專利名稱：用于治療因黃病毒科病毒感染的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于在哺乳動(dòng)物中治療黃病毒科病毒感染的化合物、組合物、用途及方法。更具體地，本發(fā)明是關(guān)于用途及治療方法，其包括給予選自大環(huán)肽化合物屬的化合物。
現(xiàn)有技術(shù)病毒的黃病毒科是有包膜正鏈RNA病毒，它包括多種人類致病病毒，譬如肝類病毒屬的病毒，包括C型肝炎，黃熱病毒屬的病毒，包括登革熱病毒、腦炎病毒、西尼羅河腦炎(West Nile)病毒及黃熱病病毒，及粘膜疾病病毒屬的病毒，包括牛病毒腹瀉病毒與邊緣疾病(border disease)病毒，這兩種均為動(dòng)物病原。最新發(fā)現(xiàn)的病毒，G型肝炎病毒(HGV)與GB型肝炎病毒(GBV-A，B，C)，也暫時(shí)地被認(rèn)為是黃病毒科的成員，歸屬于不同的屬。
登革熱病毒，黃病毒科的成員，通過(guò)蚊子傳染。有四種會(huì)造成廣范圍人類疾病的血清型，其中一種會(huì)引起登革熱出血熱，而生活在世界的熱帶與亞熱帶區(qū)域中的約有40％人口，處于有感染的危險(xiǎn)。每年1百萬(wàn)例出血熱病中，約5％是為致死的。目前沒(méi)有有效的疫苗或抗病毒的藥物以防止登革熱疾病。
粘膜疾病病毒，譬如牛腹瀉病毒(BVDV)、經(jīng)典豬熱病毒(CSFV)及邊緣疾病病毒(BDV)，包括感染牛、豬及綿羊的經(jīng)濟(jì)上重要?jiǎng)游锊≡骸＿@些正感RNA病毒在黃病毒科中分類為單獨(dú)屬。
GB-病毒已分類為黃病毒科的成員，但尚未基于基因組序列分析而被指定為特定屬。這些RNA病毒，除了會(huì)感染人類以外，可在實(shí)驗(yàn)上受感染的狨(tamarins)中造成急性可分離的肝炎。
在黃病毒科內(nèi)的病毒具有許多類似性，而不管在其成員中的相對(duì)較低整體序列的類同性。這些病毒的基因組是小的單股RNA(≈10千基長(zhǎng)度)具有單一開(kāi)放解讀譯碼(ORF)。ORF編碼一種約3000個(gè)氨基酸的多蛋白，該多蛋白在其5′末端含有結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，及在其3′末端有非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白質(zhì)。多蛋白是通過(guò)病毒與宿主編碼的蛋白酶以蛋白分解方式處理成為成熟多肽，對(duì)HCV是如下NH2-{C-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B}-COOH。核蛋白或核殼(C)及兩種包膜糖蛋白(E1與E2)是表示病毒體的構(gòu)成的結(jié)構(gòu)蛋白。這些結(jié)構(gòu)蛋白是接著非結(jié)構(gòu)性(NS)蛋白，其至少部分是被認(rèn)為是病毒RNA復(fù)制所必須的。
酶活性已被歸因于多種這些NS蛋白。特別是，NS3蛋白含有類似于粘膜疾病病毒與黃病毒的絲氨酸蛋白酶與核苷三磷酸結(jié)合的蝸牛酶的序列。序列排列的分析已預(yù)測(cè)類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶區(qū)存在于黃-、粘膜疾病-、肝-及GB-病毒的N-末端區(qū)域內(nèi)。在黃病毒科病毒的NS3蛋白分解區(qū)間的序列類似性，經(jīng)良好確認(rèn)(Ryan MD等人，1998)。HCV NS3蛋白酶區(qū)在HCV基因型中是共有序列類似性為約77-90％，并與黃病毒科的其他成員的序列類似性為約25-50％，關(guān)于三維結(jié)構(gòu)，各種結(jié)晶的HCV與登革熱NS3蛋白酶的可用原子配位，顯示整體結(jié)構(gòu)，其特征是類胰蛋白酶折疊(Kim等人，1996，Love等人，1996；Murthy等人，1999)。許多研究現(xiàn)已堅(jiān)定地確認(rèn)NS3區(qū)的N-末端部分編碼絲氨酸蛋白酶，其在黃病毒科病毒內(nèi)的多蛋白處理中具有極專一并起關(guān)鍵的作用。在肝炎病毒、粘膜疾病病毒及GB病毒中，多蛋白處理顯示需要下游NS4A蛋白質(zhì)。NS4A蛋白質(zhì)充作加強(qiáng)NS3蛋白酶分裂效率的輔因子(Lin等人，1995；Kim等人，1996；Steinkuler等人，1996)。在黃病毒中，對(duì)于加強(qiáng)NS3蛋白酶活性的必要條件，是通過(guò)上游NS2B蛋白質(zhì)提供。GBV-B與HCV的基因組織與結(jié)構(gòu)是相似的，而不管在GBV-B與HCV的多蛋白序列間的順序類同性為約25至30％的事實(shí)。
在黃病毒科病毒內(nèi)的病毒的表觀類似性下，一般期望發(fā)展有效抵抗黃病毒科病毒的治療劑，而更具體地，是有效抵抗黃病毒科致病成員的治療劑。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的第一方面，是提供一種抗黃病毒科病毒的組合物，其包含結(jié)合式(I)化合物的藥物上可接受的載體，
式(I)其中A是選自C1至C6烷基，與C3至C6環(huán)烷基；及B是選自苯基或噻唑基，這兩者視情況被選自NH(R1)與NH(CO)R1的基團(tuán)取代，其中R1為C1至C6烷基；R為OH或磺酰胺衍生物，或其藥物上可接受的鹽。
在第二方面，本發(fā)明提供一種治療被黃病毒科病毒感染的哺乳動(dòng)物的方法，其包括對(duì)該受感染的哺乳動(dòng)物投予一種藥物組合物，其包含結(jié)合治療上有效量的如上文定義的式(I)化合物的藥物上可接受的載體。
在第三方面，本發(fā)明提供一種治療被黃病毒科病毒感染的哺乳動(dòng)物的方法，其中一種藥物組合物，包含結(jié)合治療上有效量的如上文定義的式(I)化合物的藥物上可接受的載體，與至少一種其他藥劑，選自抗病毒劑、免疫調(diào)節(jié)劑、HCV抑制劑、HIV抑制劑、HAV抑制劑及HBV抑制劑；共同投予受感染的哺乳動(dòng)物。
在第四方面，本發(fā)明是提供一種藥物組合物，用于治療或預(yù)防因黃病毒科病毒所引起的哺乳動(dòng)物感染，其包含結(jié)合治療有效量的式(I)化合物的藥物上可接受的載體，及至少一種選自抗病毒劑、免疫調(diào)節(jié)劑、HCV抑制劑、HIV抑制劑、HAV抑制劑及HBV抑制劑的其他藥劑。
在本發(fā)明的第五方面，提供如上文定義的式(I)化合物在制造用于治療黃病毒科病毒感染的藥劑的用途。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種制造產(chǎn)品，其包含包裝材料，在其中包含一種有效抑制黃病毒科病毒的組合物，且此包裝材料包含標(biāo)簽，其指出該組合物可用于治療因黃病毒科病毒的感染，且其中該組合物包含如上文定義的式(I)化合物。
雖然不希望被任何特定作用模式所束縛，但一般認(rèn)為上文所提出的式(I)所表示的大環(huán)肽化合物族群，在NS3蛋白酶區(qū)中的保持基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)處相互作用。晶體結(jié)構(gòu)研究確認(rèn)本發(fā)明大環(huán)化合物是在HCV NS3區(qū)內(nèi)的基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)處相互作用，其是在黃病毒科病毒中功能性保持的一個(gè)區(qū)。
本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點(diǎn)及特征，在閱讀下述優(yōu)選實(shí)施方案的非限制性描述，并參考附圖與其中的后，將更為明了，其中表的簡(jiǎn)述表4-8是提供黃熱病毒科成員間的序列類似性比較。
附圖簡(jiǎn)述

圖1提供屬于黃病毒科的病毒的多蛋白比較(取自Ryan等人，1998，J.Gen.Virology，79，947-959)；圖2為在HCV基因型與亞型間的NS3蛋白酶區(qū)的序列比較；圖3A-B為根據(jù)式(I)的大環(huán)肽化合物分別抵抗HCV基因型1a與1bNS3-NS4A蛋白酶的IC50曲線；圖4A-B為圖3的大環(huán)肽抵抗HCV基因型1a NS3-NS4A蛋白酶的Dixon與Cornish-Bowden圖形；圖5A-B為圖3大環(huán)肽抵抗HCV基因型1b NS3-NS4A蛋白酶的Dixon與Cornish-Bowden圖形；圖6是說(shuō)明通過(guò)根據(jù)式(I)的大環(huán)肽在在培養(yǎng)物的狨肝細(xì)胞中抑制GBV-B復(fù)制；圖7是以圖示說(shuō)明通過(guò)圖6的大環(huán)肽(III)抑制GBV-B復(fù)制的劑量依賴性；及圖8說(shuō)明與根據(jù)式(I)的大環(huán)肽絡(luò)合的HCV NS3-NS4A肽結(jié)構(gòu)的3-維晶體結(jié)構(gòu)。
發(fā)明詳述定義除非另有指出，否則本文中所使用的科學(xué)與技術(shù)術(shù)語(yǔ)及命名法，均具有和一般熟悉本發(fā)明有關(guān)技術(shù)者平常所明了的相同意義。一般，關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)、感染、分子生物學(xué)方法等程序，是本領(lǐng)域使用的一般方法。這種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可參閱，例如Sambrook等人(1989)與Ausubel等人(1994)的參考手冊(cè)。
“黃病毒科”一詞，在本文中所用的是指稱病毒族時(shí)，是包括肝炎病毒屬的病毒，如C型肝炎，黃病毒屬的病毒，如登革熱病毒、腦炎病毒、西尼羅河腦炎病毒及黃熱病病毒，而粘膜疾病毒屬的病毒，如牛病毒腹瀉病毒與邊緣疾病病毒。G型肝炎病毒(HGV)與GB型肝炎病毒也包含在這種病毒屬中，雖然這些病毒的種屬尚未決定。再者，上述病毒的所有亞型與基因型，也包括在黃病毒科內(nèi)，包括例如HCV 1a、HCV 1b、HCV 2a-c、HCV 3a-b、HCV 4a、HCV 5及HCV 6a，h，d&k以及GBV-A，B&C。
“哺乳動(dòng)物”一詞，當(dāng)其在本文中使用時(shí)，包括容易被黃病毒科病毒感染的人類以及非人類哺乳動(dòng)物，包括家畜動(dòng)物，譬如乳牛、豬、馬、狗與貓及綿羊。
關(guān)于在治療黃病毒科感染中所給予的式(I)化合物，于本文中使用的“C1-6烷基”或“C1-C6”術(shù)語(yǔ)，無(wú)論是單獨(dú)或與另一種取代基結(jié)合，是指含有一至六個(gè)碳原子的非環(huán)狀、直鏈或支鏈烷基取代基，且包括例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔-丁基、己基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基。
于本文中使用的“C3-6環(huán)烷基”一詞，無(wú)論是單獨(dú)或與另一種取代基結(jié)合，是指含有三至六個(gè)碳原子的環(huán)烷基取代基，且包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基及環(huán)己基。
“藥物上可接受的鹽”一詞，是指式(I)化合物的鹽，其在安全可靠的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，是適用于與人類及低等動(dòng)物的組織接觸，而沒(méi)有不適當(dāng)?shù)亩拘?、刺激性、過(guò)敏性應(yīng)答等，伴隨著合理利益/風(fēng)險(xiǎn)比，一般為水溶性或油溶性或可分散性，并對(duì)其所要的用途是有效的。這術(shù)語(yǔ)包括藥物上可接受的酸加成鹽，與藥物上可接受的堿加成鹽。適當(dāng)鹽的明細(xì)表可參閱例如S.M.Birge等人，J.Pharm.Sci.，1977，66，第1-19頁(yè)。
“藥物上可接受的酸加成鹽”一詞，是指保持自由態(tài)堿的生物有效性與性質(zhì)的鹽類，且其在生物學(xué)上或在其他方面沒(méi)有不期望的，與無(wú)機(jī)酸及有機(jī)酸形成的鹽，無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、氨磺酸、硝酸、磷酸等，而有機(jī)酸如醋酸、三氯醋酸、三氟醋酸、己二酸、藻酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、丁酸、樟腦酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、二葡萄糖酸、乙磺酸、谷氨酸、乙醇酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、甲酸、富馬酸、2-羥基乙烷磺酸(羥乙磺酸)、乳酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、苯乙醇酸、1，3，5-三甲苯磺酸、甲烷磺酸、萘磺酸、煙酸、2-萘磺酸、草酸、雙羥萘酸、果膠酯酸、苯基醋酸、3-苯基丙酸、苦味酸、三甲基醋酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、對(duì)-甲苯磺酸、十一烷酸等。
“藥學(xué)上可接受的堿加成鹽”一詞，是指保持自由態(tài)酸的生物有效性與性質(zhì)的鹽類，且其在生物學(xué)上或在其他方面沒(méi)有不期望的，與無(wú)機(jī)堿類形成的鹽，如氨或銨或金屬陽(yáng)離子如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁等的氫氧化物、碳酸鹽或重碳酸鹽。特佳的為銨、鉀、鈉、鈣及鎂鹽。由藥物上可接受的有機(jī)無(wú)毒堿衍生的鹽，包括以下的鹽，伯、仲及叔胺類、季胺化合物，經(jīng)取代的胺，包括天然存在的經(jīng)取代的胺類，環(huán)胺類及堿性離子交換樹(shù)脂，譬如甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、異丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二環(huán)己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡堿、哈胺(hydrabamine)、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基銨化合物、四乙基銨化合物、吡啶、N，N-二甲苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、二環(huán)己基胺、二芐胺、N，N-二芐基苯乙胺、1-二苯羥甲胺、N，N′-二芐基乙二胺、聚胺樹(shù)脂等。特佳的有機(jī)無(wú)毒堿為異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環(huán)己基胺、膽堿及咖啡堿。
在本文中使用的“磺酰胺衍生物”一詞，是指式-NHSO2-R2的磺酰胺基團(tuán)，其中R2為-(C1-8)烷基、-(C3-7)環(huán)烷基或{-(C1-6)烷基-(C3-6)環(huán)烷基}，其全部均視情況被鹵基、氰基、硝基、O-(C1-6)烷基、酰氨基、氨基或苯基取代1至3次，或R2為C6或C10芳基，其是視情況可被鹵基、氰基、硝基、(C1-6)烷基、O-(C1-6)烷基、酰氨基、氨基或苯基取代1至3次。
在本文中使用的“抗病毒劑”一詞，是指一種藥劑(化合物或生物產(chǎn)品)，其有效抑制在哺乳動(dòng)物中病毒的形成及/或復(fù)制。其包括在哺乳動(dòng)物中干擾對(duì)病毒的形成及/或復(fù)制所必須的無(wú)論是宿主或病毒機(jī)制的藥劑?？共《緞┌ɡ缛蚝塑铡⒔饎偼榘?、VX-497(美利美波迪(merimepodib)，Vertex藥物)、VX-498(Vertex藥物)、列弗維林(Levovirin)、維拉嘧啶(Viramidine)、西普連(Ceplene)(美可薩胺(Maxamine))、XTL-001及XTL-002(XTL生物藥物)。
在本文中使用的“免疫調(diào)節(jié)劑”一詞，是指有效提高或加強(qiáng)哺乳動(dòng)物中免疫系統(tǒng)應(yīng)答的藥劑(化合物或生物制劑)。免疫調(diào)節(jié)劑包括例如I類干擾素(譬如α-、β-及ω干擾素，τ-干擾素、同感干擾素及脫唾液酸干擾素)，II類干擾素(譬如γ-干擾素)及經(jīng)PEG化(聚乙二醇化)的干擾素。
在本文中使用的“HCV NS3蛋白酶的抑制劑”一詞，是指一種在哺乳動(dòng)物中有效抑制HCV NS3蛋白酶功能的藥劑(化合物或生物制劑)。HCV NS3蛋白酶的抑制劑包括例如在WO 99/07733、WO 99/07734、WO 00/09558、WO 00/09543或WO 00/59929、WO 03/064416、WO 03/064455、WO 03/064456中所述的化合物，及經(jīng)確認(rèn)為VX-950的Vertex預(yù)先發(fā)展的選擇物。
在本文中使用的“HCV抑制劑”一詞，是指一種在哺乳動(dòng)物中有效抑制HCV的形成及/或復(fù)制的藥劑(化合物或生物制劑)。其包括干擾對(duì)HIV在哺乳動(dòng)物中形成及/或復(fù)制所必要的無(wú)論是宿主或病毒機(jī)制的藥劑。HCV的抑制劑包括例如抑制選自以下標(biāo)的的藥劑NS3蛋白酶、NS3蝸牛酶、HCV聚合酶、NS2/3蛋白酶或IRES。HCV抑制劑的特殊實(shí)例包括ISIS-14803(ISIS醫(yī)藥)。
在本文中使用的“HCV聚合酶的抑制劑”一詞，是指一種在哺乳動(dòng)物中有效抑制HCV聚合酶功能的藥劑(化合物或生物制劑)。其包括例如HCVNS5B聚合酶的抑制劑。HCV聚合酶的抑制劑包括非核苷類，例如在以下所述的化合物·WO 03/010140(Boehringer Ingelheim)，·WO 03/010141(Boehringer Ingelheim)，·WO 03/007945(Boehringer Ingelheim)，-WO 02/100846A1與WO 02/100851 A2(均為Shire)，-WO 01/85172 A1與WO 02/098424 A1(均為GSK)，-WO 00/06529與WO 02/06246 A1(均為Merck)，-WO 01/47883與WO 03/000254(均為日本煙草)，及-EP 1256 628 A2(Agouron)。
再者，HCV聚合酶的其他抑制劑也包括核苷類似物，例如在以下所述的化合物-WO 01/90121 A2(Idenix)，-WO 02/069903 A2(Biocryst醫(yī)藥公司)，及-WO 02/057287 A2與WO 02/057425 A2(均為Merck/Isis)。
HCV聚合酶抑制劑的特殊實(shí)例包括JTK-002/003、JTK-109(日本煙草)及NM283(Idenix)。
在本文中使用的“HIV抑制劑”一詞，是指一種有效抑制HIV在哺乳動(dòng)物中形成及/或復(fù)制的藥劑(化合物或生物制劑)。其包括干擾HIV在哺乳動(dòng)物中對(duì)形成及/或復(fù)制所必要的無(wú)論是宿主或病毒機(jī)制的藥劑。HIV抑制劑包括例如核苷抑制劑、非核苷抑制劑、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑及整合酶抑制劑。
于本文中使用的“HAV抑制劑”一詞，是指一種有效抑制HAV在哺乳動(dòng)物中形成及/或復(fù)制的藥劑(化合物或生物制劑)。其包括干擾對(duì)HAV在哺乳動(dòng)物中形成及/或復(fù)制所必須的無(wú)論是宿主或病毒機(jī)制的藥劑。HAV抑制劑包括A型肝炎疫苗，例如Havrix_(GlaxoSmithKline)、VAQTA_(Merck)及Avaxim_(Aventis Pasteur)。
在本文中使用的“HBV抑制劑”一詞，是指一種有效抑制HBV在哺乳動(dòng)物中形成及/或復(fù)制的藥劑(化合物或生物制劑)。其包括干擾對(duì)HBV在哺乳動(dòng)物中形成及/或復(fù)制所必要的無(wú)論是宿主或病毒機(jī)制的藥劑。HAV抑制劑包括例如抑制HBV病毒DNA聚合酶或HBV疫苗的藥劑。HBV抑制劑的特殊實(shí)例包括拉米五定(lamivudine)(Epivir-HBV_)、德福韋二叔戊酰氧甲酯(Adefovir Dipivoxil)、安替卡伐(Entcavir)、FTC(Coviracil_)、DAPD(DXG)、L-FMAU(Clevudine_)、AM365(Amrad)、Ldt(Telbivudine)、單纈胺-LdC(Valtorcitabine)、ACH-126，443(L-Fd4C)(Achillion)、MCC478(EliLilly)、拉西伐(Racivir)(RCV)、氟-L與D核苷、洛拔塔黃酮(Robustaflavone)、ICN2001-3(ICN)、Bam 205(Novelos)、XTL-001(XTL)、亞氨基-糖類(壬基-DNJ)(Synergy)、HepBzyme；及免疫調(diào)節(jié)劑產(chǎn)物，譬如干擾素α2b、HE2000(Hollis-Eden)、舍拉迪根(Theradigm)(Epimmune)、EHT899(EnzoBiochem)、胸腺素α-1(Zadaxin_)、HBV DNA疫苗(PowderJect)、HBV DNA疫苗(Jefferon中心)、HBV抗原(OraGen)、BayHep B_(Bayer)、Nabi-HB_(Nabi)及抗B型肝炎(Cangene)；及HBV疫苗產(chǎn)物，譬如下列Engerix B、RecombivaxHB、GenHevac B、Hepacare、Bio-HepB、TwinRix、Comvax、Hexavac。
在本文中使用的“I類干擾素”一詞，是指一種選自全部結(jié)合至受體I型的干擾素組的千擾素。其包括天然與合成方式生產(chǎn)的I類干擾素。I類干擾素的實(shí)例包括α-、β-、δ-、ω干擾素、τ-干擾素、同感干擾素、非唾液酸干擾素。
在本文中使用的“II類干擾素”一詞，是指一種選自全部結(jié)合至受體II型的干擾素組的干擾素。II類干擾素的實(shí)例包括γ-干擾素。
再者，“治療上有效量”一詞，是當(dāng)其以式I化合物在本文中使用時(shí)，是指有效治療黃病毒科病毒感染的化合物的量，即抑制或至少減少病毒復(fù)制，而不是對(duì)被治療哺乳動(dòng)物具有有毒的量，或在其他方面在哺乳動(dòng)物中具有造成顯著不利作用的量。
“載體”一詞是指用于結(jié)合本發(fā)明治療化合物的化合物或化合物的混合物，其有助于其投藥及/或加強(qiáng)治療化合物抑制黃病毒科病毒的功能，包括例如稀釋劑、賦形劑、佐劑及媒劑。穩(wěn)定劑、著色劑、調(diào)味劑、抗微生物劑等，也可與治療化合物結(jié)合。再者，在一些情況下，制劑的pH值可以用藥物上可接受的酸、堿或緩沖劑進(jìn)行調(diào)整，以提高配制化合物或其輸送形式的穩(wěn)定性。其他適當(dāng)添加劑包括熟識(shí)本領(lǐng)域技術(shù)中用以改良本發(fā)明組合物的特征，而對(duì)其功能沒(méi)有不利影響的。關(guān)于適合與本發(fā)明治療化合物混合的載體可參考“Remington氏醫(yī)藥科學(xué)”，第17版，Mack出版公司，Easton Penn.，1985?！八帉W(xué)上可接受”一詞，是當(dāng)其在本文中以載體化合物使用時(shí)，表示該載體適于投予哺乳動(dòng)物，即當(dāng)以適當(dāng)作為載體的量使用時(shí)為無(wú)毒性，且不會(huì)引起任何不利的作用。
優(yōu)選實(shí)施方案抗黃病毒科病毒組合物在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，是提供一種有效治療被黃病毒科病毒感染的哺乳動(dòng)物的組合物。這組合物包含結(jié)合使用式(I)化合物的藥物上可接受的載體 式(I)其中
A是選自C1至C6烷基，與C3至C6環(huán)烷基；及B是選自苯基或噻唑基，這兩者視情況可被選自NH(R1)與NH(CO)R1的基團(tuán)取代，其中R1為C1至C6烷基；R為OH或磺酰胺衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在一實(shí)施方案中，式(I)的A為支鏈的C4至C6烷基或C4至C6環(huán)烷基。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，A為環(huán)戊基或叔-丁基。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，式(I)的B為在2位被NH(R1)或NH(CO)R1取代的苯基或噻唑，其中R1為C1至C4烷基。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，B為在2位被NH(R1)或NH(CO)R1取代的噻唑，其中R1為C1至C4烷基。更優(yōu)選的B為于2位被NH(CO)CH3或被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑。
在再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，式(I)的R是OH或式-NHSO2-R2的磺酰胺基，其中R2是-(C1-6)烷基、-(C3-6)環(huán)烷基。兩者任選地可被鹵素或苯基取代1或2次，或R2是視情況可被鹵素或(C1-6)烷基取代1或2次。更優(yōu)選地，R是OH或磺酰胺基，其中R2是甲基、環(huán)丙基或苯基。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明是以式(I)化合物進(jìn)行，其中A為叔-丁基，且B為苯基，如下式(II)化合物所示 在另一更佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明是以式(I)化合物進(jìn)行，其中A為叔-丁基，且B為在其2位上被NH(CO)CH3取代的4-噻唑，如下式(III)化合物所示
在一項(xiàng)最佳實(shí)施方案中，本發(fā)明是以式(I)化合物進(jìn)行，其中A為環(huán)戊基，且B為在其2位上被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑，如下式(IV)化合物所示 在最佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明是以式(I)化合物進(jìn)行，其中A是環(huán)戊基，且B是在其2位上被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑，且R是磺酰氨基，其中R2是苯基，如下式(VI)化合物所示 在最佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明是以式(I)化合物進(jìn)行，其中A是環(huán)戊基，B是在其2位上被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑，且R是磺酰氨基，其中R2是甲基，如下式(VII)化合物所示
在最佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明是以式(I)化合物進(jìn)行，其中A是環(huán)戊基，B是在其2位上被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑，且R是磺酰氨基，其中R2是環(huán)丙基，如下式(VIII)化合物所示 治療方法在本發(fā)明的第二方面，是提供一種用于治療被黃病毒科病毒感染的哺乳動(dòng)物的方法，其包括對(duì)受感染的哺乳動(dòng)物給予一種藥物組合物，其包含結(jié)合使用治療上有效量的具有如上文定義的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物的藥學(xué)上可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明的方法，是將治療上有效量的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物投予被黃病毒科病毒感染的哺乳動(dòng)物。為治療上有效，對(duì)受感染的哺乳動(dòng)物給予每天約0.01與約100毫克/公斤體重之間，優(yōu)選每天約0.1與約50毫克/公斤體重間的化合物劑量。通常，該方法涉及化合物的投藥，其量為每天約1至約5次，或者，以連續(xù)灌注方式。這種投藥可作為慢性或急性療法使用。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，可以需要比上文所列的較低或較高的劑量。特定劑量與治療服用法是決定于多種因素，包括所采用的特定化合物的活性，受感染哺乳動(dòng)物的年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別及飲食，投藥時(shí)間、排泄速率、感染的嚴(yán)重性與過(guò)程、患者對(duì)感染的傾向及治療醫(yī)師的判斷。一般而言，治療是以實(shí)質(zhì)上低于該肽最適宜劑量的更小劑量起始。然后，通過(guò)以小增量而增加劑量，直到在這種情況下達(dá)到最適宜效果為止。一般而言，這化合物最好以一般性提供治療作用而不會(huì)造成任何傷害或有害副作用的濃度含量進(jìn)行投藥。
治療化合物在治療黃病毒科病毒感染上的投藥，可通過(guò)多種途徑中的任一種，包括口服、非經(jīng)腸或經(jīng)由植入的儲(chǔ)器進(jìn)行投藥。在本文中使用的“非經(jīng)腸”一詞，包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)及病灶內(nèi)注射或灌注技術(shù)。口服投藥或通過(guò)注射投藥是優(yōu)選的?？诜山邮艿膭┝啃问桨ǖ幌抻谀z囊、片劑及含水懸浮液與溶液。
如上所述，式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物是與一種或多種藥物上可接受的載體組合投藥。載體的性質(zhì)當(dāng)然是隨著劑量形式而改變。因此，在供口服使用的片劑情況中，常用的載劑包括乳糖與玉米淀粉。一般地添加潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂。對(duì)于以膠囊形式進(jìn)行口服投藥，可使用的稀釋劑包括乳糖與干燥的玉米淀粉。當(dāng)含水懸浮液以口服方式投予時(shí)，將活性成份與乳化劑及懸浮劑組合。若需要，可添加某些增甜劑及/或調(diào)味劑及/或著色劑。可注射制劑，包括可注射水性或油性懸浮液，是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)，使用適當(dāng)分散劑或潤(rùn)濕劑，如Tween 80與懸浮劑進(jìn)行調(diào)配。
與載劑物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一劑量形式的本發(fā)明治療化合物的量是隨著待治療的宿主及特定投藥模式而改變。典型制劑是含有約5％至約95％的治療化合物(w/w)。這種制劑優(yōu)選是含有約20％至約80％治療化合物。
在另一方面，組合療法是使其中式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物或藥物上可接受的鹽是與至少一種其他藥劑共同投藥，其它藥劑選自抗病毒劑、免疫調(diào)節(jié)劑、HCV抑制劑、HIV抑制劑、HAV抑制劑、HBV抑制劑及有效治療病毒感染病征的治療劑。這種藥劑的實(shí)例是為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的。這些其他藥劑可與本發(fā)明化合物組合以產(chǎn)生單一藥物劑型?；蛘?，這些其他藥劑可分開(kāi)投予受感染病患者，作為多重劑型的一部分，例如使用套件。這種其他藥劑可在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)治療化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽投藥之前、同時(shí)或之后投予病患者。
當(dāng)使用組合療法時(shí)，本發(fā)明化合物與其他治療及/或預(yù)防劑兩者，在單次治療服用法中正常投藥的劑量以約10至100％之間，且更優(yōu)選為約10與80％間的劑量程度下存在。
制造制品于本發(fā)明的另一方面，是提供一種制造制品，其包含包裝材料，其中包含一種有效治療被黃病毒科病毒感染的哺乳動(dòng)物的組合物，且此包裝材料包含有標(biāo)簽，其指示該組合物可用以治療被黃病毒科病毒的感染，其中該組合物包含如上文定義的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物。
黃病毒科病毒特別是，本發(fā)明的不同實(shí)施方案可針對(duì)不同病毒，特別是在哺乳動(dòng)物中致病的病毒。優(yōu)選的是，上文所提及的組合物的化合物可用于治療肝病毒屬，譬如C型肝炎。HCV病毒的優(yōu)選實(shí)例是選自以下基因型1、2、3、4、5及6。HCV病毒的更佳實(shí)例是選自基因型2、3、4、5及6。優(yōu)選地，HCV病毒選自亞型HCV 1a、HCV 1b、HCV 2a-c、HCV 3a-b、HCV 4a、HCV 5及HCV 6a，h，d&k。更佳的HCV病毒選自亞型HCV 1a，HCV 2a-c、HCV 3a-b、HCV 4a、HCV 5及HCV 6a，h，d&k。
或者，本發(fā)明化合物可針對(duì)抵抗黃病毒屬的病毒。如登革熱病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河腦炎病毒及黃熱病病毒。本發(fā)明優(yōu)選是針對(duì)在人類中因登革熱病毒所造成病毒疾病的治療。本發(fā)明優(yōu)選是針對(duì)在人類中因日本腦炎病毒所造成病毒疾病的治療?；蛘撸景l(fā)明是針對(duì)在人類中因黃熱病病毒所造成的病毒疾病的治療?；蛘?，本發(fā)明是針對(duì)在人類中因西尼羅河腦炎病毒所造成的病毒疾病的治療。
此外，本發(fā)明可針對(duì)因粘膜疾病病毒屬的病毒所造成的病毒疾病的治療，譬如牛病毒腹瀉病毒(BVDV)、經(jīng)典豬熱病毒(CSFV)及邊緣疾病病毒(BDV)。本發(fā)明優(yōu)選是針對(duì)在牛中因BVDV所造成病毒疾病的治療?；蛘?，本發(fā)明是針對(duì)在豬中因CSFV所造成病毒疾病的治療?；蛘?，本發(fā)明是針對(duì)在綿羊中因BDV所造成病毒疾病的治療。
再者，GB病毒也可用本發(fā)明組合物治療。包含在這病毒屬中的是G型肝炎病毒(HGV)與GB型肝炎病毒。優(yōu)選實(shí)例是選自GBV-A，B&C。本發(fā)明優(yōu)選是針對(duì)在人類中因GBV-C所引起病毒疾病的治療?；蛘?，本發(fā)明是針對(duì)在人類中因GBV-A所引起的病毒疾病的治療?；蛘?，本發(fā)明是針對(duì)在人類中因HGV所引起的病毒疾病的治療。
本發(fā)明的實(shí)施方案以下述具體實(shí)施例例舉，其并不解釋為對(duì)其限制。
實(shí)施例在實(shí)施例中所用的略語(yǔ)有Abu氨基丁酸；DABCYL4-((4-二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸；DMEMDulbecco改性Eagle培養(yǎng)基；DMSO二甲砜；EDANS5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸；HPLC高效液體色譜；IPTG異丙基-b-D-硫代半乳糖苷；LBLuria-Bertoni(如LB肉湯)Nva正纈氨酸；Penstrep青霉素/鏈霉素；PCR聚合酶鏈反應(yīng)；r.m.s均方根；RT-PCR聚合酶鏈反應(yīng)的真實(shí)時(shí)間；和TCEP三(2-羧乙基)膦氯化氫。
式(I)化合物的合成式(I)化合物是使用在2000年10月12日公告的WO 00/059929中所詳述的方案制備。特別是，參考第89頁(yè)實(shí)施例34C關(guān)于化合物(IV)的制備。
實(shí)施例1-通過(guò)化合物II、III及IV抑制不同基因型的HCV NS3-NS4A蛋白酶HCV NS3/4A 1a與1b為生產(chǎn)HCV基因型1b NS3-NS4A異種二聚體蛋白質(zhì)，通過(guò)RT-PCR，使用由感染個(gè)人血清的HCV基因型1b提取的RNA(由Bemard Willems博士提供，Hopital St-Luc，Montreal，Canada)，克隆全長(zhǎng)HCV cDNA。編碼NS3-NS4A異種二聚體蛋白質(zhì)的DNA區(qū)，由全長(zhǎng)HCV cDNA進(jìn)行PCR-放大(正向引物′CTCGGATCCGGCGCCCATCACGGCCTAC3′f序列ID.No1)；逆向引物5′CTCTCTAGATCAGCACTCTTCCATTTCATCGAA3′(序列ID No2))，并亞克隆為pFastBacTMHTa桿狀病毒表達(dá)載體(Gibco/BRL)。對(duì)HCV基因型1a，編碼NS3-NS4A異種二聚體蛋白質(zhì)的DNA，是由HCV基因型1a菌種H77(由ViroPharma公司提供，Exton，PA，US)進(jìn)行PCR-放大(正向引物5′CTCTCTAGATCAGCACTCTTCCATTTCATCGAACTC3′(序列ID No3)；逆向引物5′CTCGGATCCGGCGCCCATCACGGCCTACTCCCAA3′(序列IDNo4))，并如上述進(jìn)行亞克隆?？寺∵M(jìn)pFastBacTMTHa桿狀病毒表達(dá)載體中，產(chǎn)生一種含有包含六組氨酸標(biāo)記與rTEV蛋白酶分裂位點(diǎn)的另一個(gè)N-末端28個(gè)殘基的重組融合蛋白質(zhì)。使用Bac-to-BacTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Gibco/BRL)以產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)表達(dá)的重組桿狀病毒。
His-標(biāo)記的NS3-NS4A異種二聚體蛋白酶是通過(guò)以重組體桿狀病毒，在感染的多重性為0.1-0.2下，于27℃下，在106個(gè)細(xì)胞/毫升的密度下，感染Sf21昆蟲(chóng)細(xì)胞(Invitrogen)，而進(jìn)行表達(dá)的。48至64小時(shí)后，通過(guò)離心分離，在4℃下采集受感染培養(yǎng)物。使細(xì)胞沉淀物在50mM磷酸鈉，pH7.5，40％甘油(w/v)，2mMβ-巰基乙醇中均化。然后，以1.5％NP-40，0.5％Triton X-100，0.5M NaCl從細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，萃取His-NS3-NS4A異種二聚體蛋白酶及DNase處理。在超離心分離(100,000x克，30分鐘，在4℃下)后，使可溶性萃取物在50mM NaPO4，pH7.5，0.5M NaCl中稀釋4-倍，并裝載在Pharmacia Hi-TrapNi+2-螯合柱中。His-NS3-NS4A異種二聚體蛋白質(zhì)，使用在50mM磷酸鈉，pH7.5，10％(w/v)甘油，0.1％NP-40，0.5M NaCl中制備的50至400mM咪唑梯度液洗脫。成熟NS3與NS4A蛋白質(zhì)絡(luò)合物的共純化，是通過(guò)經(jīng)純化蛋白質(zhì)的Western氏斑點(diǎn)分析，使用內(nèi)部(inhouse)產(chǎn)生的抗-NS3與抗-NS4A抗血清證實(shí)。
使用純化的NS3蛋白酶區(qū)與肽H2N-PDREVLYREFDEMEEC-OH(序列ID No5)，以使兔子免疫，用于產(chǎn)生分別對(duì)NS3與NS4A專一的抗血清。兩種蛋白質(zhì)的適當(dāng)N-末端氨基酸，是通過(guò)N-末端氨基酸定序(PE Biosystems491/491C Procise定序器)確認(rèn)。純化的酶是在-80℃下，儲(chǔ)存在50mM磷酸鈉，pH7.5，10％(w/v)甘油，0.5M NaCl，0.25M咪唑，0.1％NP-40中。
HCV NS3/4A 2b與3aHCV基因型2b與3a的NS3-NS4蛋白酶基因是由HCV-感染病患者的臨床試樣分離的RNA，使用RT-PCR放大，該試樣得自G.Steimann博士(德國(guó))。用于RT-PCR的引物為5′CTCGGATCCGGCTCCCATTACTGCTTAC3′(序列IDNo6)作為正向引物，而5′GACGCGTCGACGCGGCCGCTCAGCACTCTTCCATTTCACTGAA3′(序列ID No7)作為逆向引物，用于HCV基因型2b的NS3-NS4A，及5′CTCGGATCGGGCCCCGATCACAGCATACGCC3′(序列IDNo8)作為正向引物，而5′CACCGCTCGAGTCAGCATTCTTCCATCTCATCATATTGTTG3′(序列ID No9)作為逆向引物，用于HCV基因型3a。各引物含有用于在細(xì)菌表達(dá)載體pET11a中克隆片段的獨(dú)特限制位點(diǎn)?？寺∵M(jìn)載體中產(chǎn)生一種含有另一種包含六組氨酸標(biāo)記與rTEV蛋白酶分裂位點(diǎn)的N-末端28個(gè)殘基的重組體融合蛋白質(zhì)。這重組體質(zhì)粒是用于轉(zhuǎn)變菌株BL21 DE3 pLysS以使蛋白質(zhì)表達(dá)，而重組體蛋白質(zhì)表達(dá)是通過(guò)添加IPTG而誘導(dǎo)的。在表達(dá)后，細(xì)胞是通過(guò)離心，在4℃下收集，并使細(xì)胞沉淀溶解于含有50mM磷酸鈉，0.5M NaCl，40％甘油，1.5％NP-40，0.5％Triton X-100的緩沖劑中，并使可溶性蛋白質(zhì)部分通過(guò)上述的5毫升HiTrap螯合親和柱。聚(U)-瓊脂糖純化步驟可視情況進(jìn)行，以移除降解產(chǎn)物與污染物。
活體外HCV NS3蛋白酶檢測(cè)用以評(píng)估HCV 1a，1b，2b，2a-c及3a NS3-NS4A異種二聚體蛋白質(zhì)的蛋白酶活性的抑制的螢光原縮肽(depsipeptide)基質(zhì)，為氨茴基-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO2)TW-OH(序列ID No10)。這基質(zhì)是在氨基丁酸(Abu)與丙氨酸殘基之間分裂。序列DDIVPAbu-AMYTW(序列ID No11)是由相應(yīng)于NS5A/NS5B天然分裂位點(diǎn)的序列DDIVPC-SMSYTW(序列ID No12)所衍生。在位點(diǎn)P1引入氨基丁酸殘基，會(huì)造成N-末端產(chǎn)物抑制作用的顯著降低，而刪除位點(diǎn)P3的絲氨酸殘基會(huì)改良內(nèi)部淬滅效率。蛋白酶活性是在50mM Tris-HCl，pH8.0，0.25M檸檬酸鈉，0.01％正-十二基-β-D-麥芽苷，1mM TCEP中檢測(cè)。這檢測(cè)是在Microfluor_2白色U-底部Microtiter_板中進(jìn)行。將5μM基質(zhì)與不同濃度的待測(cè)化合物，和1.5nM HCV1a或1b NS3-NS4A異種二聚體蛋白質(zhì)，在23℃下，于溫和攪拌下，一起培養(yǎng)45分鐘。最后DMSO含量不超過(guò)5.25％。通過(guò)在pH5.8下添加1M2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸溶液，而使反應(yīng)終止。
螢光是以320毫微米的激發(fā)濾光器，與405毫微米的發(fā)射濾光器使用BMG POLARstar Galaxy 96-孔板讀取器監(jiān)測(cè)。含有待測(cè)化合物的各孔的抑制程度(％抑制)，是以下列方程式(FU＝螢光單位)計(jì)算而得 然后，使用所計(jì)算的％抑制值，通過(guò)SAS的非線性回歸例行NLIN程序，使用下列方程式，而測(cè)定IC50、斜率因數(shù)(n)及最大抑制(Imax) 抑制常數(shù)(Ki)測(cè)定與抑制模式使用螢光原縮肽基質(zhì)氨茴基-D(d)EIVP-Nva[C(O)-O]AMY(3-NO2)TW-OH(序列ID No13)，以評(píng)估化合物(IV)對(duì)HCV NS3-NS4A蛋白酶的抑制機(jī)制與抑制常數(shù)。它是在正纈氨酸與丙氨酸殘基之間分裂?；|(zhì)工作溶液是在DMSO中，在200μM濃度下，由基質(zhì)儲(chǔ)備溶液(2mM，在DMSO中，儲(chǔ)存于-20℃下)制備。在檢測(cè)中的最后基質(zhì)濃度，是從0.25改變至8μM?；衔?IV)的抑制常數(shù)(Ki)，是使用穩(wěn)定態(tài)速度方法(Morrisson等人，1985)測(cè)定。蛋白酶活性是通過(guò)使用SLM-AMINCO 8100分光螢光計(jì)(在325毫微米下發(fā)射，及在420毫微米下激發(fā))監(jiān)視和內(nèi)部淬滅螢光原基質(zhì)分裂有關(guān)的螢光變化而測(cè)得。分裂反應(yīng)是在0.25至8μM基質(zhì)，0.3nM HCV 1a或1b NS3-NS4A異種二聚體蛋白質(zhì)，及待測(cè)化合物IV在50mM Tris-HCl，pH8.0，0.25M檸檬酸鈉，0.01％正-十二基-β-D-麥芽苷，1mM TCEP中的不同濃度存在下進(jìn)行監(jiān)測(cè)。抑制HCV基因型1a與1b NS3-NS4A異種二聚體蛋白酶的穩(wěn)定狀態(tài)分析，是使用Dixon與Cornish-Bowden圖解方法進(jìn)行。在Dixon圖解方法中，是將速度倒數(shù)1/V對(duì)待測(cè)化合物濃度，在數(shù)種基質(zhì)濃度(S)下進(jìn)行作圖。在Cornish-Bowden圖解方法中，是將比例S/V對(duì)待測(cè)化合物濃度，在數(shù)種S濃度下進(jìn)行作圖。對(duì)兩種方法，點(diǎn)在各S值下是位于直線上。對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性待測(cè)化合物，Dixon圖形顯示在不同S值下的直線，相交在單一點(diǎn)上，而Cornish-Bowden圖形顯示在不同S值下的平行線。通過(guò)將數(shù)據(jù)配合至描述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的方程式中，而估計(jì)KiV=kcat·[E]·[S]Km·(1+[I]/Ki)+[S]]]>HCV NS3蛋白酶的抑制HCV基因型1a，1b，2b，2a-c及3a NS3/NS4A異種二聚體蛋白酶的活性，是在有化合物(IV)存在下，使用活體外的酶催螢光原檢測(cè)進(jìn)行測(cè)定。IC50曲線是單個(gè)地通過(guò)SAS NLIN程序進(jìn)行分析。對(duì)HCV1a NS3-NS4A蛋白酶，平均IC50值4.3nM是由兩批化合物(IV)的分析得到。平均IC50值3.4nM是在有HCV 1b NS3-NS4A蛋白酶存在下，由兩批化合物(IV)的分析而得到。
表1不同NS3蛋白酶抑制劑在不同基因型的HCV中的IC50

n/d＝未進(jìn)行圖3a與3b是分別說(shuō)明化合物(IV)對(duì)HCV 1a與1b NS3-NS4A蛋白酶的IC50曲線。
在以GraFit將數(shù)據(jù)配合至描述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的方程式后，并也由Dixon與Cornish-Bowden圖解方法，發(fā)現(xiàn)化合物(IV)是一種HCV基因型1a與1bNS3-NS4A蛋白酶的競(jìng)爭(zhēng)性待測(cè)化合物。對(duì)兩種HCV基因型酶，Dixon圖形顯示在不同S值下的直線是在一個(gè)點(diǎn)處相交，然而Cornish-Bowden圖形顯示在不同S值下的平行線。對(duì)化合物(IV)，以HCV基因型1a NS3-NS4A蛋白酶由穩(wěn)定狀態(tài)速度分析，獲得0.30nM的Ki，而0.66nM的Ki是以HCV基因型1b NS3-NS4A蛋白酶而獲得，90nM、86nM及83nM的Ki，是分別以HCV基因型3a、2a-c及2b獲得。圖4與5是化合物(IV)的分別對(duì)HCV基因型1a與1b NS3-NS4A蛋白酶的Dixon與Cornish-Bowden圖形。
實(shí)施例2-HCV復(fù)制子1a及/或1b的抑制細(xì)胞基的HCV 1a與1b RNA復(fù)制子檢測(cè)HCV RNA復(fù)制是在含HCV 1a與1b復(fù)制子的Huh-7-衍生的細(xì)胞系中證實(shí)，該細(xì)胞系是在Boehringer Ingelheim(Canada)公司，R&D處發(fā)展(WO02/052015)。這些細(xì)胞是用于對(duì)測(cè)試候選待測(cè)化合物建立敏感性HCV RNA復(fù)制細(xì)胞基的檢測(cè)。
穩(wěn)定保持亞基因組HCV復(fù)制子的Hun7細(xì)胞，是如以前所述進(jìn)行建立(Lohman等人，1999；WO 02/052015)。將這些細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)物群集體中，在每孔1×104個(gè)細(xì)胞下，在補(bǔ)充有10％FBS，PenStrep(生命技術(shù))與1微克/毫升基因素的DMEM中。細(xì)胞是在5％CO2培養(yǎng)器中，于37℃下培養(yǎng)，直到添加不同濃度的待測(cè)化合物為止。
按下述制備待測(cè)化合物，以用于檢測(cè)。添加100％DMSO中的待測(cè)化合物，在檢測(cè)培養(yǎng)基中稀釋，以提供最后DMSO濃度為0.5％，并將此溶液用聲處理15分鐘，并經(jīng)過(guò)0.22微米微孔濾器單元過(guò)濾。使用檢測(cè)培養(yǎng)基(含有0.5％DMSO)制備待測(cè)化合物的系列稀釋液。
將細(xì)胞培養(yǎng)基由含有細(xì)胞的96-孔板吸出，并將待測(cè)化合物在檢測(cè)培養(yǎng)基中的適當(dāng)稀釋液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)板的單獨(dú)的井中，將其在37℃下，以5％CO2培養(yǎng)。
在3天培養(yǎng)期后，將細(xì)胞以PBS洗滌，并以由Qiagen得到的RNeasy Minikit_與Qiashredder_，萃取全部細(xì)胞RNA。將得自各孔的RNA在50微升H2O中淋洗。RNA是通過(guò)光密度，在260毫微米下，于Cary 1E UV-可見(jiàn)分光光度計(jì)上定量。HCV RNA復(fù)制子拷貝數(shù)目是通過(guò)即時(shí)RT-PCR，使用AbiPrism_7700序列檢測(cè)系統(tǒng)評(píng)估。TAQMAN EZ RT-PCR組件提供用于檢測(cè)與分析RNA的系統(tǒng)。以沒(méi)有下游處理的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)產(chǎn)物的直接檢測(cè)，是通過(guò)監(jiān)測(cè)染料標(biāo)識(shí)的DNA探針的螢光的增加而完成。引物與探測(cè)劑的核苷酸序列，是位于HCV基因組的5′區(qū)域。然后，使用以在相同反應(yīng)混合物中檢測(cè)的已知量的復(fù)制子拷貝(經(jīng)補(bǔ)充50毫微克野生型Huh-7RNA)，所制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)估復(fù)制子拷貝數(shù)目。下述熱循環(huán)參數(shù)是用于在ABI Prism7700序列檢測(cè)系統(tǒng)上的RT-PCR反應(yīng)。條件是對(duì)HCV檢測(cè)是最佳化。定量是基于閥值循環(huán)，其中放大圖形是橫越界定的螢光閥值。閥值循環(huán)的比較是提供在不同試樣中相對(duì)模板濃度的高度敏感性量度。當(dāng)PCR限度在其最高時(shí)在早期循環(huán)期間的監(jiān)測(cè)，提供正確定量的精確數(shù)據(jù)。相對(duì)模板濃度可利用HCV的標(biāo)準(zhǔn)曲線與已知拷貝數(shù)目，而轉(zhuǎn)化成實(shí)數(shù)。
以SAS的NLIN程序配合的EC50曲線含有待測(cè)化合物的各孔的抑制程度(％抑制)是以下列方程式(CN-HCV復(fù)制子拷貝數(shù)目)計(jì)算而得

然后，使用所計(jì)算的％抑制值，通過(guò)SAS的非線性回歸例行NLIN程序，使用下列方程式，以測(cè)定EC50、斜率因數(shù)(n)及最大抑制(Imax)

表2不同NS3蛋白酶抑制劑在不同基因型的HCV中的EC50(nM)

在HCV復(fù)制子細(xì)胞基的檢測(cè)中，化合物(IV)顯示使用基因型1a與1b的含HCV復(fù)制子細(xì)胞，分別以EC50為2.1nM與1nM的HCV RNA復(fù)制的劑量依存性抑制。在濃度高于1000nM下，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性。這些結(jié)果顯示化合物(II、III、IV、VI、VII和VIII)是細(xì)胞基的HCV RNA復(fù)制的有效且專一的抑制劑?；衔颲是不同類的化合物但結(jié)構(gòu)上相關(guān)，并且抵抗NS3蛋白酶也具有活性但效力較差。這化合物在以下將用作對(duì)比以比較抑制活性程度。化合物VI、VII與VIII具有下式結(jié)構(gòu) 合物化(VI) 化合物(VII) 化合物(VIII)
實(shí)施例3 GBV-B NS3/4A蛋白酶通過(guò)化合物II、III與IV的抑制GBV-B NS3/NS4A蛋白酶的克隆全長(zhǎng)GBV-B NS3/NS4A蛋白酶基因是由受感染狨血清中分離。全部RNA是使用Qiangen_病毒RNA萃取組件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，從血清分離。用于反轉(zhuǎn)錄酶的引物與PCR反應(yīng)的選擇，是基于已發(fā)表的序列(Muerhoff，A.S等人，1995)及基因庫(kù)登記號(hào)U22304(正向5′CGCATATGGCACCTTTTACGCTGCAGTGTC3′(序列ID No.14)；逆向5′CGCGCGCTCGAGACACTCCTCCACGATTTCTTTC3′(序列ID NO.15))進(jìn)行選擇。使放大的RT-PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)含多組氨酸標(biāo)記的介于Ndel與Xhol位點(diǎn)之間的pET-29質(zhì)粒中。此構(gòu)建物產(chǎn)生一種在其C-末端具有多His標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)。使質(zhì)粒轉(zhuǎn)變成BL21 DE3 pLysS，以用于蛋白質(zhì)表達(dá)。
使大腸桿菌克隆pGBV-B在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至細(xì)胞密度(OD600)為0.6，這時(shí)在0.2mM的濃度下添加IPTG。這誘導(dǎo)期是在23℃下進(jìn)行4小時(shí)。GBV-BNS3/NS4A-His蛋白質(zhì)，是根據(jù)Zhong等人，1999所述的程序純化。使可溶性部分在Pharmacia_Hi-Trap Ni+2-螯合親和柱上，使用50至400mM咪唑梯度液進(jìn)行純化。接著這步驟是在Superdex200凝膠過(guò)濾柱上的蛋白質(zhì)制劑的色層。蛋白質(zhì)制劑的濃度通過(guò)Bradford蛋白質(zhì)檢測(cè)進(jìn)行測(cè)定。
活體外GBV-B NS3蛋白酶檢測(cè)用以評(píng)估GBV-B NS3-NS4A異種二聚體蛋白質(zhì)的蛋白酶活性的抑制的縮肽基質(zhì)，是Ac-DED(EDANS)EE-Abu[C(O)-O]ASK(DABCYL)-NH2(序列IDNo.16)。這基質(zhì)是在氨基丁酸(Abu)和丙氨酸殘基之間分裂，且反應(yīng)的產(chǎn)物是通過(guò)HPLC分析。蛋白酶活性是在50mM Tris-HCl，pH8.0，0.25M檸檬酸鈉，0.01％正-十二基-β-D-麥芽苷，1mM TCEP中檢測(cè)。檢測(cè)是在Microfluor_2白色U-底部Microtiter_板中進(jìn)行。使5μM基質(zhì)與不同濃度的待測(cè)化合物，以0.4nM GBV-B NS3-NS4A異種二聚體蛋白質(zhì)，在23℃下，在溫和攪拌下培養(yǎng)2小時(shí)。最后DMSO含量不超過(guò)5.25％。通過(guò)添加1M 2-[N-嗎啉基]乙磺酸溶液，在pH5.8下，使反應(yīng)終止。為進(jìn)行定量，將分裂產(chǎn)物與基質(zhì)通過(guò)在Perkin-Elmer 3×3CR C8柱上的HPLC分離。分離是以下述方式進(jìn)行，首先以3.5毫升/分鐘下，用含有0.05％磷酸與3mM SOD的水溶液進(jìn)行洗脫。然后，將在0.05％磷酸中的0至45％乙腈的線性梯度液，施加10分鐘。在210毫微米下檢測(cè)吸光率。
這檢測(cè)是在待測(cè)化合物II、III、IV及V存在下進(jìn)行。在有GBV-B NS3-4A蛋白質(zhì)存在下，對(duì)各待測(cè)化合物獲得的IC50，示于表3中。
表3

化合物V為結(jié)構(gòu)上相關(guān)的不同類的化合物，且也具有抵抗NS3蛋白酶的活性，但比化合物II、III與IV的活性較低。包括這化合物，以證實(shí)化合物II、III與IV的活性等級(jí)，是保持在HCV與GBV-B之間。
在培養(yǎng)物中的狨肝細(xì)胞中抑制GBV-B復(fù)制將從未被感染的狨分離的肝細(xì)胞保持在確定成分培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中數(shù)天。該細(xì)胞培養(yǎng)模式是如Beames等人，2000所述。在平板培養(yǎng)后三天，使細(xì)胞以含有GBV-B的血漿感染。于病毒吸附后，移除病毒，并使細(xì)胞于候選待測(cè)化合物以10μM濃度存在與不存在的情況下培養(yǎng)。感染后7天采集細(xì)胞。GBV-B RNA的含量，是由全部細(xì)胞RNA，通過(guò)使用所識(shí)別部分GBV-B殼體基因的引物-探針組合物的快速PCR檢測(cè)進(jìn)行定量(Beames等人，2000)。
盡管在這酶檢測(cè)中獲得較低的IC50，示于圖6的結(jié)果顯示當(dāng)細(xì)胞在有化合物III存在下培養(yǎng)時(shí)，觀察到在病毒RNA含量上超過(guò)3-對(duì)數(shù)的降低，而在有化合物V存在下為2-對(duì)數(shù)的降低(當(dāng)該結(jié)果以g.e(基因組當(dāng)量)/微克RNA表示時(shí))。以這種更具有代表性病毒復(fù)制檢測(cè)所獲得的結(jié)果，證實(shí)這些化合物是有效抗病毒劑，以降低GBV-B病毒產(chǎn)生。
實(shí)施例4-在黃病毒科內(nèi)的NS3蛋白酶的序列比較由病毒的黃病毒科的其他病毒的蛋白酶序列，是由BLAST分析(Altschul等人，1997)NCBI，接著分類學(xué)報(bào)告而得到。蛋白酶序列的研究是使用特定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，將回收具有類似于HCV蛋白酶的所有黃病毒科序列，但排除HCV順序本身。當(dāng)可能時(shí)，得自NCBI的“NP_”的序列是用于表示有關(guān)病毒的特定組，因?yàn)檫@些“NP_”序列是“參考”序列(RefSeq)。再者，在不知道時(shí)，對(duì)蛋白酶的NS3N-末端與C-末端是由類似于HCV NS3蛋白酶測(cè)得。
對(duì)六種抵抗不同病毒組的HCV菌株的蛋白酶的序列排列，是使用基于CLUSTALW的ALIGNX(VectorNTI_)(Thompson，JD等人，1994)進(jìn)行。
由這些排列，類似性的百分比是在所有單個(gè)序列之間計(jì)算，并表示于表4-8中。類似性是基于下列氨基酸；[ILVM]、[FWY]、[KR]、[DE]、[GA]、[NQ]、[ST]。
表4表示HCV的數(shù)種基因型與亞型間的同一性與類似性。人們可見(jiàn)其同一性范圍在70％與89％之間，而類似性范圍在77％與95％之間，這證實(shí)NS3蛋白酶在HCV中是高度地保存。而且，從各種代表性HCV基因型的NS3蛋白酶區(qū)的氨基酸序列排列(圖2)及保存的殘基在三維結(jié)構(gòu)中的位置(圖8)，人們可看到在活性位點(diǎn)的殘基在HCV基因型與亞型中，是高度地保存。
表5為在GB病毒NS3蛋白酶與HCV NS3蛋白酶區(qū)間的類似性分析。類似性范圍在43與49％之間，而在HCV與粘膜疾病病毒NS3區(qū)間的類似性范圍是從25至30％(表6)。在HCV與登革熱病毒間的類似性范圍，也為約30％(表7)，以及在HCV與黃病毒間的類似性(表8)也是。
相反，表9顯示HCV的NS3蛋白酶區(qū)與人類細(xì)胞肥大病毒(HCMV)的蛋白酶間的類似性，約在20％左右。HCMV為皰疹病毒科的病毒，且具有一種具有不同于黃病毒科蛋白酶的催化分體的絲氨酸蛋白酶。因此，HCMV病毒蛋白酶不被認(rèn)為是類似于黃病毒科NS3蛋白酶。在黃病毒科與HCMV中與本發(fā)明抑制劑接觸的氨基酸之間進(jìn)行類似性的比較時(shí)這種對(duì)比進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例5-三維結(jié)構(gòu)晶體研究為進(jìn)一步分析黃病毒科間的類似性，故獲得與抑制劑絡(luò)合的HCV NS3蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)，并分析在其他黃病毒科中直接與抑制劑接觸的氨基酸，以評(píng)估這些重要接觸點(diǎn)的類似性程度。
獲得與大環(huán)化合物(II)絡(luò)合的HCV NS3蛋白酶-NS4A肽的共晶體，其衍射的X-射線至2.75A解析度。發(fā)現(xiàn)大環(huán)化合物II是在NS3蛋白酶活性位置處，并明顯地限定在不同電子密度內(nèi)。這結(jié)構(gòu)揭示待測(cè)化合物如何與活性位點(diǎn)相互作用的分子細(xì)節(jié)，并提供HCV NS3蛋白酶抑制機(jī)制內(nèi)的其他見(jiàn)解。
與待測(cè)化合物II絡(luò)合的NS3蛋白酶的結(jié)構(gòu)(圖8)是更好地界定本發(fā)明基質(zhì)基的待測(cè)化合物系列的結(jié)合位點(diǎn)。由這共絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)，直接與待測(cè)化合物接觸的殘基，即在3_(H57、G137、S139、A156及A157)內(nèi)，是活性位點(diǎn)的象征，正如通過(guò)抑制的競(jìng)爭(zhēng)性模式，及通過(guò)HCV基因型與各種亞型的代表性序列中，在這位點(diǎn)的保存所預(yù)測(cè)的。
在待測(cè)化合物的4A內(nèi)接觸的其他殘基，示于表10中。比較分析顯示這些氨基酸是高度地保存在59％與76％間范圍的黃病毒科中，這些殘基在黃病毒科中的保存，是HCV NS3蛋白酶的抑制劑也將抑制病毒黃病毒科的其他成員的象征。相反，表10的HCMV蛋白酶催化位點(diǎn)與接觸點(diǎn)的類似性程度，是在整個(gè)蛋白酶類似性的同樣范圍內(nèi)(～20％)，這再一次說(shuō)明來(lái)自非黃病毒科的其他絲氨酸蛋白酶，不會(huì)成為式(I)化合物標(biāo)的事實(shí)。
在HCV與登革熱病毒蛋白酶區(qū)之間進(jìn)行的其他結(jié)構(gòu)研究，已證實(shí)C-末端區(qū)抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的所有六股鏈，是強(qiáng)烈地保存，并具有可比擬的長(zhǎng)度。Den2蛋白酶(殘基87-167)與包括表10中的大部分殘基(殘基69-189)的HCV的C-末端區(qū)的68α碳原子的疊加，產(chǎn)生0.9A的r.m.s.偏差(Murthy等人，1999)。
討論在黃病毒科內(nèi)的病毒具有許多類似性(圖1)，而不管在其成員中的相對(duì)較低的整體序列類同性(表4-8)。特別是，NS3蛋白質(zhì)含有類似于粘膜疾病病毒與黃病毒的蛋白酶與核苷三磷酸結(jié)合蝸牛酶的序列。HCV NS3蛋白酶區(qū)，在HCV基因型中是共有序列類似性為約77-95％(圖1)，而與黃病毒科的其他成員的序列類似性為約25-50％(表4-8)。此外，GBV-B與HCV的基因組構(gòu)建與結(jié)構(gòu)是類似的，而不管在GBV-B與HCV的多蛋白序列間的序列類同性為約25至30％的事實(shí)。但是，這種低類似性是因以下事實(shí)而突出，與抑制劑接觸的殘基在黃病毒科的蛋白酶區(qū)內(nèi)是高度地保存，這強(qiáng)烈指出這化合物族也將結(jié)合至其他黃病毒科。抵抗GBV-B所獲得的化合物IV的活性，是該假說(shuō)的正面證實(shí)。
關(guān)于三維結(jié)構(gòu)，各種已結(jié)晶的HCV與登革熱NS3蛋白酶的可用原子配位，表示整體構(gòu)建，其特征是似胰蛋白酶折疊。許多研究目前已牢固地確立NS3區(qū)的N-末端部分編碼絲氨酸蛋白酶，其在黃病毒科內(nèi)處理的病毒多蛋白中，具有極專一且是關(guān)鍵性的作用。
于上述實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的所有結(jié)果，都傾向于支持式(I)化合物具有抵抗病毒黃病毒科成員的活性的論點(diǎn)·6種相關(guān)化合物已被證實(shí)對(duì)抵抗HCV 1b具有活性，且具有抵抗HCV1a的類似活性(表2)；·這些化合物的3種也被測(cè)試抵抗HCV 3a、2a-c及2b，且也發(fā)現(xiàn)具有活性(表1)；·這些3種同樣化合物是在抵抗GBV-B的酶檢測(cè)中測(cè)試，且發(fā)現(xiàn)具有活性(表3)；·這些化合物中的1種是在狨細(xì)胞中抵抗GBV-B的復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)試，且發(fā)現(xiàn)具有活性(圖6)；·這些化合物中的1種證實(shí)結(jié)合模式，它是位在黃病毒科所有成員間的高度保存區(qū)域中(圖8)；·研究已證實(shí)在HCV與登革熱病毒NS3蛋白酶間的強(qiáng)功能性與結(jié)構(gòu)的類似性。
給出病毒黃病毒科內(nèi)的病毒的所有類似性，似乎高度可能的是，式(I)化合物是有效抵抗病毒的黃病毒科的成員，且更特別是，是有效抵抗黃病毒科的致病成員。
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獲得類似性評(píng)分，限于下列氨基酸類似性[ILVM]，[FWY]，[KR]，[DE]，[GA]，[NQ]，[ST]不同HCV基因型與亞型的區(qū)(180aa)
表5-HCV NS3蛋白酶區(qū)(181AA)與來(lái)自黃病毒科的GB NS3蛋白酶的類似性的％

基質(zhì)[ILVM]，[FWY]，[KR]，[DE]，[GA]，[NQ]，[ST]表6-HCV NS3蛋白酶區(qū)(181AA)與來(lái)自黃病毒科的粘膜疾病病毒NS3蛋白酶的類似性的％

BVDV-2＝牛病毒腹瀉病毒表7-HCV NS3蛋白酶區(qū)(181AA)與來(lái)自黃病毒科的蚊子所帶的黃病毒NS3蛋白酶的類似性的％

表8-HCV NS3蛋白酶區(qū)(181AA)與得自黃病毒科的黃病毒NS3蛋白酶的類似性的％


WVN＝West Nile西尼羅腦炎病毒JEV＝日本腦炎病毒Kunjin＝Kunjin病毒YFV＝黃熱病病毒MVEV＝Murray Vally腦炎病毒表9-HCV蛋白酶區(qū)(181AA)與人類細(xì)胞肥大病毒蛋白酶區(qū)(256AA)的類似性的％

表10-在(在抑制劑的4A內(nèi))黃病毒科病毒中，在NS3蛋白酶抑制劑結(jié)合區(qū)中的氨基酸差異

HCV40_1bHCV 1b分離物的序列，其用于這項(xiàng)分析的參考物n在研究中使用的所有基因型的HCV序列數(shù)目An含有這變性物的HCV序列數(shù)目％Sim％類似性+根據(jù)基質(zhì)[ILVM]，[FWY]，[KR]，[DE]，[GA]，[NQ]，[ST]的類似性＝對(duì)于GBV組的GBV-B成員為獨(dú)特的類似性GBVa在粗體中的aa為關(guān)于GBV-BNS3蛋白酶所發(fā)現(xiàn)的殘基bGBV-B的％類似性序列表<110>貝林格爾.英格海姆國(guó)際有限公司(Boehringer IngelheimInternational GmbH)<120>用于治療被黃病毒科病毒感染的組合物<130>13/118<140>US 60/442,769<141>2003-01-27<150>US 60/421,900<151>2002-10-29<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ctcggatccg gcgcccatca cggcctac 28<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ctctctagat cagcactctt ccatttcatc gaa33<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ctctctagat cagcactctt ccatttcatc gaactc 36<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ctcggatccg gcgcccatca cggcctactc ccaa 34<210>5<211>16<212>PRT<213>HCV肽<400>5Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys1 5 10 15<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6ctcggatccg gctcccatta ctgcttac 28<210>7<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gacgcgtcga cgcggccgct cagcactctt ccatttcact gaa 43<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8ctcggatcgg gccccgatca cagcatacgc c 31<210>9<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9caccgctcga gtcagcattc ttccatctca tcatattgtt g 41
<210>10<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在位1的Asp為連接至鄰氨基苯甲酰基<223>在位6的xaa為氨基丁酸[C(O)-O]<223>在位9的xaa為(3-硝基)酪氨酸<400>10Asp Asp Ile Val Pro Xaa Ala Met Xaa Thr Trp1 5 10<210>11<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在位6的xaa為氨基丁酸<400>11Asp Asp Ile Val Pro Xaa Ala Met Tyr Thr Trp1 5 10<210>12<211>12<212>PRT<213>HCV肽<400>12Asp Asp Ile Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp1 5 10<210>13<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在位1的xaa為鄰氨基苯甲?；?Asp<223>在位2的xaa為(d)Glu<223>在位6的xaa為正纈氨酸[C(O)-O]<223>在位9的xaa為(3-硝基)酪氨酸<400>13Xaa Xaa Ile Val Pro Xaa Ala Met Xaa Thr Trp1 5 10<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>14cgcatatggc accttttacg ctgcagtgtc30<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15cgcgcgctcg agacactcct ccacgatttc ttc33<210>16<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在位1的xaa為乙?；?Asp<223>在位3的xaa為Asp(EDANS)<223>在位6的xaa為氨基丁酸[C(O)-O]<223>在位9的xaa為L(zhǎng)ys[DABCYL]<400>16Xaa Glu Xaa Glu Glu Xaa Ala Ser Xaa1 權(quán)利要求
1.一種式(I)化合物的用途 式(I)其中A選自C1至C6烷基，與C3至C6環(huán)烷基；及B是選自苯基或噻唑基，這兩者視情況被選自NH(R1)與NH(CO)R1的基團(tuán)取代，其中R1為C1至C6烷基；R為OH或式-NHSO2-R2的磺酰胺基，其中R2是-(C1-8)烷基，-(C3-7)環(huán)烷基或{-(C1-6)烷基-(C3-6)環(huán)烷基}，其全部可任選地被鹵素、氰基、硝基、O(C1-6)烷基、酰氨基、氨基或苯基取代1到3次或R2是C6或C10芳基，其任選地被鹵素、氰基、硝基、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、酰氨基、氨基或苯基取代1～3次；或其藥物上可接受的鹽，它用于制備用于治療哺乳動(dòng)物受黃病毒的感染的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中式(I)的A為支鏈C4至C6烷基或C4至C6環(huán)烷基，及式(I)的B為苯基或噻唑，它于位2被NH(R1)或NH(CO)R1取代，其中R1為C1至C4烷基，R是OH或式-NHSO2R-的磺酰胺基，其中R2是-(C1-6)烷基、-(C3-6)環(huán)烷基，兩者可任選地被鹵素或苯基取代1或2次，或R2是C6芳基，其任選地被鹵素或(C1-6)烷基取代1或2次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中A為環(huán)戊基或叔-丁基，且B為噻唑，其在位2被NH(R1)或NH(CO)R1取代，其中R1為C1至C4烷基，R是OH或磺酰胺基，其中R2是甲基、環(huán)丙基或苯基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的用途，其中所述化合物是其中R是OH的化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的用途，其中R是式-NHSO2R2的磺酰氨基，其中R2是-(C1-6)烷基、-(C3-6)環(huán)烷基，兩者可任選地被鹵素或苯基取代1或2次或R2是C6芳基，其可任選地被鹵素或(C1-6)烷基取代1或2次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的用途，其中A為環(huán)戊基，B為噻唑，在其2位被NHCH(CH3)2取代，且R是OH或磺酰氨基，其中R2是甲基、環(huán)丙基或苯基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～5中的任一項(xiàng)的用途，其中所述哺乳動(dòng)物為人類，該黃病毒科選自黃熱病毒、西尼羅河腦炎病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒，GB病毒A或C和肝炎G病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)的用途，其中所述哺乳動(dòng)物為牛，該黃病毒科為選自BVDV，邊緣疾病病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～5中之一項(xiàng)的用途，其中所述哺乳動(dòng)物為豬，該黃病毒科為傳統(tǒng)豬熱病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所述哺乳動(dòng)物是人類，并所述黃病毒科病毒是肝類C病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述哺乳動(dòng)物是人類，并所述黃病毒科病毒是選自黃熱病毒，西尼羅河腦炎病毒，登革熱病毒，日本大腦炎病毒、GB病毒A或C和肝炎G病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述哺乳動(dòng)物是牛，而所述黃病毒科病毒是選自BVDV、邊緣疾病病毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述哺乳動(dòng)物是豬，而所述黃病毒科病毒傳統(tǒng)的豬熱病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求1～9中之一項(xiàng)的用途，其中所述黃病毒科病毒包含NS3蛋白酶，其包含的氨基酸殘基，選自H57、G137、S139、A156及A157。
15.制造包含包裝材料的制品，其中含有有效抑制黃病毒科病毒的組合物，并且包裝材料包含一種標(biāo)記，它指出組合物可用于治療受黃病毒科病毒的感染，并且其中所述組合物包含權(quán)利要求1中所限定的式1化合物。
全文摘要
本發(fā)明是提供用于治療被黃病毒科病毒感染的哺乳動(dòng)物的組合物、用途、制造的制品及方法，其包括對(duì)受感染的哺乳動(dòng)物投予具有式I的化合物其中A是選自C
文檔編號(hào)C07K5/08GK1708509SQ200380102436
公開(kāi)日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月29日
發(fā)明者丹尼爾·拉馬爾, 利斯特·拉加斯 申請(qǐng)人:貝林格爾·英格海姆國(guó)際有限公司