-AM-2 (ATCC 保藏號(hào) PTA-10597)的特征。
13.—種CDV減毒株,其從如權(quán)利要求12所述的CDV株或其后代株已經(jīng)在其中繁殖的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出。
14.一種免疫原性組合物,其包含如權(quán)利要求12所述的分離的CDV或其后代。
15.一種在有此需要的對(duì)象中引起針對(duì)犬瘟熱病毒的免疫應(yīng)答的方法,所述方法包括下述步驟給所述對(duì)象施用如權(quán)利要求14所述的免疫原性組合物。
16.一種診斷試劑盒,其包含特異性地用于擴(kuò)增在SEQ ID N0: 43中所述的核苷酸序列的寡核苷酸引物。
17.—種編碼SEQ ID N0: 45的氨基酸序列的分離的核酸分子或其互補(bǔ)體。
18.如權(quán)利要求17所述的分離的核酸分子,其包含SEQID N0: 43的核苷酸序列或其互補(bǔ)體。
19.一種表達(dá)載體,其包含如權(quán)利要求17所述的分離的核酸分子。
20.一種免疫原性組合物,其包含如權(quán)利要求19所述的表達(dá)載體。
21.一種分離的多肽,其包含SEQ ID N0: 45的氨基酸序列。
22.—種歐洲野生(EW)譜系的分離的犬瘟熱病毒(⑶V),其編碼包含SEQ ID N0: 45 的氨基酸序列的多肽。
23.一種免疫原性組合物,其包含編碼血凝素蛋白的⑶V病毒體,所述⑶V病毒體包含核酸,所述核酸包含如SEQ ID NO: 1-33所述的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。
24.一種在有此需要的對(duì)象中引起針對(duì)犬瘟熱病毒的免疫應(yīng)答的方法,所述方法包括下述步驟給所述對(duì)象施用組合物,所述組合物包含編碼血凝素蛋白的⑶V病毒體,所述⑶V病毒體包含核酸,所述核酸包含如SEQ ID NO: 1-33所述的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。
25.一種選擇用于免疫原性組合物中的病原體分離株的方法,其中所述分離株使用一種或多種最常用的密碼子來(lái)編碼選擇的目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽,所述方法包括下述步驟對(duì)于多種病原體分離株中的每種分離株,測(cè)定編碼所述選擇的目標(biāo)免疫原性的蛋白、 多肽或肽的核苷酸序列;對(duì)于在所述測(cè)定步驟中得到的核苷酸序列,得到所述目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽中一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基的密碼子選擇數(shù)據(jù),由此得到密碼子選擇頻率數(shù)據(jù);從所述密碼子選擇頻率數(shù)據(jù),鑒別出所述目標(biāo)免疫原性的蛋白、多肽或肽中每一個(gè)所述目標(biāo)氨基酸殘基的最常用的密碼子;和從所述多種病原體分離株中,選擇使用一種或多種所述最常用的密碼子來(lái)編碼所述目標(biāo)蛋白、多肽或肽的分離株。
26.如權(quán)利要求25所述的方法,其中所述病原體是犬瘟熱病毒。
全文摘要
提供了免疫原性組合物和廣譜疫苗,其含有從地理區(qū)域收集的犬瘟熱病毒(CDV)的新鑒別出的分離物。所述新鑒別出的分離株表現(xiàn)出歐洲野生譜系CDV以及北極和美洲-2譜系CDV之一或二者的性質(zhì)。因此,所述疫苗可以廣泛地保護(hù)免于歐洲野生譜系CDV以及北極譜系CDV或美洲-2譜系CDV、或北極和美洲-2譜系CDV二者的感染。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102459578SQ201080014578
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月30日
發(fā)明者卡皮爾 S. 申請(qǐng)人:俄克拉荷馬州大學(xué)評(píng)議會(huì)
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