專利名稱：：抗－cd33抗體和使用其治療急性髓性白血病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及結(jié)合CD33的抗體。更特別地是，本發(fā)明涉及抗CD33抗體，所述抗體的片段和同源物，所述抗體的人源化和表面重整(resurfaced)形式，抗體的功能等價物和改良形式，含有所述抗體的免疫偶聯(lián)物(immunoconjugate)和組合物，以及其在診斷、研究和治療中的應(yīng)用。在另一個方面，本發(fā)明涉及編碼該抗體的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體，用多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞和產(chǎn)生該抗體的方法。
背景技術(shù)：
：白細胞分化抗原(leukocytedifferentiationantigen)CD33是一個具有364個氨基酸的跨膜糖蛋白，其與唾液酸粘附素家族的成員具有序列同源性，包括髓鞘相關(guān)糖蛋白和CD22，以及唾液酸粘附素本身(S.Peiper，2002，LeucocyteTypingVII，WhiteCellDifferentiation，Antigens，ProceedingsoftheSeventhInternationalWorkshopandConference，OxfordUniversityPress，p.777)。CD33的表達似乎對造血區(qū)室(hematopoieticcompartment)有高度的特異性，由骨髓前體細胞進行強表達(S.Peiper，2002)。它可被下列細胞表達，骨髓祖細胞(myeloidprogenitorcells)，如CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G和BFU-E，單核細胞/巨噬細胞，粒細胞前體如前髓細胞和髓細胞細胞，盡管在成熟和分化過程中表達降低，以及可被成熟的粒細胞表達，盡管其表達水平低(S.Peiper，2002)。相反，在體外產(chǎn)生“胚細胞集落(blastcolonies)”(Leary，A.G.etal.，1987，Blood69953)、并誘導(dǎo)造血骨髓長期培養(yǎng)(AndrewsR.G.etal.，1989，J.Exp.Med.1691721；Sutherland，H.J.等人，1989，Blood741563)的多能造血干細胞似乎缺乏CD33的表達。盡管CD33的特殊功能還不清楚，但其與唾液酸粘附素的同源性提示其在凝集素家族的碳水化合物結(jié)合特性中的作用，這種作用隨后被證實(S.Peiper，2002)。重要的是，抗-CD33單克隆抗體已經(jīng)顯示CD33可在超過80％的人類病例的克隆發(fā)生性，急性骨髓性白血病(AML)細胞上表達(LaRussa，V.F.etal.，1992，Exp.Hematol.20442-448)。由于CD33的選擇性表達，結(jié)合細胞毒類藥物的免疫偶聯(lián)物，能特異識別和結(jié)合CD33的單克隆抗體，已經(jīng)被建議用于選擇性靶向AML細胞。這種治療法期望可使干細胞和原始的造血祖細胞不受影響。使用抗CD33抗體的免疫偶聯(lián)物，包括抗-CD33-蓖麻毒素免疫偶聯(lián)物，其已經(jīng)顯示對AML細胞是高度致死性的(Roy，D.C.etal.，1991，Blood772404；Lambert，J.M.etal.，1991，Biochemistry303234)，然而卻不傷害支持正常的造血作用和造血系統(tǒng)重建的干細胞(LaRussa，V.F.etal.，1992，Exp.Hemato.20442-448)。使用免疫偶聯(lián)物的其他研究顯示當靜脈給藥時，放射性標記的抗CD33抗體可迅速靶向外周血和骨髓中的白血病母細胞(Scheinberg，D.A.etal.，1991，J.Clin.Oncol.9478-490；Schwartz，M.A.etal.，1993，J.Clin.Oncol.11294-303)。在體外研究中也觀察到靶細胞對抗體的迅速內(nèi)化(Tanimot，M.etal.，1989，Leukemia3339-348；Divgi，C.R.etal.，1989，CancerRes.Suppl.Vol.30404a)。在臨床前研究中，對與強力抗腫瘤抗生素卡奇霉素(卡奇霉素吉妥組單抗(Gemtuzumabozogamicin))偶聯(lián)的人源化抗-CD33抗體的評價表明了對HL-60細胞培養(yǎng)物、小鼠HL-60腫瘤異種移植物和AML患者的骨髓樣品中的白血病細胞的特異性殺傷作用(Hamann，P.R.etal.，2002，BioconjugateChem.1347-58)?；谶@些臨床前研究的陽性結(jié)果，卡奇霉素吉妥組單抗在I期和II期臨床研究中被進行評價。在臨床I期研究中，觀察到的主要毒性是骨髓抑制(myelosuppression)，其原因是骨髓祖細胞上CD33的表達(Sievers，E.L.etal.，1999，Blood933678-3684；SieversE.L.etal.，2001，J.Clin.Oncol.193244-3254)。在II期臨床研究中，靜脈給藥劑量為9mg/m2，超過4小時，14天后重復(fù)，產(chǎn)生的響應(yīng)率為30％。FDA于2000年5月批準了卡奇霉素吉妥組單抗的市場準入，適應(yīng)征是治療首次復(fù)發(fā)的CD33陽性AML患者，年齡在60歲或60歲以上并被認為不能進行細胞毒性化療的候選人。進入市場后的研究報告表明其可能具有顯著的毒性，特別是靜脈閉塞性疾病(VOD)，這已經(jīng)導(dǎo)致標簽修正，并啟動患者監(jiān)控程序。大多數(shù)這種毒性涉及藥物組分卡奇霉素，其顯示可在臨床前模型中引起肝毒性，因此不是靶向CD33的直接結(jié)果。盡管上述討論的結(jié)果表明含有抗CD33抗體和細胞毒類藥物的免疫偶聯(lián)物可成功地用于治療AML，但仍需要既安全又有效的免疫偶聯(lián)物。本發(fā)明就是涉及這些和其他重要的目標。發(fā)明概述[13]因此，本發(fā)明的一個目標是提供可特異性結(jié)合CD33和可用于治療AML的抗體。因此，在第一種實施方案中，提供了抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段(epitope-bindingfragment)，它們具有結(jié)合CD33的能力。在第二種實施方案中，提供了鼠抗體My9-6，就它的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，針對該輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因的cDNA序列，它的CDRs(互補決定區(qū))的鑒定，它的表面氨基酸的鑒定，以及它的以重組形式的表達手段在本文已充分描述。在第三種實施方案中，提供了My9-6抗體的人源化或表面重整版本。其中My9-6抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的表面暴露殘基(surface-exposedresidues)在輕鏈和重鏈中都被替換，以與已知的人抗體表面更相似。這種人源化抗體與鼠My9-6相比，作為治療性或診斷性試劑，其效用增加。鼠抗體My9-6的人源化版本在本文中從以下方面進行了詳盡描述它們各自的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的cDNA序列，CDRs(互補決定區(qū))的鑒定，表面氨基酸的鑒定，以及以重組形式表達的方法的公開。在進一步的實施方案中，提供了包括至少一個互補決定區(qū)的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中互補決定區(qū)具有選自SEQIDNO1-6中的氨基酸序列SYYIH(SEQIDNO1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQIDNO2)，其中X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQIDNO3)，KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQIDNO4)，WASTRES(SEQIDNO5)，HQYLSSRT(SEQIDNO6)，并具有與CD33結(jié)合的能力。在進一步的實施方案中，提供了包括至少一個重鏈可變區(qū)和至少一個輕鏈可變區(qū)的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)含有三個互補決定區(qū)，其分別具有由SEQIDNO1-3表示的氨基酸序列，SYYIH(SEQIDNO1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQIDNO2)，其中X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQIDNO3)，和其中所述輕鏈可變區(qū)含有三個互補決定區(qū)，其分別具有由SEQIDNO4-6表示的氨基酸序列，KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQIDNO4)，WASTRES(SEQIDNO5)，HQYLSSRT(SEQIDNO6)。在進一步的實施方案中，提供了具有一個重鏈可變區(qū)的抗體，其中該重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQIDNO7所表示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS具有至少90％的序列同一性，更優(yōu)選與SEQIDNO7具有95％的序列同一性，最優(yōu)選與SEQIDNO7具有100％的序列同一性。類似地，提供了含有一個輕鏈可變區(qū)的抗體，其中該輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQIDNO8所表示的氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR具有至少90％的序列同一性，更優(yōu)選與SEQIDNO8具有95％的序列同一性，最優(yōu)選與SEQIDNO8具有100％的序列同一性。在進一步的實施方案中，提供了具有人源化或表面重整的重鏈可變區(qū)的抗體，其中該人源化或表面重整的重鏈可變區(qū)與SEQIDNO9所表示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS具有至少90％的序列同一性，更優(yōu)選與SEQIDNO9具有95％的序列同一性，最優(yōu)選與SEQIDNO9具有100％的序列同一性。類似地，提供了具有一個人源化或表面重整的輕鏈可變區(qū)的抗體，該人源化或表面重整的輕鏈可變區(qū)與對應(yīng)于SEQIDNO10的氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR，具有至少90％的序列同一性，更優(yōu)選與SEQIDNO10具有95％的序列同一性，最優(yōu)選與SEQIDNO10具有100％的序列同一性。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物含有與本發(fā)明的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段共價連接的藥物或前體藥物，直接或通過可切割或非切割性連接子共價連接。在優(yōu)選的實施方案中，藥物或前體藥物是細胞毒性藥物或前體藥物，如美登木素生物堿(maytansinoid)、紫杉醇(taxoid)、CC-1065、CC-1065類似物，海兔毒肽和海兔毒肽類似物。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，包括本發(fā)明的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段和藥物或前體藥物的。在進一步的實施方案中，本發(fā)明包括藥物組合物，該藥物組合物包括本發(fā)明的抗體、其抗原決定簇結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物，或者單獨，或者與藥物或前體藥物或其他治療劑組合，在存在一種或多種藥學(xué)上可接受試劑的情況下。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，被標記用于研究或診斷應(yīng)用中。在優(yōu)選的實施方案中，標記是生物素標記，酶標記，放射性標記，熒光基團，發(fā)色基團，顯像劑或金屬離子。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制表達CD33的細胞的生長的方法，該方法通過使用本發(fā)明的抗體、其抗原決定簇結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物，或者單獨，或者與藥物或前體藥物或其他治療劑組合，進一步地，單獨或在存在一種或多種藥學(xué)上可接受試劑的情況下。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有表達CD33的疾病的患者的方法，包括給予本發(fā)明的抗體、其抗原決定簇結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物，或者單獨或者與藥物或前體藥物或其他治療劑組合，進一步地，單獨或在存在一種或多種藥學(xué)上可接受試劑的情況下。所述疾病可以是一種或多種，例如骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)，或其他被確定其中表達CD33的疾病。治療方法，包括體內(nèi)、離體和體外應(yīng)用本發(fā)明的抗體、抗體片段和免疫偶聯(lián)物，或者單獨使用或者與藥物或前體藥物或其他治療藥劑組合使用，進一步地，單獨地或在存在一種或多種藥學(xué)上可接受試劑的情況下使用。在進一步的實施方案中，提供了確定生物學(xué)樣品中是否含有骨髓性癌細胞的方法，其中，生物學(xué)樣品與診斷試劑，如標記的本發(fā)明的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段相接觸，并檢測該試劑在樣品中的分布。這種方法可用來診斷如急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。在進一步的實施方案中，提供了具有改良特性的本發(fā)明的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段。例如，可通過采用動物免疫、雜交瘤形成和選擇具有特殊特性的抗體的標準技術(shù)，來制備與CD33親和性提高的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段。改良的抗體也可通過本發(fā)明的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的親合力成熟來制備，例如通過使用寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變、盒式誘變、易錯PCR，DNA改組和應(yīng)用大腸桿菌增變菌。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的多核苷酸，包含該多核苷酸的重組載體，用該重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，和通過培養(yǎng)所述宿主細胞產(chǎn)生所述抗體和其抗原決定簇結(jié)合片段的方法。在最后一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過使用本發(fā)明抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段從生物學(xué)材料中獲得CD33的方法。圖1顯示了競爭結(jié)合試驗的結(jié)果，其中，在存在濃度不斷增加的My9抗體或My9-6抗體下，測定了125I-標記的My9-6抗體(3×10-9M)與CD33陽性U-937細胞的結(jié)合作用。圖2顯示了用于輕鏈信號序列的My9-6簡并引物。圖3顯示了來自Brookhaven數(shù)據(jù)庫的127個抗體結(jié)構(gòu)的文件名，其可被用來預(yù)測muMy9-6可變區(qū)的表面。圖4顯示了用來構(gòu)建該16個表面重整My9-6版本以及嵌合My9-6抗體的PCR引物。圖5顯示了用來構(gòu)建和表達人源化抗體的質(zhì)粒。(A)輕鏈克隆質(zhì)粒。(B)重鏈克隆質(zhì)粒。(C)哺乳動物抗體表達質(zhì)粒。圖6A顯示了muMy9-6輕鏈的Edman測序結(jié)果，與由RT-PCR產(chǎn)生的cDNA克隆所得的的氨基酸序列進行比較。圖6B顯示了1319Da和1122Da肽片段的MS-MS序列分析結(jié)果，其中所述1319Da和1122Da肽片段分別含有CDR1和CFR2序列的。CDR序列以粗體表示。圖7顯示了1788Da肽和來自兩個cDNA克隆的相應(yīng)序列的MS-MS序列分析結(jié)果。圖8A顯示了鼠My9-6抗體的cDNA序列和推算的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。三個CDR用下劃線表示。圖8B顯示了鼠My9-6抗體的cDNA序列和推算的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。三個CDR用下劃線表示。圖9顯示了由Kabat定義所確定的輕鏈和重鏈CDR。圖10顯示了鼠My9-6抗體的輕鏈和重鏈氨基酸序列，與8-27和V102基因的胚系序列進行比對。點(.)表示序列同一性。圖11A&B顯示了與muMy9-6序列最同源的10個輕鏈(A)和重鏈(B)抗體序列，在Brookhaven數(shù)據(jù)庫中有解答文件(solvedfile)。序列以同源性從最大至最小的順序進行排列。圖12A&B顯示了muMy9-6抗體輕鏈(A)和重鏈(B)的每個Kabat位點的平均可及性(accessibility)。10個最同源的輕鏈和重鏈序列的每個Kabat位點的相對溶劑可及性(solventaccessibilities)被平均，并沿x軸顯示。圖13A顯示了10個最同源的輕鏈結(jié)構(gòu)的殘基溶劑可及性，用MC軟件計算，并顯示了每個Kabat位點的平均值，用Excel制表。本表顯示了平均溶劑可及性超過25％的非CDR位點的數(shù)據(jù)。表面殘基被規(guī)定為具有超過30％平均溶劑可及性的殘基。進一步分析具有25％-35％平均可及性的位點，是可通過計算僅在該位點以及其兩側(cè)側(cè)向位點具有相同殘基的結(jié)構(gòu)的平均可及性而進行。NA是指沒有相同的側(cè)向位點。位點15和70需要進一步的計算，以獲得在最后一列中給定的最終的表面預(yù)測值。圖13B顯示了10個最同源的重鏈結(jié)構(gòu)的殘基溶劑可及性，用MC軟件計算，并顯示了每個Kabat位點的平均值，用Excel制表。本表顯示了平均溶劑可及性超過25％的非CDR位點的數(shù)據(jù)。表面殘基被規(guī)定為具有超過30％平均溶劑可及性的殘基。進一步分析具有25％-35％平均可及性的位點，是通過計算僅在該位點以及其兩側(cè)側(cè)向位點具有相同殘基的結(jié)構(gòu)的平均可及性而進行。NA是指沒有相同的側(cè)向位點。圖14顯示了My9-6框架表面殘基(frameworksurfaceresidues)，其落在CDR殘基5之內(nèi)。圖15顯示了從Kabat數(shù)據(jù)庫中獲取的前5個人抗體序列。通過SR生成對比(Pedersen，1993)。進入CDR的5范圍內(nèi)的muMy9-6殘基用下劃線表示。圖16A&B顯示了16個人源化My9-6輕鏈可變區(qū)序列(A)和16個人源化My9-6重鏈可變區(qū)序列(B)，是與鼠My9-6比對的。點(.)表示相對于人源化版本1.0的序列同一性。在鼠和人My9-6之間有差異的表面殘基，用下劃線標出。圖17顯示了My9-6KD值，是通過在HL-60膜和HL-60全細胞上的直接結(jié)合測定(directbindingassay)、以及在HL-60膜上的競爭結(jié)合測定計算得到。除了*處N＝2以外，N＝3。圖18顯示了huMy9-6V1.0的結(jié)合曲線。(A)在HL-60膜上的直接結(jié)合。(B)在HL-60全細胞上的直接結(jié)合。(C)在HL-60膜上的競爭結(jié)合。圖19顯示了My9-6-DM1與My9-6抗體結(jié)合的比較，在HL-60細胞上進行。圖20顯示了My9-6-DM1對于表達CD33的人腫瘤細胞的體外細胞毒性。圖21顯示了My9-6-DM1在攜帶HL-60異種移植物的SCID小鼠中的效能試驗結(jié)果。My9-6-DM1(A)和未修飾My9-6抗體(C)對HL-60腫瘤生長的作用被評價。小鼠的體重作為毒性的指征(indication)被監(jiān)測(B，D)。圖22顯示了My9-6-DM1與游離藥物美登素在攜帶HL-60異種移植物的SCID小鼠中的效能比較(A)。小鼠的體重作為毒性的一個指征被監(jiān)測(B)。在兩個被治療小鼠中復(fù)發(fā)的腫瘤用第二個療程的My9-6-DM1治療。圖23A&B顯示了My9-6-DM1和標準化療在攜帶HL-60異種移植物的SCID小鼠中的抗腫瘤效能比較(A)。小鼠的體重作為毒性的一個指征被監(jiān)測(B)。在兩個被治療的小鼠中的復(fù)發(fā)腫瘤用第二個療程的My9-6-DM1治療。圖24A&B顯示了My9-6-DM1與卡奇霉素吉妥組單抗和標準化療在HL-60生存模型(survivalmodel)中的抗腫瘤功效的比較。HL-60細胞被靜脈注射進SCID小鼠中。指示治療在注射細胞之后11天開始。除了卡奇霉素吉妥組單抗(Q4D×3)以外，治療為靜脈注射每天×5。發(fā)明詳述[62]本發(fā)明提供了新型鼠抗-CD33抗體和該抗體的人源化版本。進一步提供的是含有一種或多種鼠抗CD33抗體或其人源化版本的CDR的抗體，其特異地識別和結(jié)合CD33。鼠My9-6抗體[64]本發(fā)明的鼠抗-CD33抗體(murineanti-CD33antibody)，在本文中有許多名稱，稱為“My9-6”，“鼠My9-6(murineMy9-6)”和“muMy9-6”，就其輕鏈和重鏈可變區(qū)的推斷的胚系氨基酸序列(germlineaminoacidsequence)(圖10)，輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(圖8A&B)，CDR的鑒定(圖9)，表面氨基酸的鑒定(圖13A&B)和其以重組版本表達的方法而言，已被充分描述。My9-6抗體的功能已經(jīng)進一步被描述，顯示與存在于CD33陽性U-937細胞的表面上的CD33具有很高的結(jié)合親和性(圖1)。125I-標記的My9-6結(jié)合U-937細胞，它可被未標記的My9-6和以前描述的抗CD33抗體My9從細胞上競爭下來(BioGenex，cat.no.267M)。術(shù)語“可變區(qū)(variableregion)”在此用來描述抗體重鏈和輕鏈的某些部分，它們在抗體之間序列不同，且協(xié)同決定每個特定抗體對其抗原的結(jié)合和特異性?？勺冃圆⒉唤?jīng)常均勻地分布在抗體可變區(qū)。其通常集中在稱為互補性決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)的可變區(qū)的三個片段內(nèi)，均在輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)。可變區(qū)的更高度保守部分稱為框架區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包括四個框架區(qū)，主要采用β-片層構(gòu)型，每個框架區(qū)連接三個CDR，形成與β-片層結(jié)構(gòu)連接的環(huán)，在一些情況下形成β-片層結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的CDR被框架區(qū)固定緊靠其他鏈的CDR，這樣形成了抗體的抗原結(jié)合位點(E.A.Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第五版，1991，NIH)?！昂愣?constantregion)區(qū)”不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)子功能，如抗體參與的抗體依賴性細胞毒性。人源化My9-6抗體My9-6的人源化版本(HumanizedversionsofMy9-6)，在本文中有不同名稱“huMy9-6”，和“人源化My9-6”，也已制備得到。人源化的目標是減少異種抗體如鼠抗體的免疫原性，用于導(dǎo)入進人體內(nèi)后，在保持抗體的全部抗原結(jié)合親和性和特異性的同時減少免疫原性。人源化抗體可采用若干技術(shù)來產(chǎn)生，如表面重整(resurfacing)和CDR嫁接(CDRgrafting)技術(shù)。如在此所使用的，表面重整技術(shù)綜合使用分子建模，統(tǒng)計學(xué)分析和誘變，以便改變抗體可變區(qū)的非CDR表面，從而模擬目標宿主的已知抗體的表面?？贵w的表面重整的策略和方法，和在不同的宿主中減少抗體免疫原性的其他方法，公開在美國專利5,639,641(Pedersen等人)中，在此整體引入，作為參考。簡言之，在一個優(yōu)選方法中，(1)生成許多抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的位點對比，得到一組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露位點，其中所有可變區(qū)的對比位點至少大約98％是相同的；(2)針對嚙齒類抗體(或其片段)確定一組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露的氨基酸殘基；(3)鑒定與該組嚙齒類表面暴露氨基酸殘基最相似的一組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露氨基酸殘基；(4)步驟(2)中確定的該組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露氨基酸殘基被步驟(3)中鑒定的該組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露氨基酸殘基替代，除了那些位于該嚙齒類抗體的互補決定區(qū)的任何殘基的任何原子的5范圍內(nèi)的氨基酸殘基；和(5)產(chǎn)生具有結(jié)合特異性的人源化嚙齒類抗體?？梢允褂枚喾N其他的技術(shù)對抗體進行人源化，包括CDR嫁接(EP0239400；WO91/09967；美國專利5,530,101；和5,585,089)，鑲飾(veneering)或表面重整(EP0592106；EP0519596；PadlanE.A.，1991，MolecularImmnunology28(4/5)489-498；StudnickaG.M.etal.，1994，ProteinEngineering7(6)805-814；RoguskaM.A.etal.，1994，PNAS91969-973)，和鏈改組(chainshuffling)(美國專利No.5,565,332)。人抗體可通過本領(lǐng)域中已知的多種方法來制備，包括噬菌體展示法。也參見美國專利No.4,444,887；4,716,111；5,545,806和5,814,318；和國際專利申請公開號WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741(所述文獻整體參考并入，作為參考)。如本文中進一步描述地，通過建模鑒定My9-6的CDR，并預(yù)測它的分子結(jié)構(gòu)。然后制備人源化My9-6抗體，其序列已經(jīng)被完全表征。許多huMy9-6抗體的輕鏈和重鏈的氨基酸序列，被顯示在圖16A和16B中。鼠和人源化My9-6抗體的比較結(jié)合值，被提供在圖17中?？贵w的結(jié)合曲線顯示在圖18中。My9-6抗體的抗原決定簇結(jié)合片段[76]盡管鼠My9-6抗體和人源化My9-6抗體的抗原決定簇結(jié)合片段在此與鼠My9-6抗體和人源化版本分別進行討論，但要理解的是本發(fā)明的術(shù)語“抗體(antibody)”或“多種抗體(antibodies)”可包含全長的muMy9-6和huMy9-6抗體，以及這些抗體的抗原決定簇結(jié)合片段。如本文中所使用的，“抗體片段”包括保留了與CD33結(jié)合的能力的抗體的任何部分，通常稱為“抗原決定簇結(jié)合片段”?？贵w片段的實例優(yōu)選包括但不限于，F(xiàn)ab、Fab′和F(ab′)2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體，二硫鍵連接的Fv(sdFv)和含有VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段?？乖瓫Q定簇結(jié)合片段，包括單鏈抗體，可單獨包含可變區(qū)或組合了下列的一部分或全部鉸鏈區(qū)、CH1、CH2、和CH3結(jié)構(gòu)域。這種片段可含有一個或兩個Fab片段或F(ab′)2片段。優(yōu)選地，抗體片段含有整個抗體的所有6個CDR，盡管含有少于所有這些區(qū)域的片段，如三個，四個或5個CDR，也是有功能的。更進一步，功能等價物可能是下列任何一種免疫球蛋白類型的成員或它們的組合IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE，及其亞型。Fab和F(ab′)2片段可通過使用酶進行蛋白水解裂解而產(chǎn)生，使用的酶如木瓜蛋白酶(Fab片段)或胃蛋白酶(F(ab′)2片段)。單鏈FV(scFv)片段是抗原決定簇結(jié)合片段，其含有與抗體輕鏈可變區(qū)(VL)的至少一個片段連接的抗體重鏈可變區(qū)(VH)的至少一個片段。連接子可以選擇短的，柔性的肽，以保證(VL)和(VH)區(qū)域一旦連接就形成合適的三維折疊，以維持全抗體的靶分子結(jié)合特異性，而單鏈抗體片段來源于該全抗體。(VL)或(VH)序列的羧基末端可通過連接子共價連接于互補的(VL)和(VH)序列的氨基酸末端。單鏈抗體片段可通過分子克隆，抗體噬菌體展示文庫或?qū)I(yè)技術(shù)人員熟知的類似技術(shù)來產(chǎn)生。這些蛋白可在例如真核細胞或原核細胞，包括細菌中產(chǎn)生。本發(fā)明的抗原決定簇結(jié)合片段也可使用本領(lǐng)域中已知的多種噬菌體展示法來產(chǎn)生。在噬菌體展示方法中，功能性抗體結(jié)構(gòu)區(qū)被展示在攜帶編碼它們的多核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面上。特別的是，這種噬菌體可用來展示從抗體譜(repertoire)或組合抗體文庫(例如，人或鼠)表達的抗原決定簇結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)。表達可結(jié)合目的抗原的抗原決定簇結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體可用抗原選擇或鑒定，例如使用標記的CD33或被結(jié)合或俘獲到固體表面或珠上的CD33。用于這些方法中的噬菌體通常的是絲狀噬菌體，包括fd和M13，結(jié)合結(jié)構(gòu)域由具有重組融合到噬菌體基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫鍵固定的Fv抗體結(jié)構(gòu)域的噬菌體表達?？捎脕碇苽浔景l(fā)明的抗原決定簇結(jié)合片段的噬菌體展示方法的實例包括在下列文獻中公開的方法Brinkmanetal.，1995，J.Immunol.Methods18241-50；Amesetal.，1995，J.Immunol.Methods184177-186；Kettleboroughetal.，1994，Eur.J.Immunol.24952-958；Persicetal.，1997，Gene1879-18；Burtonetal.，1994，AdvancesinImmunology57191-280；PCT申請No.PCT/GB91/01134；PCT公布WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美國專利No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108，每一篇文獻整體引入本文，作為參考。噬菌體篩選后，編碼片段的噬菌體的區(qū)域可被分離，并通過使用重組DNA技術(shù)，例如在下面所詳述的，在被選擇的宿主中表達來產(chǎn)生抗原決定簇結(jié)合片段，宿主包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌，。例如，重組產(chǎn)生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技術(shù)也可應(yīng)用，使用本領(lǐng)域已知的方法，如在PCT公布WO92/22324；Mullinaxetal.，1992，BioTechniques12(6)864-869；Sawaietal.，1995，AJRI3426-34；和Betteretal.，1988，Science2401041-1043中所公開的方法；所述文獻整體引入本文，作為參考。用來產(chǎn)生單鏈Fv和抗體的技術(shù)的例子包括那些在美國專利No.4,946,778和5,258,498；Hustonetal.，1991，MethodsinEnzymology20346-88；Shuetal.，1993，PNAS907995-7999；Skerraetal.，1988，Science2401038-1040中所描述的。功能等價物(functionalequivalents)[85]也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是My9-6抗體和人源化My9-6抗體的功能等價物(functionalequivalent)。術(shù)語“功能等價物”包括具有同源序列的抗體，嵌合的抗體，修飾抗體和人工抗體，例如，其中規(guī)定了每個功能等價物具有結(jié)合CD33的能力。專業(yè)技術(shù)人員將會理解在稱為“抗體片段(antibodyfragments)”的一組分子和稱為“功能等價物”的一組分子中是有重疊的。具有同源序列的抗體是具有與本發(fā)明的鼠My9-6和人源化My9-6抗體的氨基酸序列具有序列同一性或同源性的氨基酸序列的抗體。優(yōu)選與本發(fā)明的鼠My9-6和人源化My9-6抗體的可變區(qū)氨基酸序列具有同一性?！靶蛄型恍?sequenceidentity)”和“序列同源性(sequencehomology)”當用于本文的氨基酸序列時，被規(guī)定為與另一條氨基酸序列具有至少大約90％、91％、92％、93％或94％的序列同一性，更優(yōu)選至少大約95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列，同一性例如根據(jù)PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，2444-2448(1988)通過FASTA搜索法測定。如本文中所使用的，嵌合抗體是其中抗體的不同部分來自不同動物種的抗體。例如，含有來自鼠單克隆抗體的可變區(qū)的抗體與人免疫球蛋白恒定區(qū)配對。產(chǎn)生嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。見，例如，Morrison，1985，Science2291202；Oietal.，1986，BioTechniques4214；Gilliesetal.，1989，J.Immunol.Methods125191-202；美國專利No.5,807,715；4,816,567；和4,816,397，在此整體引入本文，作為參考。人工抗體包括scFv片段、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和mru(見Winter，G.andMilstein，C.，1991，Nature349293-299；Hudson，P.J.，1999，CurrentOpinioninImmunology11548-557的綜述)，每種都具有抗原結(jié)合能力。在單鏈Fv片段(scFv)中，抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)區(qū)被一個可變形肽連接。一般這種連接子肽大約15個氨基酸殘基長。如果該連接子更小，例如，5個氨基酸，可形成雙鏈抗體，其是二價scFv二聚體。如果連接子減少到少于3個氨基酸殘基，可形成三聚和四聚體結(jié)構(gòu)，稱為三鏈抗體和四鏈抗體?？贵w的最小結(jié)合單位是CDR，一般是具有足夠特異性識別和結(jié)合能力的重鏈CDR2，其可單獨使用。這樣一個片段被稱為分子識別單位或mru。幾個這種mru可用短的連接肽連接在一起，因而形成了具有較單個mru更高親和力的人工結(jié)合蛋白。本申請的功能等價物也包括修飾抗體，例如通過任何類型的分子共價附著于抗體上而對抗體進行修飾的抗體。例如，修飾的抗體包括已經(jīng)被下述方法修飾的抗體例如被糖基化，乙酰化，聚乙二醇化(pegylation)，磷酸化，酰胺化，通過已知的保護/封閉基團衍生作用，蛋白水解裂解，與細胞配體或其他蛋白連接，等等。共價附著不會阻止抗體產(chǎn)生抗獨特型(anti-idiotypic)應(yīng)答。這些修飾作用可通過已知的技術(shù)來完成，包括但不限于，特異化學(xué)性裂解，乙酰化，甲?；?，衣霉素的代謝合成，等等。另外，被修飾的抗體可含有1個或更多個非典型氨基酸(non-classicalaminoacids)。通過在不同的框架內(nèi)、不同的鏈上互相交換不同的CDR產(chǎn)生功能等同物。因此，例如，對于指定組的CDR可通過取代不同的重鏈可能形成不同類型的抗體，由此，例如IgG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE抗體類型和同型抗體可被產(chǎn)生。同樣，在本發(fā)明范圍內(nèi)的人工抗體可通過將給定的一組CDR嵌入進整個合成框架區(qū)中而產(chǎn)生。功能等價物很容易在特定組CDR側(cè)向的可變區(qū)和/或恒定區(qū)序列內(nèi)使用本領(lǐng)域中已知的多種方法通過突變，刪除和/或插入來產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體片段和功能等價物包括與鼠My9-6抗體相比，與CD33的結(jié)合達到可檢測程度的分子。結(jié)合的可檢測程度包括鼠My9-6抗體與CD33結(jié)合能力的至少10-100％范圍內(nèi)的所有值，優(yōu)選至少50％、60％或70％，更優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％。改良抗體(improvedantibodies)[94]CDR對抗原決定簇識別和抗體結(jié)合具有首要的重要性。但是，對于包括CDR的殘基可進行一些改變，而影響抗體識別和結(jié)合其同類抗原決定簇的能力。例如，可以制造不影響抗原決定簇識別，但增加抗體與抗原決定簇的結(jié)合親和性的改變。因此，也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是改良形式的鼠和人源化抗體，它們也特異性識別和結(jié)合CD33，優(yōu)選具有增加的親和性。幾個研究已經(jīng)調(diào)查了抗體序列中不同位點上引入一個或多個氨基酸改變的影響，這基于對原始抗體序列和其特性如結(jié)合和表達水平的了解(Yang，W.P.etal.，1995，J.Mol.Biol.，254，392-403；Rader，C.etal.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，8910-8915；Vaughan，T.J.etal.，1998，NatureBiotechnology，16，535-539)。在這些研究中，已經(jīng)通過改變CDR1、CDR2、CDR3或框架區(qū)內(nèi)重鏈和輕鏈基因序列產(chǎn)生了原始抗體的等價物，使用的方法如寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變、盒式誘變、易錯PCR、DNA改組或大腸桿菌的突變株(Vaughan，T.J.etal.，1998，NatureBiotechnology，16，535-539；Adey，N.B.等人.，1996，第16章，277-291頁，見“肽類和蛋白的噬菌體展示”，主編，Kay，B.K.等人，AcademicPress)。改變原始抗體序列的這些方法已使二級抗體的親和性改善(Gram，H.etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，3576-3580；Boder，E.T.etal.，2000，Proc.Natl.AcadSci.USA，97，10701-10705；Davies，J.andRiechmann，L.，1996，Immunotechnolgy，2，169-179；Thompson，J.etal.，1996，J.Mol.Biol.，256，77-88；Short，M.K.etal.，2002，J.Biol.Chem.，277，16365-16370；Furukawa，K.etal.，2001，JBiol.Chem.，276，27622-27628)。通過改變抗體的一個或多個氨基酸殘基的類似的定向策略，在此描述的抗體序列可用來開發(fā)具有改進功能，包括與CD33改進的親和性，的抗CD33抗體。改良的抗體也包括具有改良特性的抗體，其可通過標準的動物免疫，雜交瘤形成和具有特殊特性的抗體的選擇技術(shù)來制備。免疫偶聯(lián)物(immunoconjugates)[101]本發(fā)明也涉及免疫偶聯(lián)物，包括本文中所公開的與藥物或前體藥物連接的抗體、抗體片段、功能等價物、改良抗體及其類似物。優(yōu)選的藥物或前體藥物是細胞毒性劑，并包括例如美登木素生物堿和美登木素生物堿類似物、紫杉醇、CC-1065和CC-1065類似物，海兔毒肽和海兔毒肽類似物。免疫偶聯(lián)物可通過體外方法制備。為了將藥物或前體藥物與抗體連接，可使用連接基團。合適的連接基團在本領(lǐng)域中是為人所熟知的，包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團和酯酶不穩(wěn)定基團。優(yōu)選的連接基團是二硫化物基團和硫醚基團。例如，可使用二硫化物交換反應(yīng)(disulfideexchangereaction)或通過在抗體和藥物或前體藥物之間形成硫醚鍵構(gòu)建偶聯(lián)物。美登木素生物堿和美登木素生物堿類似物是優(yōu)選的細胞毒劑之一。合適的美登木素生物堿的例子包括美登木醇和美登木醇類似物。合適的美登木素生物堿公開在美國專利No.4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；和5,846,545中。關(guān)于美登木素生物堿，連接基團可包含反應(yīng)性化學(xué)基團。在一個優(yōu)選的實施方案中，反應(yīng)性化學(xué)基團可通過一個二硫鍵連接部分與美登木素生物堿共價結(jié)合。特別優(yōu)選的反應(yīng)性化學(xué)基團是N-琥珀酰亞胺酯(N-succinimidylester)和N-磺基琥珀酰亞胺酯(N-sulfosuccinimidylester)。特別優(yōu)選的包含連接基團的美登木素生物堿是美登木醇的C-3酯及其類似物，上述連接基團中含有反應(yīng)性化學(xué)基團，其中連接部分含有二硫鍵，化學(xué)反應(yīng)基團包括N-琥珀酰亞胺酯或N-磺基琥珀酰亞胺酯。美登木素生物堿上的許多位點可作為化學(xué)性連接連接部分的位點。例如，具有羥基基團的C-3位點、用羥甲基修飾的C-14位點、用羥基修飾的C-15位點和具有羥基的C-20位點均被認為是有用的。但C-3位點是優(yōu)選的，美登木醇的C-3位點是特別優(yōu)選的。其他的化學(xué)鍵包括酸不穩(wěn)定鍵，光不穩(wěn)定鍵，肽酶不穩(wěn)定鍵和酯酶不穩(wěn)定鍵。并入本文的美國專利No.5,208,020的公開內(nèi)容，教導(dǎo)了攜帶這些鍵的美登木素生物堿的生產(chǎn)。如在下面所詳述的，免疫偶聯(lián)物My9-6-DM1使用含硫醇的美登木素生物堿(DM1)。DM1由下面的結(jié)構(gòu)分子式(1)表示[110]紫杉烷也是優(yōu)選的細胞毒劑。適合用于本發(fā)明的紫杉烷公開在美國專利No.6,372,738和6,340,701中。本發(fā)明的紫杉烷交聯(lián)物和細胞結(jié)合劑可使用目前已知的或以后開發(fā)的任何技術(shù)來形成。許多偶聯(lián)的方法在US專利5,416,064和US專利5,475,092中被講授。CC-1065及其類似物也是優(yōu)選用于本發(fā)明中的細胞毒性藥物。CC-1065及其類似物公開在美國專利No.6,372,738；6,340,701；5,846,545；和5,585,499。CC-1065是一種從zelensis鏈霉菌(Streptomyceszelensis)培養(yǎng)肉湯中分離的強力抗腫瘤抗生素。在體外CC-1065較普遍使用的抗癌藥物，如阿霉素，氨甲喋呤和長春花新堿，效價大約1000倍(B.K.Bhuyanetal.，CancerRes.，42，3532-3537(1982))。藥物如氨甲喋呤、道諾紅菌素、阿霉素、長春花新堿、長春花堿、苯丙氨酸氮芥、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥，加利車霉素，海兔毒肽和海兔毒肽類似物也適合制備本發(fā)明的交聯(lián)物。藥物分子也可通過中間載體分子如血清白蛋白與抗體分子連接。抑制表達CD33的細胞的生長[114]也包括在本發(fā)明中的是抑制表達CD33的細胞生長的方法。這些方法使用本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物，以及本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物結(jié)合一種或多種其他的治療藥劑。合適的治療性藥劑包括那些直接或間接抑制表達CD33的細胞生長的藥劑。如在此所使用的術(shù)語“抑制(inhibit)”和“抑制作用的(inhibiting)”應(yīng)該理解為包括對細胞生長的任何抑制性作用，包括細胞死亡。抑制性作用包括瞬時的作用，持續(xù)的作用和永久的作用。治療性應(yīng)用[117]本發(fā)明也包括本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物的治療性應(yīng)用，其中所述的抗體或免疫偶聯(lián)物可以藥學(xué)上可接受的劑型給予受試對象?？梢造o脈推注或持續(xù)輸注一段時間，通過肌肉內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑給藥。它們也可通過腫瘤內(nèi)，腫瘤旁，病灶內(nèi)或病灶旁途徑給藥以發(fā)揮局部以及全身性治療作用。藥學(xué)上可接受的藥物劑型一般包括藥學(xué)上可接受的藥劑如載體，稀釋劑和賦形劑。這些藥劑是為人所熟知的，最合適的藥劑可由本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)臨床情況需要來確定。合適的載體，稀釋劑和/或賦形劑的實例包括(1)Dulbecco氏磷酸緩沖鹽水，pH～7.4，含有大約1mg/ml至25mg/ml人血清白蛋白，(2)0.9％鹽水(0.9％w/vNaCI)，和(3)5％(w/v)葡萄糖。在其他的治療性應(yīng)用中，本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物可與一種或多種其他的治療劑共同給藥。治療劑是可以尋求殺死或限制癌細胞生長，同時對宿主的損害最小的藥物。因此，這種治療劑可利用癌細胞特性(例如，代謝，血管化作用或細胞表面抗原的遞呈)與健康宿主細胞之間的任何差異。腫瘤形態(tài)學(xué)的差異是干預(yù)的潛在部位。例如，治療劑可以是抗體如抗VEGF抗體，其可用來延緩實體腫瘤內(nèi)部的血管化作用，因此降低其生長速率。合適的治療劑包括但不限于，細胞毒性或細胞生長抑制劑(cytostaticagents)。紫杉醇是優(yōu)選的治療劑，它也是一種細胞毒劑。其他的治療劑包括但不限于，佐劑如鹽酸格拉司瓊，雄激素抑制劑如醋酸亮丙瑞林，抗生素如阿霉素，抗雌激素藥物如它莫西分，抗代謝藥物如干擾素α-2a，酶抑制劑如ras法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，免疫調(diào)節(jié)物如阿地白介素(aldesleukin)，和氮芥衍生物如鹽酸苯丙氨酸氮芥，和類似物。當以含水劑型存在，而不是被凍干時，抗體一般配制的濃度為大約0.1mg/ml至100mg/ml，盡管該范圍以外較大的變化也是允許的。對于疾病的治療，抗體或偶聯(lián)物的合適劑量要依賴于要治療的疾病類型，如上所規(guī)定，疾病的嚴重性和病程，抗體應(yīng)用的目的是否是預(yù)防性或治療性的，以往治療的療程，患者的臨床病史和對抗體的反應(yīng)，以及主治醫(yī)生的判斷?？贵w適合在一個時間或在一系列治療過程中給予患者。根據(jù)疾病的類型和嚴重性，大約0.015至15mg抗體/患者體重(kg)是給予患者的初始候選劑量，例如一次或多次單獨給藥，或連續(xù)輸注。對于在幾天或更長時間內(nèi)重復(fù)給藥，根據(jù)情況，治療要一直重復(fù)直至達到對疾病癥狀所需的抑制。但不排除可使用其他的給藥方案。本發(fā)明的治療性應(yīng)用包括治療患病受試對象的方法。用本發(fā)明的方法治療的疾病是以表達CD33為特征的疾病。這種疾病包括骨髓增生異常綜合征(MDS)和癌癥如急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。專業(yè)技術(shù)人員要理解的是本發(fā)明的方法也可用來治療還未描述但特征是表達CD33的其他疾病。本發(fā)明的治療性應(yīng)用也可在體外和離體實施。體外應(yīng)用的實例包括純化被CD33陽性細胞如髓系細胞污染的細胞群。該法包括在存在細胞毒My9-6免疫偶聯(lián)物的情況下培養(yǎng)細胞群，然后去掉死的CD33陽性細胞。體外非臨床應(yīng)用的條件是為人所熟知的(見，例如Uckunetal.，1986，JExp.Med.163，347-368；Uckunetal.，1985，J.Immunol.134，3504-3515；Ramakrishnanetal.，1985，JImmunol.3616-3622)。臨床離體應(yīng)用的實例包括在自體骨髓在回輸給相同患者之前的處理，以便殺死患病或惡性髓系細胞(RoyD.C.etal.，1995，J.Clin.Immunol.15，51-57)。診斷和研究應(yīng)用[128]除了在此所討論的抗體治療性應(yīng)用以外，本發(fā)明的抗體可用于許多已知的診斷和研究應(yīng)用中。例如，本發(fā)明的抗體可用于CD33的純化，檢測，和靶向，包括在體外和體內(nèi)的診斷方法中。例如，抗體可用于免疫測定中，定量和定性測量生物學(xué)樣品中細胞表達的CD33水平。見，例如Harlowetal.，AntibodiesALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress，2nded.1988)，在此整體合并為參考文獻。例如，本發(fā)明的抗體可用于競爭結(jié)合測定，直接和間接夾心測定(sandwichassays)，以及免疫沉淀測定(immunoprecipitationassays)中(Zola，MonoclonalAntibodiesAManualofTechniques，pp.147-158(CRCPress，Inc.，1987))。本發(fā)明的抗體也可用于體內(nèi)的成像，其中將用可檢測部分如不透射線試劑或放射性同位素標記的抗體給予受試對象，優(yōu)選進入血流，檢測宿主中標記抗體的出現(xiàn)和位置。這種成像技術(shù)可用于惡性腫瘤的分期和治療。抗體用在宿主中可檢測到的任何部分來標記，不管是核磁共振、放射學(xué)，或本領(lǐng)域中已知的其他檢測方式。標記可以是能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的任何可檢測部分。例如，標記可以是生物素標記，酶標記(例如，熒光素酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和辣根過氧化物酶)，放射標記(例如，3H、14C、32P、35S和125I)，熒光基團如熒光或化學(xué)發(fā)光化合物(例如，異硫氰酸熒光素、若丹明)，成像劑(例如，Tc-m99和銦(111In))和金屬離子(例如，鎵和銪)。可應(yīng)用本領(lǐng)域中已知的任何方法將抗體與標記偶聯(lián)，包括在Hunteretal.，1962，Nature144945；Davidetal.，1974，Biochemistry131014；Painetal.，1981，J.Immunol.Meth.40219；Nygren，J.，1982，Histochem.andCytochem.30407中描述的那些方法。本發(fā)明的抗體也可用作親和純化劑。在此過程中，采用本領(lǐng)域中為人所熟知的方法，抗體被固定在合適的支持物上，如Sephadex樹脂或濾紙。因此，CD33可從生物學(xué)樣品中分離和純化。多核苷酸，載體，宿主細胞和制備抗體的方法[135]本發(fā)明進一步提供了含有編碼本發(fā)明的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明也包括了編碼可結(jié)合CD33的多肽，，和在嚴謹型雜交條件下與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸，其中所述的嚴謹型雜交條件包括在60℃，6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt溶液，和100μg/ml熱變性的鮭魚精DNA中預(yù)雜交2小時；60℃雜交18小時；在4×SSC，0.5％SDS，0.1％焦磷酸鈉中60℃30分鐘，沖洗2次；2×SSC，0.1％SDS60℃30分洗滌2次。多核苷酸可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法獲得，多核苷酸的核苷酸序列可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法測定。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，編碼抗體的多核苷酸可從化學(xué)合成的寡核苷酸組合而成(例如，如Kutmeieretal.，1994，BioTechniques17242中所述)，簡言之，涉及合成含有部分編碼抗體的序列的重疊寡核苷酸，對這些寡核苷酸退火和連接，然后是通過PCR擴增被連接的寡核苷酸。構(gòu)建含有抗體編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的重組載體的方法在本領(lǐng)域中是為人所熟知的。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)，和體內(nèi)遺傳重組。因此本發(fā)明提供了可復(fù)制的載體，該載體含有編碼本發(fā)明抗體分子，或其重鏈或輕鏈，或重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)區(qū)，或任何之一的抗原決定簇結(jié)合片段的核苷酸序列，可操作地與啟動子連接。重組載體通過傳統(tǒng)的技術(shù)被轉(zhuǎn)移至宿主細胞，然后轉(zhuǎn)染的細胞通過傳統(tǒng)的技術(shù)培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。因此，本發(fā)明包括含有編碼本發(fā)明抗體，或其抗原決定簇結(jié)合片段的多核苷酸的宿主細胞，所述的多核苷酸可操作地與異源啟動子相連。在優(yōu)選的實施方案中，為了表達整個免疫球蛋白分子，編碼重鏈和輕鏈的載體可在宿主細胞中共表達。多種宿主表達載體系統(tǒng)可用來表達本發(fā)明的抗體分子。這種宿主表達系統(tǒng)代表一些載體，通過這些載體可產(chǎn)生并隨后純化目的編碼序列，但也代表一些細胞，當用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時，可原位表達本發(fā)明的抗體分子。這些包括但不限于微生物如用含有抗體編碼序列的重組細菌噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌(例如，大腸桿菌，枯草桿菌)，；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，釀酒酵母和畢赤酵母)；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用重組病毒表達載體感染的(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或攜帶了重組表達構(gòu)建物的哺乳動物細胞系統(tǒng)(例如，COS，CHO，BHK，293，3T3細胞)，所述構(gòu)建物含有來自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或來自哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒后期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)。優(yōu)選地，細菌細胞如大腸桿菌，更優(yōu)選地，真核細胞，特別是為了表達整個重組抗體分子，可用來表達重組抗體分子。例如，哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，與一種載體，如來自人巨細胞病毒的主要中間體早期基因啟動子組合在一起，是抗體的有效表達系統(tǒng)(Foeckingetal.，1986，Gene45101；Cockettetal.，1990，Bio/Technology82)。對于長期，高產(chǎn)量的生產(chǎn)重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，穩(wěn)定表達抗體分子的細胞系可被工程化。與其使用含有病毒復(fù)制起始點的表達載體，宿主細胞不如用合適表達控制元件控制的DNA(例如，啟動子，增強子，序列，轉(zhuǎn)錄終止子，聚腺苷酰位點等等)和可選擇標記物轉(zhuǎn)化。在導(dǎo)入外源DNA后，工程化細胞可在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)至選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的可選擇標記物為選擇提供了抗性，使細胞穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合進其染色體中，生長形成轉(zhuǎn)化灶，依次被克隆，擴大成為細胞系。這種方法的優(yōu)勢是可用來工程化表達抗體分子的細胞系。這種工程化細胞系特別用于篩選和評價可直接或間接與抗體分子相互作用的化合物。一旦本發(fā)明的抗體分子被重組表達，可通過本領(lǐng)域中已知的純化免疫球蛋白分子的任何方法來純化，例如通過色譜(例如，離子交換色譜，親和性，特別是在蛋白A和篩分柱色譜后與特異抗原的親和色譜)，離心，差示溶解性(differentialsolubility)，或通過純化蛋白的任何其他標準技術(shù)。實施例[145]本發(fā)明現(xiàn)通過參照下面的實施例來進行描述，其目的僅為說明，并不限制本發(fā)明。實施例1鼠My9-6抗體[147]在此第一個實施例中，公開了本發(fā)明鼠My9-6抗體的完全基本氨基酸結(jié)構(gòu)和cDNA序列，以及其結(jié)合特性和以重組形式表達的方式。因此，提供了本發(fā)明抗體及其制備的全部和完全的公開，這樣免疫學(xué)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將能夠制備所述的抗體，不需創(chuàng)造性試驗。1.1.My9-6抗體的產(chǎn)生，生產(chǎn)和特性[149]用CD33抗原轉(zhuǎn)染的3T3鼠成纖維細胞系用來進行免疫。5月齡BALB/c雌鼠在0天用轉(zhuǎn)染的3T3鼠成纖維細胞系(2.5×106細胞，懸浮在0.2mLPBS中)腹腔內(nèi)免疫。用0.2mL細胞懸液如下激發(fā)動物第13天，5×106細胞；第21天，5×106細胞。在第24天，處死小鼠，取其脾臟。脾臟置于兩個毛玻璃片之間以獲得單細胞懸液，用含有青霉素和鏈霉素(SFM)的無血清RPMI培養(yǎng)基洗滌。在冰上，脾細胞團重新懸浮于10mL、0.83％(w/v)氯化銨水溶液10分鐘以溶解紅細胞，然后用無血清培養(yǎng)基(SFM)洗滌。脾細胞(1.6×108)與來自非分泌性鼠骨髓瘤細胞系P3X63Ag8.653(ATCC，Rockville，MD；cat.no.CRL1580)的骨髓瘤細胞(5.4×107)混合在試管中，用無血清RPMI培養(yǎng)基(SFM)洗滌。去掉上清液，細胞團稀釋至2×107細胞/mL。細胞以2×107細胞/板接種在包被以15mg/mL刀豆素A的組織培養(yǎng)板中。培養(yǎng)板37℃溫育溫育1小時。輕輕地從培養(yǎng)板中去掉上清液。逐滴緩慢加入1mL聚乙二醇溶液(40％PEGw/v)?；蝿优囵B(yǎng)板，溫育30秒。去掉PEG并棄除。緩慢加入5mLSFM沖洗板兩次，然后棄液。最后一次沖洗后，加入5mL添加了5％胎牛血清(FBS)的SFM。培養(yǎng)板37℃溫育過夜。溫育后，用細胞刮從板上刮除細胞，并集中。沖洗培養(yǎng)板，并收集細胞。離心獲得細胞團，并重新懸浮在添加了5％FBS，青霉素-鏈霉素和次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)的RPMI-1640生長培養(yǎng)基中。細胞以2×105細胞/孔接種在含有巨噬細胞培養(yǎng)層的96孔平底組織培養(yǎng)板中。用于免疫和雜交瘤生產(chǎn)的一般條件的描述見J.Langone和H.Vunakis(主編，MethodsinEnzymology，Vol.121，″ImmunochemicalTechniques，PartI″；1986；AcademicPress，F(xiàn)lorida)和E.Harlow和D.Lane(″AntibodiesALaboratoryManual″；1988；ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork。也可使用生產(chǎn)免疫雜交瘤的其他技術(shù)，如本領(lǐng)域中專業(yè)技術(shù)人員所熟知的。從雜交瘤克隆的培養(yǎng)上清液篩選與用CD33抗原轉(zhuǎn)染的細胞和人組織細胞淋巴瘤細胞系U-937(ATCCCRL-1953.2)結(jié)合，和缺少與鼠成纖維細胞系結(jié)合能力的克隆。這些克隆被擴大并進行亞克隆。亞克隆的培養(yǎng)上清液通過上述的結(jié)合測定被進一步篩選。通過這種步驟，亞克隆3E7-H2-3D8(My9-6)被選擇重鏈和輕鏈基因被克隆和測序，描述如下。使用ELISA對表達CD33抗原的細胞系和這種抗原的陰性細胞系篩選雜交瘤上清液對CD33抗原的特異結(jié)合。細胞分別從組織培養(yǎng)瓶中收獲，懸浮在含有10％FBS的生長培養(yǎng)基中，離心成團，用PBS洗滌。洗滌的細胞(100μL大約1-3×106細胞/mL)加入至包被以植物血球凝集素(100μL20μg/mLPHA)的Immulon-2HB板的孔中，離心并在PHA包被的孔中粘附10分鐘。輕彈有細胞的培養(yǎng)板去掉PBS，然后37℃過夜干燥。37℃下用5mg/mLBSA的PBS溶液封閉孔1小時，然后用PBS溫柔洗滌。然后將等體積的雜交瘤克隆的上清液(100μL；在封閉緩沖液中稀釋)加入至含有表達CD33抗原和不表達CD33的細胞的孔中，并在環(huán)境溫度下溫育1小時。用PBS沖洗孔，與羊抗鼠IgG抗體辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(100μL；封閉緩沖液中)溫育1小時，然后沖洗多次，使用ABTS/H2O2底物檢測結(jié)合作用。來自3E7雜交瘤亞克隆的典型上清液在與過度表達CD33抗原的細胞溫育過程中產(chǎn)生的信號為0.50吸光度單位，相比而言，與CD33抗原陰性的細胞溫育過程中獲得的值為0.10。雜交瘤生長在BALB/c小鼠的腹水中。解凍一瓶冰凍的雜交瘤細胞，細胞在組織培養(yǎng)瓶中擴大獲得產(chǎn)生腹水所必需數(shù)量的細胞。接觸過抗原的BALB/c小鼠(已經(jīng)預(yù)先用0.5mL降植烷經(jīng)腹腔注射10-14天)腹腔注射0.5mL磷酸緩沖鹽水(PBS)中的1×106細胞。注射細胞后12至18天，用注射器從小鼠的腹腔吸取腹水。收集的腹水液1000rpm離心5分鐘，然后將上清液12,000rpm離心30分鐘。從清澈的上清液中按如下純化抗體步驟1硫酸銨沉淀。置于冰上的上清液用2體積的冷PBS稀釋，攪拌，然后緩慢地用1體積冷的，飽和的(100％)硫酸銨溶液處理。當通過離心收集沉淀物時，溶液置于冰上大約5小時。沉淀團以小量的PBS溶解，得到的溶液在緩沖液中透析以進行蛋白A的親和純化步驟。步驟2Sepharose-蛋白A的親和純化。鼠My9-6的同型是具有κ輕鏈的IgG1。因此親和柱在含有3MNaCl，8.0的0.1Mtris.HCl緩沖液中進行平衡。相同緩沖液中抗體溶液流經(jīng)親和柱，用平衡緩沖液充分沖洗柱子，然后用含有0.15MNaCl的0.1M乙酸進行洗脫。通過測定280nm處的UV吸光度檢測各餾分，用1Mtris中和，然后在PBS中透析以便使用和儲存。純化的抗體首先鑒定與表達CD33的細胞，如轉(zhuǎn)染的鼠3T3成纖維細胞系和人U-937細胞系的結(jié)合和不能與在雜交瘤上清液篩選中描述的抗原陰性細胞系結(jié)合。為了進一步明確其與CD33抗原結(jié)合的特異性，在標記的muMy9-6和市售的抗CD33抗體My9之間進行競爭結(jié)合實驗。使用Goldmacheretal.，(1989，J.Cell.Physiol.141，222-234)所述的方法進行結(jié)合試驗。鼠My9-6抗體采用Iodo-gen技術(shù)用125I進行放射標記(Fraker，P.J.andSpeck，J.C.，1978，Biochem.Biophys.Res.Commun.80，849-857)。恒定量(3×10-9M)的125I-標記的muMy9-6與不斷增加濃度的非放射活性抗體，未標記的muMy9-6或未標記的My9混合，混合物與細胞(每個樣品1×106細胞)4℃溫育30分鐘。這些溫育在60μl緩沖液中進行，該緩沖液由添加了2.5％人血清的修改用于懸浮培養(yǎng)物的極限必需培養(yǎng)基(SMEM)組成。然后從含有未結(jié)合物質(zhì)的培養(yǎng)基中分離細胞，離心通過濃度為1.009g/ml的硅油(Aldrich)和石蠟油(Baker)混合物而進行。然后通過在油界面上切割離心管去掉細胞團，并用來在γ計數(shù)儀(LKB的RIAgamma1274型)上測定細胞相關(guān)的放射活性。測定的細胞相關(guān)放射活性與未標記的，競爭抗體的濃度作圖。結(jié)果在圖1中顯示兩種抗體，My9和My9-6，獲得非常相似的競爭結(jié)合曲線。這證明了My9和My9-6與相同的抗原結(jié)合，而且兩種抗體具有非常相似的結(jié)合親合力。因為My9是已被公開和接受的抗CD33標準品，因此可以得出結(jié)論My9-6是一種抗CD33抗體。My9抗體可從BioGenex(SanRamon，Ca94583；cat.no.AM267-5M)購得。1.2.My9-6抗體重鏈和輕鏈基因的克隆[158]如在MolecularProtocols(NB1455-p173)中所述，從匯合的T175瓶中的My9-6雜交瘤細胞中純化總RNA。在1％MOPS凝膠上檢查RNA的完整性，通過UV分光光度法測定濃度。使用GibcoSuperscriptII試劑盒和或寡dT或隨機六聚體引物，用4-5μg總RNA進行RT反應(yīng)?？赏ㄟ^使用Co等人(1992，J.Irnmunol.148(4)1149-54)所述的RACE法和Wang等人(2000，J.Immunol.Methods.233167-177)所述的簡并引物來實施PCR反應(yīng)。RACEPCR需要一個中間步驟將聚dG尾加至第一條cDNA鏈的3’末端上。用Qianeasy柱(Qiagen)純化RT反應(yīng)，在50μl1×NEB緩沖液4中洗脫。用0.25mMCoCl2、1mMdGTP和5單位末端轉(zhuǎn)移酶(NEB)，在1×NEB緩沖液4中對洗脫液進行dG加尾反應(yīng)?；旌衔镌?7℃溫育30分鐘，然后1/5的反應(yīng)混合物(10μl)直接加入至PCR反應(yīng)混合物中作為模板DNA。RACE和簡并PCR反應(yīng)是相同的，除了在引物和模板上有差異以外。如上面所提到的，末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)混合物直接用作RACEPCR模板，而RT反應(yīng)混合物直接用作簡并PCR反應(yīng)。在兩種反應(yīng)組中，使用相同的3’輕鏈引物，HindKLTATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQIDNO11)和3′重鏈引物，Bg12IgG1GGAAGATCTATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQIDNO12)。在RACEPCR中，1個聚dC5′引物被用于重鏈和輕鏈，EcoPolydCTATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC(SEQIDNO13)，而簡并5′末端PCR引物為SaclMKGGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQIDNO14)用于輕鏈，等量的EcoRlMHlCTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQIDNO15)和EcoRIMH2CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQIDNO16)的混合物，用于重鏈(混合堿基H＝A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，K＝G+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，V＝A+C+G，N＝A+T+G+C)。在MJ研究熱循環(huán)儀上使用由Wang等人(2000，J.Immunol.Methods.233167-177)改編的程序進行PCR反應(yīng)1)94℃，3分鐘；2)94C，15秒；3)45℃，1min；4)72℃，2分鐘；5)循環(huán)返回步驟#229次；6)最后72℃延伸10分鐘，完成反應(yīng)。PCR產(chǎn)物使用PCR引物產(chǎn)生的的限制性酶被克隆進pBluescriptIISK+(Stratagene)中。重鏈和輕鏈克隆通過LarkTechnologies或Seqwright測序服務(wù)進行測序。RACEPCR對My9-6輕鏈從未成功過。因此，為了證實cDNA序列的5’末端，進行另外簡并pCR和克隆。從簡并PCR克隆中測得的My9-6輕鏈cDNA序列，被輸入至NCBI的Blast搜索網(wǎng)址上(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，保存最上面的提交信號序列的5個鼠抗體序列。從這些信號肽使用Codehop網(wǎng)絡(luò)軟件(blocks.fhcrc.org/codehop.html)設(shè)計簡并PCR引物。EcoRI限制性位點加入至3個Codehop簡并引物中(圖2)，如上所述這些用于RT-PCR反應(yīng)中。1.3.重鏈和輕鏈樣品的制備和測序[165]muMy9-6抗體的重鏈和輕鏈通過SDS-PAGE在還原條件下被分離。還原和變性的抗體在12％Tris-甘氨酸凝膠上進行電泳(Novex，SanDiego，CA)。電泳后，使用CAPS/MeOH緩沖液將凝膠點至Immobilonpsq膜上。轉(zhuǎn)移后，用PonseauS對膜進行染色。切除對應(yīng)輕鏈和重鏈的帶，用于蛋白質(zhì)測序?？贵w的輕鏈從膜上通過自動Edman降解化學(xué)法在ABI494Procise測序儀上直接測序。重鏈的N末端被封閉，因此根據(jù)Gharahdaghi等人(1996)用胰蛋白酶原位消化蛋白。消化的混合物然后通過MALDI-TOF質(zhì)譜法在KratosKompactSEQ裝置上進行分析。被選擇的肽進行MS/MS以測定其序列。實施例2.通過表面重整對抗體可變區(qū)進行人源化[169]表面重整My9-6抗體以提供適合作為治療或診斷試劑的人源化版本，一般根據(jù)美國專利5,639,641中公開的原理和方法進行，如下所述。2.1.表面預(yù)測(surfaceprediction)[171]對于一組具有可溶解結(jié)構(gòu)的抗體，可變區(qū)殘基的溶劑可及性用來預(yù)測鼠My9-6抗體可變區(qū)的表面殘基。一組127個獨特抗體結(jié)構(gòu)的文件(file)(圖3)的氨基酸溶劑可及性使用MC軟件包進行計算(Pedersenetal.，1994，J.Mol.Biol.235(3)959-973)。來自該組127個結(jié)構(gòu)的10個最相似的輕鏈和重鏈氨基酸序列使用NCBI網(wǎng)址(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上的序列比對軟件進行測定。這10個抗體可變區(qū)每個可變區(qū)殘基的平均溶劑可及性使用Excel電子表格進行計算，平均可及性超過30％的位點被認為是表面殘基。平均可及性在25％和35％之間的位點進一步通過計算側(cè)向于兩側(cè)的兩個殘基相同的結(jié)構(gòu)的個別殘基可及性來考慮。2.2.分子建模(molecularmodeling)鼠My9-6可變區(qū)的分子模型使用牛津分子軟件包AbM來產(chǎn)生?？贵w框架區(qū)從具有最相似的氨基酸序列的抗體的結(jié)構(gòu)文件中構(gòu)建(輕鏈為1sb，重鏈為1bbj)，非典型CDR通過搜索含有非豐余可溶解結(jié)構(gòu)的C-a結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫來構(gòu)建。用GlaxoSmithKlineSwiss-PdbViewer來觀察構(gòu)型，確定位于CDR5？內(nèi)的殘基。2.3.人抗體選擇[175]鼠My9-6可變區(qū)的表面位置與Kabat數(shù)據(jù)庫中人抗體序列中的相應(yīng)位置進行比較(JohnsonandWu，2001，NucleicAcidsRes.29(1)205-6)?？贵w數(shù)據(jù)庫管理軟件SR(Searle，1998)用來從天然重鏈和輕鏈人抗體對中提取和比對表面殘基。具有最相同的表面殘基的人抗體可變區(qū)表面，特別關(guān)注位于CDR5？之內(nèi)的位點，被選擇來替換鼠My9-6抗體可變區(qū)的表面殘基。2.4.通過PCR誘變構(gòu)建人源化抗體基因[177]對鼠My9-6可變區(qū)cDNA克隆進行PCR誘變，來首先改變5’末端序列以匹配肽序列，然后構(gòu)建表面重整的，人My9-6基因。設(shè)計引物組建立原來未在初始簡并PCR克隆中測序的鼠源性殘基(輕鏈位點N1，M3，L4，和S7，和重鏈位點Q3和P7)。設(shè)計人源化的引物組制造所有形式的huMy9-6所需的6個氨基酸改變，并設(shè)計其他的引物可選擇改變4個5？殘基(圖4)。PCR反應(yīng)在MJ研究熱循環(huán)儀上根據(jù)下列程序進行1)94℃，1分鐘；2)94℃，15秒；3)55℃，1分鐘；4)72℃，1分鐘；5)循環(huán)返回步驟#229次；6)終止于最后的延伸步驟，72℃4分鐘。PCR產(chǎn)物用其相應(yīng)的限制性酶消化，并克隆進pBluescript克隆載體中。克隆被測序以證實氨基酸改變。2.5.人源化抗體的表達載體[180]輕鏈和重鏈配對序列被克隆進單個哺乳動物表達載體中。人可變序列的PCR引物產(chǎn)生了可使人信號序列加入進pBluescriptII克隆載體中的限制性位點。然后可變序列能被克隆進哺乳動物表達質(zhì)粒中，該質(zhì)粒中對于輕鏈或重鏈分別具有EcoRI和BsiWI或HindIII和ApaI(圖5)。輕鏈可變區(qū)序列可在框內(nèi)被克隆在人Igκ恒定區(qū)上，重鏈可變序列被克隆在人Igγ恒定區(qū)序列上。在最終的表達質(zhì)粒中，人CMV啟動子驅(qū)動輕鏈和重鏈cDNA序列的表達。2.6.人源化抗體的瞬時表達[182]293T細胞在Dulbecco′sModifiedEagleMedium(DMEM，BioWhittaker，12-614F)，10％熱滅活的胎牛血清(Hyclone，SH30071.03)，4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker，17-604E)，和1％青霉素/鏈霉素混合物(BioWhittaker，17-603E)中，6％CO237℃孵箱中培養(yǎng)。細胞每周以1∶10的稀釋度分離三次，保持亞匯合狀細胞群。轉(zhuǎn)染前24小時，用胰蛋白酶(BioWhittaker，17-161E)消化細胞；用臺盼蘭排除法(trypanblueexclusionmethod)計數(shù)活細胞，接種在10cm組織培養(yǎng)處理板(Corning，430167)上，密度為每板2×106細胞。轉(zhuǎn)染前一刻，用磷酸緩沖鹽水(PBS，用BioWhittaker10×PBS，17-517Q稀釋)輕輕地洗滌細胞，向細胞覆蓋含有1％超低IgG血清(GibcoBRL，16250-078)的7mL雜交瘤SFM(InvitroGen，12045-076)。瞬時轉(zhuǎn)染法由標準的QiagenPolyfect方案改變而來。對于要轉(zhuǎn)染的1個10cm板，將8μgCsCl級DNA與300μL雜交瘤SFM和80μLPolyfect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen，301107)混合。轉(zhuǎn)染混合物低速旋轉(zhuǎn)混合大約5秒，在環(huán)境溫度下溫育5分鐘。溫育后，向轉(zhuǎn)染混合物中加入1mL雜交瘤SFM，1％超低IgG血清，用吸液管上下吸放大約5次以混和。然后將轉(zhuǎn)染混合物加入至覆蓋細胞的7mL雜交瘤SFM中，輕輕晃動平板保證均勻分布。轉(zhuǎn)染反應(yīng)在組織培養(yǎng)箱中溫育過夜，一般16小時。然后小心地從細胞中去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，替換以20mL雜交瘤SFM，1％超低IgG。然后將轉(zhuǎn)染的細胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)72小時，此后收獲上清液，通過ELISA對抗體的產(chǎn)量定量。收獲的上清液4℃儲存至純化。2.7.人源化抗體的純化[185]通過添加1/10體積的1MTris/HCl緩沖液，pH8.0為蛋白A親和色譜制備上清液。pH調(diào)整后的上清液通過0.22μm的濾膜過濾，并負載在蛋白ASepharose柱(HiTrapProteinAHP，1mL，AmershamBiosciences)上，并用結(jié)合緩沖液(PBS，pH7.3)平衡。在樣品負載的過程中Q-Sepharose前置柱(10mL)連接在蛋白A的上游以減少細胞物質(zhì)如DNA的污染。在樣品負載后，去掉前置柱，倒轉(zhuǎn)蛋白A柱的方向以進行沖洗和洗脫。用結(jié)合緩沖液沖洗柱直至獲得穩(wěn)定的基線在280nm處沒有吸光度?？贵w用含有0.15MNaCl，pH2.8的0.1M醋酸緩沖液洗脫，使用的流速為0.5mL/min。收集大約0.25mL的餾分，加入1/10體積的1MTris/HCl，pH8.0進行中和。峰餾分在PBS，pH7.3中透析過夜。通過測定280nm處的吸光度對抗體進行定量，計算抗體的濃度，假定E2800.1％＝1.4。對抗體餾分進行吸光度光譜分析和SDS-PAGE以證實其純度。實施例3.人源化抗體的檢測[187]3.1.生長細胞進行結(jié)合分析[188]從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC#CCL-240)處獲得HL-60細胞。將細胞置于5％CO2空氣，37℃水套溫育箱(NapcoScientificCo.，Tualitan，Oregon)。細胞生長在添加了L-谷胺酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，以及50μg/mL硫酸慶大霉素(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)的RPMI培養(yǎng)基中。3.2.對HL-60細胞的直接結(jié)合測定[190]從T75培養(yǎng)瓶(NUNCLONTM，cat.no.153732)中收獲HL-60細胞，并在OmnifugeRTtabletop離心管(HaereusSeparations，Germany)中4℃大約300xg離心5分鐘。細胞以3×106細胞/mL的密度重新懸浮于FACS緩沖液中，包含2％(v/v)羊血清(SigmaChemicalCo.，StLouis，MO)的MEMα培養(yǎng)基，添加了L-谷胺酰胺(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)。使用多通道吸液管，將3×105細胞加入至Falcon96-孔圓底培養(yǎng)板(cat.no.3077)的孔中，然后置于冰上。使用Falcon96-孔可變形檢測板(cat.no.353911)，在FACS緩沖液中對每個檢測或?qū)φ瘴锲分苽潆p份11個兩倍系列稀釋液，起始濃度從2×10-8M開始。然后，100μl每種檢測或?qū)φ掌放c細胞混合。對照孔僅加入FACS緩沖液。冰上溫育培養(yǎng)板1小時，然后在冷凍離心機中300xg離心5分鐘。在含有10％漂白粉的廢液燒杯上迅速倒置從培養(yǎng)板中去掉試劑。輕輕旋轉(zhuǎn)晃動重新懸浮細胞，用冷的FACS緩沖液沖洗1次，離心，然后輕輕旋轉(zhuǎn)晃動重新懸浮。FITC標記的羊抗人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories，WestGrove，PA，cat.no.109-096-003)和FITC標記的羊抗鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories，WestGrove，PA，cat.no.109-095-088)以1∶100在FACS緩沖液中稀釋，向測定板上合適的孔中加入100μl。然后冰上繼續(xù)溫育測定板1小時，避光。以上述的同樣方法沖洗孔中未結(jié)合的二抗。輕輕旋轉(zhuǎn)晃動重新懸浮細胞，然后加入1％甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，10mM磷酸鉀，150mM氯化鈉，pH7.2)120μl/孔進行固定。然后在裝配了自動96孔加樣裝置的FACSan流式細胞儀(BectonDickinson，MountainView，CA)上分析測定板。3.3.質(zhì)膜制備[192]根據(jù)Vater等人(1995)所述的方法制備質(zhì)膜。簡言之，HL-60細胞在含有10％胎牛血清和50μg/mL硫酸慶大霉素的添加L-谷氨酰胺的RPMI中生長至1×106細胞/mL的密度。當獲得總共1×109細胞時，收獲細胞，在OmnifugeRT離心管中大約300xg離心，用Hanks平衡鹽溶液(LifeTechnologies，cat.no.14175-095)沖洗，一起置入1個50mL圓錐形離心管中。然后沉淀的細胞團在-80℃冷凍至少24小時，以促進細胞溶解和勻漿。為了制備質(zhì)膜，細胞團在37℃迅速復(fù)溫，然后在冰上儲存；所有隨后的步驟在4℃進行。沉淀的HL-60細胞團重新懸浮在8mL含有1mMEDTA，0.25M蔗糖，和1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的10mM，pH7.0的Tris-HCl緩沖液中。然后細胞團被轉(zhuǎn)移至15mLDounce組織磨臼(Wheaton，Millville，NJ)中進行細胞破碎(用緊密聯(lián)接的硼硅玻璃研杵搗20次)。在SorvalRC-5B冷凍超速離心機中使用SS-34轉(zhuǎn)子(Wilmington，DE)6000rpm離心勻漿10分鐘，輕輕地從沉淀的細胞團中去掉上清液。再次用8mL緩沖液沖洗細胞團一次，如上進行處理。合并的上清液加至1mL10mMTris-HCl，1mMPMSF，1mMEDTA，pH7.0的37％蔗糖夾層緩沖液上，并進一步在預(yù)冷的BeckmanL8-超速離心機用SW55ti轉(zhuǎn)子(BeckmanInstruments，PaloAlto，CA)33,000rpm處理70分鐘。從每個試管中取出正位于蔗糖層上面的乳白色質(zhì)膜層，并用4體積的10mMTris-HCl，1mMEDTA，1mMPMSF，pH7.0稀釋。然后將該溶液在超速離心機中18,000rpm繼續(xù)離心30分鐘。小心去掉上清液，得到的沉淀團重新懸浮在10mMTris-HCl，1mMEDTA，1mMPMSF，pH7.0中。HL-60膜制劑等分進1.5mL無菌螺帽Eppendorf管中，在液氮中冷凍，然后儲存在-80℃以備使用。使用PierceTMBCAAssay(PierceChemicalCompany，Rockford，IL，cat.no.23235)測定最終制劑的總蛋白濃度。3.4.HL-60膜的直接結(jié)合測定[194]如上所述制得的HL-60膜，在去離子水中以10μg/mL的起始濃度，使用Labconco真空干燥器(Labconco，Corp，KansasCity，MO)在Immulon296-孔測定板(DynexLaboratories，Chantilly，VA)的聚苯乙烯表面上在環(huán)境溫度下過夜干燥。然后ELISA測定板用Tris緩沖鹽水(50mMTris-HCl，150mM氯化鈉，pH7.5，TBS)的1％餾分V牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO，cat.no.A-3294)，0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO，cat.no.P-2287)溶液封閉，每孔300μL，37℃1小時。在此封閉步驟后，將板中的封閉緩沖液中排出，在紙巾上吸干。在封閉緩沖液中制備檢測或?qū)φ赵噭┑膬蓚€三倍系列稀釋液，分成四份，在可變形96孔檢測板上，以3.13×10-9M起始向下滴定至5.29×10-14M。陰性對照孔僅含有封閉緩沖液。50μL每種稀釋液轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜包被的檢測板上指定的孔中，然后4℃溫育過夜。然后將孔內(nèi)容物吸出至一個含有10％(v/v)漂白粉的廢液瓶中，用含有0.1％(v/v)Tween-20(沖洗緩沖液)的TBS沖洗板3次，在紙巾上吸干。用封閉緩沖液稀釋1∶1000的羊抗鼠IgG-HRP或驢抗人IgG-HRP在適當?shù)目字袡z測結(jié)合的抗My9-6抗體的量。這些二抗在檢測板上室溫下溫育1小時，避光。如前洗板和吸干。檢測板使用TMB(BioFXLaboratories，Randallstown，MD，cat.no.TMBW-0100-01)顯影，然后用終止液(BioFXLaboratories，Randallstown，MD，cat.no.STPR-0100-01)淬滅。使用TitertekMultiskanPlusMKII平板讀數(shù)儀(Huntsville，AL)在A450nm對檢測板進行讀數(shù)。3.5.對HL-60膜進行競爭結(jié)合測定[196]如上所述制得的HL-60膜，在去離子水中以10μg/mL的起始濃度，使用Labconco真空干燥器(Labconco，Corp，KansasCity，MO)在Immulon296-孔測定板(DynexLaboratories，Chantilly，VA)的聚苯乙烯表面上在環(huán)境溫度下過夜干燥。然后ELISA測定板用Tris緩沖鹽水(50mMTris-HCl，150mM氯化鈉，pH7.5，TBS)的1％餾分V牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO，cat.no.A-3294)，0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO，cat.no.P-2287)溶液封閉，每孔300μL，37℃1小時。在此封閉步驟后，將板中的封閉緩沖液中排出，在紙巾上吸干。在封閉緩沖液中制備檢測或?qū)φ赵噭┑膬蓚€三倍系列稀釋液，分成四份，在可變形96孔檢測板上，以1.25×10-8M起始向下滴定至2.44×10-11M(2x所需的終濃度)。然后這些未標記的競爭試劑與等體積的2.5×10-10M生物素化鼠抗-My9-6(ImmunoGen，Inc.，Cambridge，MA)混合；陽性對照不含競爭試劑，而陰性對照僅含封閉緩沖液。50μL這些稀釋液轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜包被的檢測板上指定的孔中，然后4℃溫育過夜。然后將孔內(nèi)容物吸出至一個含有10％(v/v)漂白粉的廢液瓶中，用含有0.1％(v/v)Tween-20(沖洗緩沖液)的TBS沖洗板3次。檢測板在紙巾上吸干，每孔用在封閉緩沖液中1∶5,000稀釋的100μl抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶(JacksonImmunoResearchLaboratories，WestGrove，PA，cat.no.016-050-084)檢測結(jié)合的生物素化的鼠抗My9-6的量。室溫下溫育1小時后，沖洗孔中未結(jié)合的二抗試劑，檢測板使用TMB(BioFXLaboratories，Randallstown，MD，cat.no.TMBW-0100-01)顯影，用終止液(BioFXLaboratories，Randallstown，MD，cat.no.STPR-0100-01)淬滅。使用TitertekMultiskanPlusMKII平板讀數(shù)儀(Huntsville，AL)在A450nm對檢測板進行讀數(shù)。3.6.克隆鼠My9-6抗體可變區(qū)[198]通過上述的RT-PCR法克隆得到鼠My9-6抗體的可變區(qū)。若干單個的輕鏈和重鏈克隆被測序以鑒定和避免聚合酶可能產(chǎn)生的序列錯誤。對于輕鏈僅獲得一條序列，但從重鏈RT-PCR克隆中分別得出2條序列。為了確定鼠My9-6輕鏈可變區(qū)的實際序列，通過Edman降解，基質(zhì)輔助激光離子吸收(MALDI)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)進行分析。My9-6輕鏈氨基末端的22個殘基通過Edmian降解進行測序，在圖6A中顯示。來自簡并RT-PCR克隆的初始cDNA序列除了可能由簡并引物產(chǎn)生的4個殘基外全部匹配。通過Edman降解測定的肽序列后來通過5’末端信號肽序列中的簡并引物產(chǎn)生的RT-PCR克隆而證實。胰蛋白酶消化片段的MS-MS分析也證實了輕鏈CDR1和2的序列(圖6B)?？傊?，這些肽分析證實了所預(yù)測的鼠My9-6輕鏈氨基酸序列來自RT-PCR產(chǎn)生的cDNA克隆。如重鏈序列所普遍的一樣，muMy9-6重鏈氨基末端可被焦谷氨酸殘基阻斷，因此不能通過N末端Edman降解測序。而是通過胰蛋白酶消化產(chǎn)生內(nèi)部序列數(shù)據(jù)，通過基質(zhì)輔助激光離子吸收(MALDI)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)進行分析。鑒定了一個1788道爾頓的片段，其預(yù)測的序列與cDNA克隆2的一部分相同(圖7)。對于cDNA克隆2這個序列包含了CDR3的5個殘基，因此對于muMy9-6重鏈的陽性鑒定是一個理想的肽，。僅產(chǎn)生最初從簡并RT-PCR克隆2獲得的序列的多個RACEPCR克隆也可確認該肽序列。來自多個cDNA克隆和肽序列分析的綜合結(jié)果提供了最終的鼠My9-6輕鏈和重鏈序列，在圖8中顯示。使用Kabat和AbM定義法，鑒定了三個輕鏈和重鏈CDR(圖8和9)。搜索NCBIIgBlast數(shù)據(jù)庫表明muMy9-6抗體輕鏈可變區(qū)最可能來自鼠IgV？8-27胚系基因，而重鏈可變區(qū)最可能來自IgVhV102胚系基因(圖10)。3.7My9-6抗體的可變區(qū)表面殘基測定[203]Pedersen等人(1994，J.Mol.Biol.235959-973)和Roguska等人(1996，ProteinEng.9895-904)所述的抗體表面重整技術(shù)是以預(yù)測鼠抗體可變序列的表面殘基開始的。表面殘基被定義為其總表面區(qū)域的至少30％可接觸到水分子的氨基酸。缺少可發(fā)現(xiàn)muMy9-6表面殘基的可溶解結(jié)構(gòu)的情況下，在一組127個抗體結(jié)構(gòu)文件中對10個具有最同源序列的抗體進行配比(圖11A&B)。對于這些配比的序列平均每個Kabat位點的溶劑可及性，對于每個殘基相對可及性的分布顯示在圖12中。幾種表面位點的平均可及性在25％和35％之間。這些看上去更接近于僅平均具有兩個相同的側(cè)向兩側(cè)的殘基的抗體(圖13A和B)。在另外的分析后，muMy9-6重鏈的25個預(yù)測的表面殘基未變化，但輕鏈中的Kabat位點15和70需要進一步考慮。輕鏈位點15上的丙氨酸在所有10個結(jié)構(gòu)中的平均可及性為34.4％，但僅有一個單一結(jié)構(gòu)1mcp，與muMy9-6具有相同的側(cè)向殘基。在這種結(jié)構(gòu)中，Ala15的相對可及性僅為18.2％。因為在這個單一結(jié)構(gòu)中，對于位點15，Ala15較平均殘基可及性大幅度降低，所以側(cè)向殘基僅有一處差異的三個結(jié)構(gòu)(1ap2，1frg，和1hil)也一起被平均。這三個結(jié)構(gòu)的平均可及性再次達到33.3％，使Ala15成為一個預(yù)測的表面殘基。最終，表面重整的抗-B4，C242和表面重整的專利本身預(yù)測輕鏈位點15是一個表面殘基?？傊?，保守的方法是假設(shè)muMy9-6輕鏈位點15是一個表面殘基。muMy9-6輕鏈位點70也需要特別的考慮，最終導(dǎo)致其保守預(yù)測成為一個表面殘基。對于輕鏈初始的表面預(yù)測工作使用僅來自5個最同源輕鏈結(jié)構(gòu)的MC數(shù)據(jù)就完成了，在本組中Asp70是一個被預(yù)測的表面殘基。以后，使用另外5個最同源的結(jié)構(gòu)，位點70被發(fā)現(xiàn)其平均可及性為29.1％，如圖13A顯示。另外，10個結(jié)構(gòu)中的9個具有相同的側(cè)向殘基，本組的平均值為29.2％的可及性。因為這個殘基看上去非常接近于30％的界值，表面重整專利稱位點70位表面位點，可及性數(shù)據(jù)被進一步核對。對于結(jié)構(gòu)1Ive位點70的相對可及性為22.5％，較下一個最低的相對可及性27.2％低5個百分點。因為1Ive是最同源的結(jié)構(gòu)，它是很低的異常值，因此對除1Ive外還對具有相同側(cè)向殘基的8個結(jié)構(gòu)進行了平均，本組的平均可及性為30.1％。這與下面的事實，即初始的muMy9-6輕鏈分析和表面重整專利稱輕鏈位點70為表面位點，一起形成保守的預(yù)測，muMy9-6輕鏈Asp70是一個表面殘基。3.8.分子建模確定殘基是否在CDR的5范圍之內(nèi)[207]分析用AbM軟件包產(chǎn)生的分子構(gòu)型以確定muMy9-6表面殘基是否位于CDR的5之內(nèi)。為了表面重整抗體，CDR以外的所有表面殘基必須被改變?yōu)槠淙说膶?yīng)副本，但位于CDR5之內(nèi)的殘基也可能對抗原的結(jié)合和特異性有決定作用。因此這些5殘基必須在整個人源化過程中被鑒定和考慮。用來表面重整的CDR定義結(jié)合了重鏈CDR2的AbM定義和其他5個CDR的Kabat定義(圖9)。鼠的模型用Swiss觀察器軟件分析，圖14顯示了在輕鏈或重鏈序列的任何CDR殘基5之內(nèi)的殘基。3.9.選擇最同源的人抗體表面[209]使用SR軟件從Kabat抗體序列數(shù)據(jù)庫中為表面重整muMy9-6得出了候選的人抗體表面。這個軟件提供了一個界面僅搜索抗體數(shù)據(jù)庫中特殊的殘基位點。為了保留天然的配對，輕鏈和重鏈的表面殘基在一起比較。來自Kabat數(shù)據(jù)庫中最同源的人抗體表面以序列同一性的等級順序進行配比。如SRKabat數(shù)據(jù)庫軟件所配比的一樣，最上面的5個表面在圖15中顯示。然后這些表面被比較以鑒定人抗體表面將需要在CDR5之內(nèi)的最小變化?？贡愿窝撞《究贵w，LC3bPB(IvanovskiM.etal.，1998，Blood91(7)2433-42)，需要最小數(shù)目的表面殘基改變(總共10個)，這些殘基中僅有4個位于CDR的5之內(nèi)。muMy9-6的全長可變區(qū)序列也使用SR與Kabat人抗體數(shù)據(jù)庫進行配比，LC3bPB被鑒定為第14個最相似的人可變區(qū)序列(數(shù)據(jù)未顯示)。因為LC3bPB抗體提供了最同源的表面，需要最小數(shù)目的5殘基改變，因此它是表面重整muMy9-6的最佳候選物。3.10.為人源化My9-6抗體構(gòu)建My9-6基因[211]如上所述使用PCR誘變技術(shù)為huMy9-6產(chǎn)生10個表面殘基改變。因為LC3bPB的6個表面殘基超出了CDR的5以外，因此在所有形式的人源化My9-6中這些殘基從鼠改變成人(圖16A和B)。位于CDR的5之內(nèi)的4個表面殘基，Kabat輕鏈位點1，3和45和重鏈位點64，分別被改變?yōu)槿嘶虮Ａ魹槭蟮男问?，制成?6個人源化版本的My9-6。在這些中，最人源化的是1.0版本，因為它具有所有10個人的表面殘基。就保證最大結(jié)合親和性而言，最保守的版本是1.1版本，它保留了4個位于CDR的5之內(nèi)的鼠表面殘基。每個人源化My9-6抗體基因被克隆進抗體表達質(zhì)粒(圖5)中以進行瞬時和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染。3.11.結(jié)合數(shù)據(jù)[213]表面重整人源化的關(guān)鍵強度是通過保留了非表面的鼠框架殘基，人源化的My9-6應(yīng)該繼續(xù)與CD33結(jié)合，親和性不改變。但在CDR5之內(nèi)的3個表面殘基對抗原結(jié)合有作用，因此改變這些殘基將對結(jié)合產(chǎn)生負效應(yīng)。為了闡明這種關(guān)系，16種形式的人源化My9-6包括了在4個5殘基位點的每一個上人或鼠殘基的所有組合。這些組合的范圍從在每個非CDR表面位點上具有人源化殘基的最佳或最近似的人源化版本，1.0，至在4個5表面位點中的每一個中保留了鼠殘基的最保守形式，1.1，因此應(yīng)該保留野生型的結(jié)合能力。通過比較人源化My9-6形式與鼠My9-6的結(jié)合親和性，保留了野生型結(jié)合能力的最近似的人源化形式被選擇為表面重整的人源化My9-6。使用人源化版本的鼠My9-6和muMy9-6的直接和競爭結(jié)合試驗在表達CD33的人白血病細胞系，HL-60上進行。在HL-60質(zhì)膜或整個細胞上檢測3個最近似的人源化版本(V1.0、V1.3、V1.6)以及最保守的版本(V1.1)。圖17給出了每種條件的KD值，圖18顯示了huMy9-6，V1.0，相比muMy9-6的實施例結(jié)合曲線。為人源化My9-6版本，包括最近似的人源化版本1.0計算的KD值，位于muMy9-6KD值的試驗誤差之內(nèi)。競爭結(jié)合試驗結(jié)果液證明了huMy9-6抗體與muMy9-6本身一樣可同樣充分地競爭CD33的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)證明了全部人源化的My9-6，V1.0對HL-60質(zhì)膜和整個細胞的近似野生型結(jié)合親和性，不需要檢測其他的形式，因為1.0版本是最佳的人源化My9-6抗體。鼠My9-6抗體已經(jīng)被完全人源化，不喪失結(jié)合活性。從鼠至人表面殘基的變化不會引起結(jié)合活性的喪失，即使這些表面殘基中的4個位于CDR的5內(nèi)。在CDR的5的殘基被認為可能形成關(guān)鍵的vanderWaal觸點，可能影響這些CDR的結(jié)構(gòu)。My9-6人源化的結(jié)果表明如果表面重整的抗體數(shù)目增長，基于實際的結(jié)合數(shù)據(jù)的完全殘基位點分析可能成為較簡單查看位于CDR的5內(nèi)的任何殘基更為有效的靶向可疑殘基的方法。人源化My9-6V1.0(huMy9-6)是使用上述方法被人源化的第4個抗體。通過表面重整鼠抗體的可變區(qū)框架進行人源化被發(fā)展為標準人源化方法，包括CDR嫁接的一種改良方法，需要大量開發(fā)和再改造以維持結(jié)合活性。這可通過表面重整的huMy9-6抗體進行對比，僅涉及改變10個表面殘基，形成了具有完全人源化表面的完全活性的抗體。實施例4.My9-6-DM1免疫偶聯(lián)物[219]使用與美登木素生物堿藥物DM1交聯(lián)的My9-6抗體進行了人腫瘤異種移植物在小鼠中的臨床前功效研究。如下所討論的，My9-6-DM1保持了未修飾抗體與CD33的特異性和結(jié)合親和性，顯示在體外對CD33陽性腫瘤細胞的有效的抗原特異細胞毒性。用My9-6-DM1治療攜有已形成皮下HL-60腫瘤異種移植物的SCID小鼠，多次給藥可引起腫瘤的完全消退(regression)(20mg交聯(lián)抗體/kg/天，靜脈給藥×5天)，顯示沒有毒性，在最大可耐受劑量下反應(yīng)良好。相反，與賦形劑對照相比用My9-6抗體單獨治療對HL-60腫瘤生長沒有影響。在使用My9-6-DM1治療攜帶皮下THP-1異種移植物的小鼠過程中也觀察到類似的治療功效。4.1.試劑[222]抗體是上述針對人CD33的鼠單克隆My9-6抗體?？贵w修飾劑是N-N-琥珀酰亞胺酯4-(2-吡啶二硫代)戊酸鹽(SPP)[224]細胞毒性劑是美登素類似物，DM1，可從微生物發(fā)酵產(chǎn)物，安絲菌素P3合成。DM1是微管蛋白聚合作用的一種有效抑制劑。[225]4.2.My9-6-DM1的制備[226]My9-6-DM1通過用SPP修飾My9-6抗體，以每分子抗體導(dǎo)入3-5個吡啶二硫代基團而制備。DM1上硫醇取代基和抗體上的活性二硫化物官能基團之間的二硫化物交換提供了含有DM1的抗體偶聯(lián)物。(n可以是任何整數(shù))[227]4.3.通過流式細胞計數(shù)儀分析抗體和抗體偶聯(lián)物的結(jié)合[228]HL-60細胞與多個濃度的My9-6抗體或My9-6-DM1溫育。然后細胞被沖洗，與第二個FITC標記的抗鼠IgG抗體溫育。再次沖洗后，細胞用2％甲醛固定，使用BDFACScan流式細胞儀定量細胞相關(guān)的熒光。My9-6-DM1保留了可與未修飾抗體相比的特異CD33結(jié)合能力(圖19)。4.4.體外細胞毒性測定[230]使用表達CD33的THP-1細胞和CD33陰性細胞系Namalwa測量My9-6-DM1的細胞毒性。細胞接種在含有交聯(lián)物的培養(yǎng)基的96孔板中，在37℃溫育至集落形成(2-3周)。然后對集落進行評分，在計算中使用Poisson分布測定存活的部分。4.5.體內(nèi)鼠腫瘤異種移植物研究[232]皮下腫瘤模型-HL-60人前髓細胞性白血病細胞(0.1mL5×106細胞)皮下接種至雌性SCID小鼠的右側(cè)腹部。當腫瘤的大小達到100mm3(大腫瘤模型為400mm3)時通過靜脈注射側(cè)尾靜脈治療小鼠。每周測量腫瘤大小和小鼠體重兩次。存活模型-HL-60細胞(0.1mL5×106細胞)被靜脈注射進雌性SCID小鼠的側(cè)尾靜脈內(nèi)。腫瘤細胞注射處理后11天開始治療。每天檢查小鼠的半死狀態(tài)，腫瘤質(zhì)量(tumormass)或死亡。每周測量體重兩次。4.6.My9-6-DM1的體外特異性和功效[234]使用克隆源性測定來檢測與CD33陰性細胞系(Namalwa)相比My9-6-DM1對表達CD33的細胞(THP-1)的細胞毒性，其中通過定量治療后生長的集落數(shù)目來測定細胞殺傷活性。My9-6-DM1顯示了在體外對CD33陽性人腫瘤細胞有效的細胞殺傷活性(圖20)。沒有觀察到對CD33陰性細胞的明顯毒性，表明CD33依賴性細胞毒性是由于抗CD33抗體，My9-6的特異靶向作用。4.7.My9-6-DM1對小鼠內(nèi)人腫瘤異種移植物的作用[236]使用攜帶人HL-60腫瘤細胞異種移植物的SCID小鼠測定體內(nèi)My9-6-DM1的作用。HL-60細胞被皮下注射，使腫瘤生長至100mm3的平均大小。My9-6-DM1交聯(lián)物經(jīng)靜脈輸送每天一次，持續(xù)5天，劑量在圖21中標明。用藥劑量表示為交聯(lián)物中的mg抗體，其對應(yīng)的DM1劑量為大約15μgDM1/mg抗體。測量腫瘤的體積作為治療作用的一個標識，監(jiān)測小鼠的體重以指示治療引起的毒性。My9-6-DM1可使攜帶人HL-60細胞異種移植物的小鼠產(chǎn)生長期治愈作用，其劑量引起很小的毒性(圖21)。在被測的兩個最高劑量下(19和26mg/kg)，觀察到腫瘤完全消退，最大的體重損失小于10％(圖21A和B)。即使是在最低的被測計量下(13mg/kg)，5只小鼠中有2只顯示完全的治愈，而其他4只顯示的腫瘤消退為腫瘤生長被延緩了大約20天。采用THP-1白血病細胞系也觀察到了類似的結(jié)果，My9-6-DM1可使攜帶人THP-1腫瘤異種移植物的小鼠產(chǎn)生了長期治愈作用(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果與單獨使用My9-6抗體治療獲得的結(jié)果形成了鮮明的對比?？贵w單獨對腫瘤細胞生長沒有作用，即使在50mg/kg的劑量下(圖21C)。My9-6-DM1的活性可與已批準的抗CD33抗體加利車霉素偶聯(lián)物卡奇霉素吉妥組單抗相媲美?？ㄆ婷顾丶捉M單抗每4天用藥3劑量。初步試驗證明在無胸腺鼠已公布的MTD(0.3mg/kg)下卡奇霉素吉妥組單抗對SCID小鼠毒性太強(數(shù)據(jù)未顯示)。在本試驗中在100和200μg/kg劑量下也觀察到了明顯的毒性(圖21F)?？ㄆ婷顾丶捉M單抗顯示在本模型中在最大耐受劑量下(100μg/kg)僅有一般的腫瘤消退作用和生長延緩作用(大約25天)。在一個單獨的試驗中，My9-6-DM1的抗腫瘤活性可與未交聯(lián)的母體藥物，美登素的活性相媲美。攜帶HL-60腫瘤異種移植物的小鼠每天治療，持續(xù)5天，偶聯(lián)物的劑量為23mg抗體/kg或350μgDM1/kg；未交聯(lián)的藥物劑量為350μg/kg；或未交聯(lián)抗體劑量為23mg/kg。單獨用美登素治療的6只小鼠中的4只在治療后兩天死亡，表明這種水平的藥物毒性是非常強的。但藥物顯示對剩余3只小鼠的腫瘤生長有明顯的影響，生長延緩大約10天(圖22)。My9-6抗體單獨對腫瘤生長沒有影響，而My9-6-DM1偶聯(lián)物可引起腫瘤的完全消退。偶聯(lián)物治療對小鼠體重的影響(降低12％)稍高于以前的試驗，可能反映了偶聯(lián)物合成中的批間差異。在第70天開始觀察到在6只偶聯(lián)物治療的小鼠中出現(xiàn)了腫瘤的再生長。這些動物接受了與首次治療相同的第二次My9-6-DM1治療。第二次治療使“復(fù)發(fā)”腫瘤完全消退，沒有觀察到不良的毒性作用，這表明腫瘤的再生長不是因為偶聯(lián)物抗性細胞的生長。在本異種移植物模型中My9-6-DM1的強效作用表明甚至對HL-60腫瘤偶聯(lián)物也是有效的。在治療開始前使腫瘤生長至＞400mm3的體積。另外，將My9-6-DM1的活性與標準的化療藥物進行比較。My9-6-DM1可使SCID小鼠中的大腫瘤完全消退(圖23A&B)。另外，復(fù)發(fā)的腫瘤(6只小鼠中的2只)對My9-6-DM1的第二次治療是敏感的。用標準的化療藥物(Ara-C和黃膽素)對腫瘤的生長作用很小。較高的藥物劑量對小鼠的毒性是很大的(未顯示)。4.8.My9-6-DM1在HL-60細胞小鼠存活模型中的功效[243]My9-6-DM1在腫瘤異種移植物模型中的作用是驚人的，而我們也感興趣的是看到了偶聯(lián)物在鼠存活模型中的活性，其中HL-60細胞被直接注入至鼠尾靜脈中。在這個模型中，對照小鼠在注射細胞后30和50天之間死亡。在注射細胞后11天，開始用My9-6-DM1治療的小鼠顯示存活率大幅度增加，8只小鼠中的7只70天仍存活(圖24A)。在本模型中單獨使用美登素也顯示對鼠存活有明顯的影響，盡管8只小鼠中2只在開始治療后不久死亡，表明有一定的藥物毒性。本模型與皮下異種移植物模型相比美登素的相對作用表明HL-60腫瘤對這種環(huán)境中藥物的作用更敏感。開始治療后進一步的延緩作用證明了靶向和非靶向藥物之間的顯著差別。但即使在本模型中，標準的化療沒有產(chǎn)生明顯的存活率提高(圖24B)。最高的組合劑量顯示了非常明顯的藥物毒性。My9-6抗體單獨使用和卡奇霉素吉妥組單抗顯示對存活率有一定的增加。保藏聲明[245]根據(jù)布達佩斯條約的條款，制備鼠My9-6抗體的雜交瘤保藏于2002年11月7日，保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，1549郵箱，弗吉尼亞州馬納薩斯，20108，并被指定保藏號為PTA-4786。在本公開中，參考了某些專利和已印刷的出版物，其講授的內(nèi)容各自整體引入本文，以作參考。盡管本發(fā)明已經(jīng)被詳述，并以其特殊實施例作為參考。但對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說很明顯的是可對于進行各種變化和修改，并不違背其精神和范圍。序列表<110>伊謬諾金公司<120>抗-CD33抗體和使用其治療急性髓性白血病的方法<130>F174222<140>PCT/US2003/032737<141>2003-11-05<150>US60/424.332<151>2002-11-07<160>94<170>PatentInversion3.2<210>1<211>5<212>PRT<213>小鼠(Musmusculus)<400>1SerTyrTyrIleHis15<210>2<211>17<212>PRT<213>小鼠<220><221>MISCFEATURE<222>(16)..(16)<223>″X″可以是K或Q<400>2ValIleTyrProGlyAsnAspAspIleSerTyrAsnGlnLysPheXaa151015Gly<210>3<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>3GluValArgLeuArgTyrPheAspVal15<210>4<211>17<212>PRT<213>小鼠<400>4LysSerSerGlnSerValPhePheSerSerSerGlnLysAsnTyrLeu151015Ala<210>5<211>7<212>PRT<213>小鼠<400>5TrpAlaSerThrArgGluSer15<210>6<211>8<212>PRT<213>小鼠<400>6HisGlnTyrLeuSerSerArgThr15<210>7<211>118<212>PRT<213>小鼠<400>7GlnValGlnLeuGlnGlnProGlyAlaGluValValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpIleLysGlnThrProGlyGlnGlyLeuGluTrpVal354045GlyValIleTyrProGlyAsnAspAspIleSerTyrAsnGlnLysPhe505560LysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerThrThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaArgGluValArgLeuArgTyrPheAspValTrpGlyAlaGlyThr100105110ThrValThrValSerSer115<210>8<211>113<212>PRT<213>小鼠<400>8AsnIleMetLeuThrGlnSerProSerSerLeuAlaValSerAlaGly151015GluLysValThrMetSerCysLysSerSerGlnSerValPhePheSer202530SerSerGlnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnIleProGlyGln354045SerProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr65707580IleSerSerValGlnSerGluAspLeuAlaIleTyrTyrCysHisGln859095TyrLeuSerSerArgThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105110Arg<210>9<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化My9-6抗體重鏈可變區(qū)<400>9GlnValGlnLeuGlnGlnProGlyAlaGluValValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpIleLysGlnThrProGlyGlnGlyLeuGluTrpVal354045GlyValIleTyrProGlyAshAspAspIleSerTyrAshGlnLysPhe505560GlnGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerThrThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaArgGluValArgLeuArgTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThr100105110ThrValThrValSerSer115<210>10<211>113<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化My9-6抗體輕鏈可變區(qū)<400>10GluIleValLeuThrGlnSerProGlySerLeuAlaValSerProGly151015GluArgValThrMetSerCysLysSerSerGlnSerValPhePheSer202530SerSerGlnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnIleProGlyGln354045SerProArgLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr65707580IleSerSerValGlnProGluAspLeuAlaIleTyrTyrCysHisGln859095TyrLeuSerSerArgThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105110Arg<210>11<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物HindKL<400>11tatagagctcaagcttggatggtgggaagatggatacagttggtgc46<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物Bg12IgG1<400>12ggaagatctatagacagatgggggtgtcgttttggc36<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物EcoPolydC<400>13tatatctagaattccccccccccccccccc30<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物Sac1MK<400>14gggagctcgayattgtgmtsacmcarwctmca32<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物EcoR1MH1<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>15cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtc32<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物EcoR1MH2<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>16cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtcwgg35<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>簡并引物Leaddeg1<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>″n″可以是任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(29)..(29)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>17ttttgattctgctgtgggtgtccggnacntgygg34<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>簡并引物Leaddeg2<220><221>misc_feature<222>(28)..(28)<223>″n″可以是任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>18ttttgattcgctgctgctgctgtgggtnwsngg33<210>19<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>簡并引物Leaddeg3<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>″n″可以是任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>19ttttgattcccaggtgttcatgctgctgytnytntgggt39<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化作用引物My96LCBsrG1<400>20tacaggtgtacactccgatattgtgatcacccagactcc39<210>21<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My96LCOL1<400>21actggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctg35<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My96LCOL2<400>22gccacagttcgtttgatttccagtttggtgcctcc35<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My96HCBsrG1<400>23tacaggtgtacactcccaggttaagctgcagcagtctgg39<210>24<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My96HCOL1<400>24ccacggtcaccgtctcctcagcctccacc29<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列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0<210>89<211>20<212>PRT<213>人<400>89AspValThrLeuLeuProProGlyGlnArgGlyAspAlaAspAlaGlu151015GlnLysLysArg20<210>90<211>24<212>PRT<213>人<400>90GlnGlnAlaValLysProGlyLysGlyThrProGlyGlnGlnLysLys151015GlyLysSerSerSerGluAlaSer20<210>91<211>24<212>PRT<213>人<400>91GlnGlnAlaValLysProGlyLysGlyThrProGlyGlnGlnLysGln151015GlyThrProSerSerGluLysSer20<210>92<211>24<212>PRT<213>人<400>92GlnGlnAlaAlaLysProGlyLysGlyThrProGlyGlnGlnLysGln151015GlyGlySerSerSerGluGlnSer20<210>93<211>24<212>PRT<213>人<400>93GlnGlnAlaValLysProGlyLysGlyThrProGlyGlnGlnLysGln151015GlyThrSerSerSerGluGlnSer20<210>94<211>23<212>PRT<213>人<400>94GlnAlaValLysProGlyLysGlyThrProGlyGlnGlnLysGlnGly151015LysSerSerSerGluGlnSer20權(quán)利要求1.一種分離的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，包括至少一個互補決定區(qū)，所述互補決定區(qū)具有選自下列SEQIDNO1-6中的氨基酸序列SYYIH(SEQIDNO1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQIDNO2)，其中X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQIDNO3)，KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQIDNO4)，WASTRES(SEQIDNO5)，HQYLSSRT(SEQIDNO6)并具有與CD33結(jié)合的能力。2.一種抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，包括至少一個重鏈可變區(qū)和至少一個輕鏈可變區(qū)，其中所述的重鏈可變區(qū)包括三個互補決定區(qū)，所述互補決定區(qū)分別具有SEQIDNO1-3所示的氨基酸序列，SYYIH(SEQIDNO1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQIDNO2)，其中所述的X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQIDNO3)，并且其中所述的輕鏈可變區(qū)包括三個互補決定區(qū)，所述互補決定區(qū)分別具有SEQIDNO4-6所示的氨基酸序列，KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQIDNO4)，WASTRES(SEQIDNO5)，HQYLSSRT(SEQIDNO6)。3.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的重鏈可變區(qū)與SEQIDNO7所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS具有至少90％的序列同一性。4.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的重鏈可變區(qū)與SEQIDNO7所示的所述氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS具有至少95％的序列同一性。5.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO7所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS。6.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的輕鏈可變區(qū)與SEQIDNO8所示的氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR具有至少90％的序列同一性。7.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的輕鏈可變區(qū)與SEQIDNO8所示的所述氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR具有至少95％的序列同一性。8.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO8所示的氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR。9.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的重鏈可變區(qū)與SEQIDNO9所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS具有至少90％的序列同一性。10.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的重鏈可變區(qū)與SEQIDNO9所示的所述氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS具有至少95％的序列同一性。11.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO9所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS。12.權(quán)利要求2的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的輕鏈可變區(qū)與SEQIDNO10所示的氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR具有至少90％的序列同一性。13.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的輕鏈可變區(qū)與SEQIDNO10所示的所述氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR具有至少95％的序列同一性。14.權(quán)利要求2的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO10所示的氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR。15.一種與CD33特異性結(jié)合的純化的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)部分具有SEQIDNO7所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS，且其中所述抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的輕鏈可變區(qū)部分具有SEQIDNO8所示的氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR。16.一種與CD33特異性結(jié)合的人源化或表面重整抗體，或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)部分具有SEQIDNO9所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS，且其中所述抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO10所示的氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR。17.一種免疫偶聯(lián)物，包括與藥物或前體藥物連接的權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段。18.一種免疫偶聯(lián)物，包括與藥物或前體藥物連接的權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段。19.權(quán)利要求17的免疫偶聯(lián)物，其中所述的藥物或前體藥物選自美登木素生物堿、紫杉醇、CC-1065、CC-1065類似物、海兔毒肽、海兔毒肽類似物、氨甲喋呤，道諾紅菌素、阿霉素，長春花新堿、長春花堿、苯丙氨酸氮芥、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、加利車霉素及它們的衍生物。20.權(quán)利要求18的免疫偶聯(lián)物，其中所述的藥物或前體藥物選自美登木素生物堿、紫杉醇、CC-1065、CC-1065類似物、海兔毒肽、海兔毒肽類似物、氨甲喋呤、道諾紅菌素、阿霉素，長春花新堿、長春花堿、苯丙氨酸氮芥、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、加利車霉素及它們的衍生物。21.一種組合物，包括權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段和藥物或前體藥物。22.一種組合物，包括權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段和藥物或前體藥物。23.一種藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，以及藥學(xué)上可接受試劑。24.一種藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，以及藥學(xué)上可接受試劑。25.一種藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求17所述的免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受試劑。26.一種藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求18所述的免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受試劑。27.一種藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求21所述的組合物，以及藥學(xué)上可接受試劑。28.一種藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求22所述的組合物，以及藥學(xué)上可接受試劑。29.一種診斷試劑，包括權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述的抗體或抗體片段是被標記的。30.一種診斷試劑，包括權(quán)利要求2所述的抗體，其中所述的抗體或抗體片段是被標記的。31.權(quán)利要求29的診斷試劑，其中所述的標記選自生物素標記，酶標記，放射性標記，熒光基團，發(fā)色團，顯影劑和金屬離子。32.權(quán)利要求30的診斷試劑，其中所述的標記選自生物素標記，酶標記，放射性標記，熒光基團，發(fā)色團，顯影劑和金屬離子。33.一種抑制表達CD33的細胞之生長的方法，包括將所述的細胞與權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段接觸。34.一種抑制表達CD33的細胞之生長的方法，包括將所述的細胞與權(quán)利要求17或18所述的免疫偶聯(lián)物接觸。35.一種抑制表達CD33的細胞之生長的方法，包括將所述的細胞與權(quán)利要求21或22所述的組合物接觸。36.一種抑制表達CD33的細胞之生長的方法，包括將所述的細胞與選自權(quán)利要求23至28所述的藥學(xué)組合物接觸。37.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括給予所述受試對象有效量的權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段。38.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括給予所述受試對象有效量的權(quán)利要求17或18所述的免疫偶聯(lián)物。39.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括給予所述受試對象有效量的權(quán)利要求21或22所述的組合物。40.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括給予所述受試對象有效量的權(quán)利要求23或24所述的藥學(xué)組合物。41.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括給予所述受試對象有效量的權(quán)利要求25或26所述的藥學(xué)組合物。42.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括給予所述受試對象有效量的權(quán)利要求27或28所述的藥學(xué)組合物。43.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括將所述受試對象的一個或多個細胞離體接觸有效量的權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段。44.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括將所述受試對象的一個或多個細胞離體接觸有效量的權(quán)利要求17或18所述的免疫偶聯(lián)物。45.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括將所述受試對象的一個或多個細胞離體接觸有效量的權(quán)利要求21或22所述的組合物。46.一種治療患有其中表達CD33的疾病的受試對象的方法，包括將所述受試對象的一個或多個細胞離體接觸有效量的選自權(quán)利要求23至28所述的藥學(xué)組合物。47.權(quán)利要求37中的治療方法，其中所述疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。48.權(quán)利要求38中的治療方法，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。49.權(quán)利要求39中的治療方法，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。50.權(quán)利要求40中的治療方法，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。51.權(quán)利要求41中的治療方法，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。52.權(quán)利要求42中的治療方法，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。53.權(quán)利要求43中的治療方法，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。54.權(quán)利要求44中的治療方法，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。55.權(quán)利要求45中的治療方法，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。56.權(quán)利要求46中的治療方法，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。57.一種測定生物樣品中是否含有骨髓性癌細胞的方法，包括(a)將所述的生物樣品與權(quán)利要求29或30所述的診斷試劑接觸，和(b)檢測所述試劑在所述樣品內(nèi)的分布。58.權(quán)利要求57的診斷方法，其中所述癌癥選自急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細胞性白血病(PML)。59.一種特異性結(jié)合CD33的改良抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，所述的改良抗體或抗體片段如下制備(a)提供DNA，編碼抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其包括SEQIDNO7和SEQIDNO8中的至少一個；(b)將至少一個核苷酸突變、刪除、插入或添加引入到所述DNA中，以致由所述DNA編碼的所述抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的氨基酸序列被改變；(c)表達所述抗體或抗原決定簇結(jié)合片段；(d)篩選所述被表達抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的所述改良，從而制備改良抗體或抗原決定簇結(jié)合片段。60.一種特異性結(jié)合CD33的改良抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，所述的改良抗體或抗體片段如下制備(a)提供DNA，編碼抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其包括SEQIDNO9和SEQIDNO10中的至少一個，(b)將至少一個核苷酸突變、刪除、插入或添加引入到所述的DNA中，以致由所述DNA編碼的所述抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的氨基酸序列被改變；(c)表達所述抗體或抗原決定簇結(jié)合片段；(d)篩選所述被表達抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的所述改良，從而制備改良抗體或抗原決定簇結(jié)合片段。61.權(quán)利要求59或60的改良抗體或抗體片段，其中所述的改良是對CD33的親和性增加。62.權(quán)利要求59或60的改良抗體或抗體片段，其中所述的至少一個核苷酸突變、刪除、插入或添加可通過選自下列的方法來完成寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變、盒式誘變、易錯PCR、DNA改組和應(yīng)用大腸桿菌增變株。63.一種分離的多核苷酸，編碼權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段。64.一種分離的多核苷酸，編碼權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的輕鏈或重鏈。65.一種重組載體，含有權(quán)利要求63所述的多核苷酸。66.一種重組載體，含有權(quán)利要求64所述的多核苷酸。67.一種宿主細胞，用權(quán)利要求65所述的重組載體轉(zhuǎn)化。68.一種宿主細胞，用權(quán)利要求66所述的重組載體轉(zhuǎn)化。69.一種用于產(chǎn)生具有結(jié)合CD33能力的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)一種權(quán)利要求67所要求保護的宿主細胞，在所述宿主細胞表達抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的條件下，和(b)收集如此表達的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段。70.一種用于產(chǎn)生具有結(jié)合CD33能力的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的方法，所述的方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求68的宿主細胞，在所述宿主細胞可表達抗體或抗原決定簇結(jié)合片段的條件下，和(b)收集如此表達的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段。71.一種用于從生物材料中獲得CD33的方法，所述方法包括(a)將生物材料與權(quán)利要求1或2所述的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段接觸，(b)允許權(quán)利要求1或2所述的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段與所述生物材料中的CD33結(jié)合，和(c)從該生物材料中分離與CD33結(jié)合的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段，從而從生物材料中獲得CD33。全文摘要本發(fā)明涉及結(jié)合CD33的抗體。更特別地是，本發(fā)明涉及抗CD33抗體，所述抗體的片段和同源物，所述抗體的人源化和表面重整形式，所述抗體的功能等價物和改良形式，含有所述抗體的免疫偶聯(lián)物和組合物，及其在診斷、研究和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及編碼該抗體的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體，用多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及制備該抗體的方法。文檔編號C07K16/46GK1795009SQ200380102406公開日2006年6月28日申請日期2003年11月5日優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日發(fā)明者M·G·霍費,D·塔瓦雷斯,R·J·盧茨申請人:伊謬諾金公司