專利名稱：一種檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，特別是涉及一種檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶同型或亞型的免疫測(cè)定方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, ΜΡ0)是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒產(chǎn)生的一種重要的過(guò)氧化物酶，主要存在于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中。成熟的MPO由兩個(gè)亞單位聚合而成，每個(gè)亞單位由一個(gè)59-64kDa的重鏈和一個(gè)14kDa的輕鏈構(gòu)成，每個(gè)亞單位中含有一個(gè)共價(jià)結(jié)合的血紅素，具有MPO特有的綠色光譜特性。MPO能催化過(guò)氧化氫與氯的反應(yīng)產(chǎn)生次氯酸，具有很強(qiáng)的抗微生物作用，在機(jī)體產(chǎn)生和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮作用。然而，MPO催化反應(yīng)生成過(guò)量的氧化劑時(shí)，會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷。 髓過(guò)氧化物酶的活性與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，神經(jīng)炎癥疾病方面包括多發(fā)性硬化癥，阿爾茨海默氏癥，帕金森氏癥和中風(fēng)等。其他炎性疾病如慢性阻塞性肺病，囊腫性纖維化，動(dòng)脈粥樣硬化，炎癥性腸病，疾病，腎小球損傷和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。肺癌也顯示和MPO水平升高有關(guān)。此外，根據(jù)之前的研究顯示，MPO水平和心血管疾病密切相關(guān)。然而，這些以往的研究都沒(méi)有涉及MPO同型和/或亞型與特定的疾病狀態(tài)存在具體相關(guān)。目前，用于檢測(cè)MPO的方法有酶聯(lián)免疫吸附法、光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法、流式細(xì)胞儀測(cè)定法、毛細(xì)管電泳法等。然而這些方法均未涉及到對(duì)MPO同型或亞型的檢測(cè)。因此，急需一種專門檢測(cè)MPO同型或亞型的檢測(cè)方法，用于鑒定過(guò)敏癥、炎癥、心血管疾病或自身免疫性疾病的狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種高特異性的檢測(cè)分析方法，特別是一種高特異性和高靈敏度的檢測(cè)MPO同型或亞型或其組合物中的至少一種的方法，包括(a)所述MPO同型、亞型或其組合物中的至少一種能夠和所述MPO同型、亞型或其組合物的特異性結(jié)合的包被抗體結(jié)合。(b)所述MPO同型、亞型或其組合物中的至少一種與一個(gè)標(biāo)記抗體中結(jié)合；從而輔助診斷或預(yù)后過(guò)敏性疾病、炎癥性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的狀態(tài)；本發(fā)明進(jìn)一步提供用于實(shí)施所述方法的試劑盒。下面提供一種新的診斷或預(yù)后分析MPO同型或亞型的方法。本發(fā)明公開(kāi)了一種評(píng)估患者是否有過(guò)敏性疾病、炎癥性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的診斷實(shí)驗(yàn)。另一方面，公開(kāi)了一種評(píng)估患者發(fā)展為過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)后檢測(cè)方法。可以確定的是，所述方法包括不同的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣本中的MPO同型或亞型的方法。盡管一些方法、設(shè)備和材料和本發(fā)明所述相似或相同，能夠用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明權(quán)利要求所述的方法，但是，本發(fā)明所述的是特殊的方法、設(shè)備和材料。本發(fā)明提供了一種輔助診斷或預(yù)后過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病狀態(tài)的方法，通過(guò)檢測(cè)樣本中至少一種，而不是全部MPO同型或亞型或其組合，所述方法包括(a)所述MPO同型或亞型或其組合中的至少一種，而不是全部，與所述特異性結(jié)合包被抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。(b)所述MPO同型或亞型或其組合中的至少一種，而不是全部，與所述標(biāo)記抗體結(jié)
口 ο
所述MPO同型或亞型或其組合能夠被所述的具有MPO同型或亞型或其組合中的至少一種特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體檢測(cè)，或和標(biāo)記過(guò)的MPO同型或亞型或其組合中的至少一種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。進(jìn)一步的，標(biāo)記抗體與所述MPO同型中的特異性結(jié)合，但是不能和MPO亞型結(jié)
入
口 ο進(jìn)一步而言，對(duì)MPO同型或亞型或其組合中的至少一種的檢測(cè)是和過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫疾病相關(guān)的。所述炎癥疾病主要指腸炎癥疾?。凰鲎陨砻庖咝约膊∈羌毙圆ド⑿阅X脊髓炎，阿狄森氏病，強(qiáng)直性脊柱炎，抗磷脂抗體綜合征，再生障礙性貧血，自身免疫性肝炎，腹腔疾病，克羅恩病的糖尿病，橋本氏病，特發(fā)性血小板減少性紫癜，紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化癥，重癥肌無(wú)力，視神經(jīng)炎，天皰瘡，原發(fā)性膽汁性肝硬化，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，干燥綜合征，自身免疫性溶血性貧血或韋格納肉芽腫中的一種。本發(fā)明所述包被抗體為單克隆抗體、單一特異性多克隆抗體或抗體結(jié)合片段。進(jìn)一步而言，包被抗體是偶聯(lián)到具有蛋白偶聯(lián)表面的固相支持物上的，這種具有蛋白偶聯(lián)表面的固相支撐物可以是一種微孔板，一種膠體金粒子，一種氧化鐵離子或聚珠。所述標(biāo)記抗體為單克隆抗體、單一特異性多克隆抗體、抗體結(jié)合片段中的一種，進(jìn)一步而言，標(biāo)記抗體包括一種可檢測(cè)標(biāo)記?？蓹z測(cè)標(biāo)記為化學(xué)發(fā)光劑、比色劑、酶、酶反應(yīng)的底物、熒光劑或放射性同位素。所述酶可以是堿性磷酸酶，淀粉酶，熒光素酶，過(guò)氧化氫酶，β -半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，己糖激酶，辣根過(guò)氧化物酶，內(nèi)酰胺酶，脲酶，蘋果酸脫氫酶中的一種。所述診斷和預(yù)后的方法是免疫分析法，進(jìn)一步而言，所述免疫分析是指固相免疫分析。所述測(cè)試樣品可以是全血、血漿、血清、細(xì)胞提取物或組織提取物中的一種。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種輔助診斷或預(yù)后過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的試劑盒，試劑盒測(cè)量樣本中MPO同型或亞型或其組合物中的至少一種。所述試劑盒包括能夠和MPO同型或亞型或其組合物中的至少一種特異性結(jié)合的包被抗體和標(biāo)記抗體。所述標(biāo)記抗體是一種能夠和MPO同型或亞型或其組合物中的至少一種結(jié)合，并能直接或間接與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合，從而檢測(cè)所述MPO同型或亞型或其組合物中的至少一種。本發(fā)明所述試劑盒輔助診斷或預(yù)后的疾病狀況為過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病。其中炎癥性疾病主要是指腸炎癥疾病。自身免疫性疾病為急性播散性腦脊髓炎，阿狄森氏病強(qiáng)直性脊柱炎，抗磷脂抗體綜合征，再生障礙性貧血，自身免疫性肝炎，腹腔疾病，克羅恩病，糖尿病，肺出血腎炎綜合征，橋本氏病，，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化癥，重癥肌無(wú)力，視神經(jīng)炎，天皰瘡，原發(fā)性膽汁性肝硬化，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，，干燥綜合征，自身免疫性溶血性貧血或韋格納肉芽腫。本發(fā)明所述試劑盒也包含一種定量檢測(cè)樣本中至少一種MPO同型或亞型或其組合物的校準(zhǔn)品。所述校準(zhǔn)品可以是一種或更多預(yù)制的校準(zhǔn)品，也可以是一種能夠在溶液中重組形成一種或更多校準(zhǔn)品的物質(zhì)。本發(fā)明所述試劑盒包含一種包被抗體，所述包被抗體為單克隆抗體、單一特異性多克隆抗體或抗體結(jié)合片段。進(jìn)一步而言，包被抗體偶聯(lián)到具有蛋白偶聯(lián)表面的固相支持物上，這種固相支持物包括但不限于一種微孔板、一種膠體金粒子、一種氧化鐵離子或一種聚珠。所述標(biāo)記抗體為單克隆抗體、單一特異性多克隆抗體或抗體結(jié)合片段。所述標(biāo)記抗體可以結(jié)合MPO同型或亞型中至少一個(gè)。進(jìn)一步而言，標(biāo)記抗體還包括可檢測(cè)的示蹤物。 可檢測(cè)示蹤物為化學(xué)發(fā)光劑、比色劑、能量轉(zhuǎn)移劑、酶、酶反應(yīng)的底物、熒光劑或放射性同位素。其中酶可能是堿性磷酸酶、淀粉酶、熒光素酶、過(guò)氧化氫酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、己糖激酶、辣根過(guò)氧化物酶、內(nèi)酰胺酶、脲酶或蘋果酸脫氫酶。髓過(guò)氧化物酶本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本MPO同型或亞型水平的方法，用MPO水平作為診斷因子來(lái)診斷或預(yù)后過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病狀態(tài)。特別的，成熟和無(wú)活性的MPO不能被檢測(cè)。在這些方法中，檢測(cè)出MPO同型或亞型水平與正常人的樣本相比改變或升高，可作為診斷或預(yù)后疾病病情的分析因素。本發(fā)明中所用術(shù)語(yǔ)“水平升高”或“較高水平”是指MPO同型或亞型的水平，水平高于正常或者質(zhì)控的對(duì)照樣本。本發(fā)明所述“質(zhì)控水平”(或者正常水平)是指沒(méi)有患疾病狀態(tài)的患者的樣本中檢測(cè)出的MPO同型或亞型水平的范圍?！八缴摺笔侵窶PO同型或亞型水平在質(zhì)控水平范圍之上。所述包被抗體是指能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下與MPO同型或亞型結(jié)合的任何分子或分子復(fù)合體。一般來(lái)說(shuō)，結(jié)合具有足夠的特異性排除與其他配體發(fā)生的結(jié)合。本發(fā)明中的“標(biāo)記抗體”是一種抗體或配體結(jié)合的片段或類似物。“標(biāo)記抗體”也可能是能夠與MPO同型或亞型結(jié)合其他蛋白質(zhì)、核酸或類似物。包被抗體優(yōu)先或特異性的結(jié)合特點(diǎn)，體現(xiàn)于在相同或相似的結(jié)合條件下只和一個(gè)MPO異構(gòu)體結(jié)合，不與第二個(gè)(不同的)MPO同型或亞型結(jié)合。具體而言，標(biāo)記抗體可能有一個(gè)MPO亞型高親和力，或一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)MPO亞型的高親和力，但對(duì)其他抗原的親和力顯著降低，包括其他MPO同型或亞型。例如，一種抗體可能結(jié)合到一個(gè)MPO的亞型或兩個(gè)、三個(gè)MPO的亞型，比其他非目標(biāo)MPO形式高至少5倍、10倍、20倍、或100倍親和力。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，MPO同型或亞型或組合的中至少有一個(gè)的水平變化與過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病的狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。MPO同型或亞型或組合水平的改變，和測(cè)試樣品的病情存在關(guān)聯(lián)，可作為所述病情未來(lái)的發(fā)展的預(yù)后指標(biāo)。自身免疫性疾病包括但不限于急性播散性腦脊髓炎、阿狄森氏病、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂抗體綜合征、再生障礙性貧血、自身免疫性肝炎、腹腔疾病、克羅恩病、糖尿病、肺出血腎炎綜合征、橋本龍?zhí)傻牟?、特發(fā)性血小板減少性紫癜、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無(wú)力、視神經(jīng)炎、天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合征、干燥綜合征、自身免疫性溶血性貧血或韋格納肉芽腫。檢測(cè)樣本的制備“測(cè)試樣品”、“病人樣本”或“體內(nèi)樣本”在本發(fā)明中可以互換使用。診斷方法中的測(cè)試樣品為全血、血漿、尿液、血清、人體組織提取物或細(xì)胞提取物。全血可以使用標(biāo)準(zhǔn)的臨床程序從個(gè)人或測(cè)試患者獲得。血漿可從全血樣本離心抗凝后獲得。離心后底層為濃縮紅細(xì)胞，中間的白細(xì)胞層和上層血清。血清可以通過(guò)離心未加抗凝劑的全血獲得。全血允許離心前有一定的血凝塊。黃色或淡黃色液體就是離心獲得的血清。白細(xì)胞可以通過(guò)多種方法從全血樣本中分離獲得，包括浮力密度離心法。
試驗(yàn)樣品，也可能是臨床細(xì)胞學(xué)標(biāo)本(如細(xì)針乳腺活檢或細(xì)胞學(xué)肺部組織標(biāo)本)或組織樣本如，胃癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，心臟組織樣本。組織樣本可以是新鮮的也可以是冷凍的。試驗(yàn)樣品可以從從人或商品性的哺乳動(dòng)物獲得，哺乳動(dòng)物包括但不限于牛或馬。測(cè)試樣本也可以是寵物，包括但不限于貓或狗。本發(fā)明的抗體MPO同型或亞型可以用來(lái)培養(yǎng)多克隆抗體和單克隆抗體。本發(fā)明所述的抗體，優(yōu)先與MPO同型或亞型結(jié)合，不和成熟的MPO結(jié)合。此外，在下面將詳細(xì)討論，抗體可能是泛特異性抗體?！胺禾禺愋钥贵w”是指一種抗體，選擇性結(jié)合相關(guān)的多肽組中至少兩個(gè)成員(如MPO同型或亞型)，不選擇結(jié)合組外相關(guān)多肽。此處所用的“抗體”，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分。這種抗體包括，但不僅限于多克隆抗體，單克隆，單特異性多克隆抗體，假抗體，嵌合體，單鏈，F(xiàn)ab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv和Fab表達(dá)庫(kù)。在一般情況下，抗體分子是從人類相關(guān)的任何免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE和IgD獲得的，這些分子由于分子中的重鏈的本性不同而各不相同。某些種類的分子又可分為相應(yīng)的亞類，如IgGl，IgG2等。此外，在人類中，輕鏈可以是K鏈或一個(gè)λ鏈。此處所述抗體包括所有這些類，子類和類型的抗體的所有類型。更好的，一個(gè)抗體分子最好具有較弱的或不能結(jié)合無(wú)MPO同型或亞型表達(dá)的細(xì)胞。在某種情況下，抗體還顯示不能和成熟的MPO結(jié)合?？贵w分子和目標(biāo)抗原的反應(yīng)活性可以通過(guò)本發(fā)明所述的方法以任何合適的方式來(lái)確定。給單個(gè)的標(biāo)記抗體進(jìn)行標(biāo)記是一種可行的方案。探測(cè)分子可能直接或間接產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，最好是可定量的信號(hào)。標(biāo)記抗體的結(jié)合可以是共價(jià)鍵、肽鍵或非共價(jià)鍵等。通過(guò)肽鍵的結(jié)合可能是抗體和標(biāo)記抗體基因融合編碼的重組表達(dá)。確定抗體分子結(jié)合實(shí)際模式不是本發(fā)明的特點(diǎn)，技術(shù)人員可根據(jù)他們的喜好和通用知識(shí)來(lái)選擇合理的方式。已經(jīng)證明抗體片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。此處所用“抗原結(jié)合片段”，包括但不限于(i)Fab片段，包括VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域；(ii)FD片段包括VH和CHl結(jié)構(gòu)域；(iii)Fv片段包括單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域；(iv) dAb片段包括VH的結(jié)構(gòu)域；(V)獨(dú)立的CDR區(qū)域；(vi)F(ab’ )2片段；(vii)單鏈Fv分子(scFV)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域由一個(gè)肽鍵鏈接，它允許兩個(gè)域形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；(viii)雙特異性單鏈抗體二聚體和( χ)通過(guò)基因融合構(gòu)建的雙體、多價(jià)體和多特異性片段。MPO同型或亞型或其片段可作為一種抗原，另外可以用來(lái)制備與抗原表位進(jìn)行免疫特異性結(jié)合的抗體，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備多克隆和單克隆抗體。抗原肽包括至少10個(gè)氨基酸殘基，或15個(gè)氨基酸殘基，或20個(gè)氨基酸殘基，或30個(gè)氨基酸殘基?！翱乖砦弧被虮尽翱乖瓫Q定簇”在本發(fā)明中可以互換使用，指抗體中能夠被特定的抗體識(shí)別并特異性結(jié)合的部分。當(dāng)抗原是一種多肽，抗原表位可由一種蛋白質(zhì)的連續(xù)的氨基酸和不連續(xù)的氨基酸折疊構(gòu)建形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)。由連續(xù)的氨基酸形成的表位通常在蛋白質(zhì)變性后能保留下來(lái)，而由折疊形成的表位通常在蛋白質(zhì)變性后失去活性?？乖砦煌ǔＪ且粋€(gè)包括至少3個(gè)，通常是5個(gè)或8-10氨基酸的一個(gè) 獨(dú)特的空間構(gòu)象?？贵w“選擇性結(jié)合”或“特異性結(jié)合”的意思是抗體應(yīng)答反應(yīng)或結(jié)合更加頻繁，更加迅速，持續(xù)周期更長(zhǎng)，親和性更強(qiáng)。“選擇性結(jié)合”或“特異性結(jié)合”的意思是，例如，抗體結(jié)合的蛋白分子量至少大約O. ImM，但更通常至少約luM?！斑x擇性結(jié)合”或“特異性結(jié)合”的意思是抗體結(jié)合蛋白有時(shí)分子量至少大約O. IuM,或者更好至少大約O. OluM。這里所用的術(shù)語(yǔ)“非特異性結(jié)合”和“背景結(jié)合”，當(dāng)用在抗體和蛋白或肽鍵的相互作用不依賴于特殊結(jié)構(gòu)(即，抗體是和一般的蛋白結(jié)合，不是特定抗原結(jié)構(gòu)如抗原表位)。MPO同型或亞型的特異性抗體可以通過(guò)文獻(xiàn)中報(bào)道的一些方法獲得，包括盤選分離法和親和層析的方法。對(duì)于多克隆抗體的制備，可用MPO同型或亞型、合成的變異體、衍生物或者片段注射免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如兔，羊，老鼠或其他哺乳動(dòng)物)來(lái)獲得。合適的免疫原包括，自然生成的MPO同型或亞型免疫原，具有的MPO同型或亞型免疫原性的化學(xué)合成多肽，或具有的MPO同型或亞型免疫原性的重組表達(dá)多肽的或其碎片。此外，該蛋白可能結(jié)合對(duì)被免疫的哺乳動(dòng)物中的具有免疫原性的另一種蛋白質(zhì)。這種免疫蛋白包括但不限于鎖孔戚血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。制備程序還包括一種佐劑。用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑包括但不僅限于，礦物凝膠(例如，氫氧化鋁)，單磷酸類月旨，合成海藻糖)。MPO同型或亞型多克隆抗體可以根據(jù)已知的方法來(lái)制備。多克隆抗體可以通過(guò)免疫動(dòng)物(如兔子，大鼠，小鼠，驢等)來(lái)制備，通過(guò)多個(gè)皮下或腹腔注射相關(guān)的MPO同型或亞型(純化的多肽片段，全長(zhǎng)重組蛋白，融合蛋白等)，隨機(jī)性地結(jié)合到鎖孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)，血清白蛋白等，在無(wú)菌生理鹽水中稀釋，并結(jié)合佐劑(如完全或不完全弗氏佐劑)，以形成穩(wěn)定的乳液。多克隆抗從免疫動(dòng)物的全血、腹水或相關(guān)體液中提取獲得。采集的血液經(jīng)過(guò)凝固，血清傾析，離心澄清，抗體檢測(cè)。多克隆抗體可以從血清或腹水中純化，文獻(xiàn)中報(bào)道的已知的標(biāo)準(zhǔn)方法包括親和層析、離子交換層析、凝膠電泳、透析等。最終的哺乳動(dòng)物血清中制備出來(lái)的多克隆抗體中為最終的抗體制備做準(zhǔn)備，單個(gè)的淋巴細(xì)胞可以從脾、淋巴結(jié)或外周血中獲得，用于提供單系的單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞取自于脾臟。本發(fā)明中所使用的“單克隆抗體”(mAbs)，是指一個(gè)只包含一種抗體分子的抗體分子群，所述抗體由一個(gè)唯一的輕鏈基因的產(chǎn)物和唯一的重鏈基因產(chǎn)物的組成。群體中所有單克隆抗體分子的決定區(qū)域都是相同的，單克隆抗體包含一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，能通過(guò)唯一的結(jié)合親和力與特定抗原表位發(fā)生免疫反應(yīng)。取自于被免疫的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞和能無(wú)限增殖的腫瘤細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系)融合形成雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖并能產(chǎn)生淋巴B細(xì)胞的遺傳編碼抗體。雜交瘤細(xì)胞通過(guò)篩選、稀釋、培養(yǎng)被分離成單一細(xì)胞株，每個(gè)細(xì)胞株含有單個(gè)抗體的基因。雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基包含一種或多種物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠抑制未融合的骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活胞。本發(fā)明中涉及的試劑、細(xì)胞系和雜交瘤形成、篩選和生長(zhǎng)的培養(yǎng)基都可以通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買到，標(biāo)準(zhǔn)制備過(guò)程也已確立。一般來(lái)說(shuō)，雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，被用來(lái)分析單克隆抗體的制備。具體而言，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的具有特異性結(jié)合能力的單克隆抗體通過(guò)免疫沉淀或體外試驗(yàn)，如放射免疫法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來(lái)鑒定。在確定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體具有所需的特異性、親和性和/或活性后，雜交瘤細(xì)胞株有限稀釋成亞克隆繼續(xù)培養(yǎng)，亞克隆雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體可以從培養(yǎng)基上分離出，或者腹水或血清中純化提取， 提取方法可以是基磷灰石層析法、凝膠電泳法、透析法或親和色譜法。所述“修飾抗體”指任何與MPO同型或亞型或組合發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合片段或重組子，其恒定區(qū)的片段至少有一部分被刪除或者修飾過(guò)，以滿足所需要的生物特性，同時(shí)具有完全抗體的結(jié)合特異性。具體而言，本發(fā)明所述的修飾抗體恒定區(qū)的片段至少有一個(gè)被刪除。現(xiàn)已有多種技術(shù)來(lái)制備抗體片段。傳統(tǒng)上，片段是由完整的抗體水解衍生而來(lái)。然而，現(xiàn)在可以直接通過(guò)重組宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可以在大腸桿菌中表達(dá)和分泌，從而靈活地生產(chǎn)出大量的片段。另外，F(xiàn)ab’-SH片段可以直接從大腸桿菌中回收，化學(xué)偶聯(lián)形式形成F(ab’)2片段。F(ab’)2片段的另一種方法，可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。生產(chǎn)抗體片段的其他技術(shù)對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的從業(yè)者來(lái)說(shuō)是輕而易舉的。一個(gè)選擇的抗體，可以是單鏈Fv片段(scFv)。Fv和sFv是唯一的具有完整結(jié)合位點(diǎn)的缺乏恒定區(qū)的片段種類，有完整的結(jié)合位點(diǎn)的片段，因此，適用于在體內(nèi)使用過(guò)程中減少非特異性結(jié)合。sFv融合蛋白可以構(gòu)建來(lái)產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白sFv?？贵w片段，也可能是一個(gè)“線性抗體”，這種線性的抗體片段，可能是單特異性或雙功能。應(yīng)該理解，本發(fā)明的組份和方法對(duì)診斷多種過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的狀態(tài)是十分有用的。如上所述，本發(fā)明所述修飾抗體能夠和MPO同型或亞型發(fā)生免疫反應(yīng)。更為普遍地，本發(fā)明具體實(shí)施例中，可用的修飾抗體可以從能夠和MPO亞型或別的形式發(fā)生反應(yīng)的任何抗體中獲得或衍生。此外，抗體的母體或前體，或片段，被用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明所述的修飾抗體的可以是小鼠、人、嵌合體、或靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在其他具體情況下，本發(fā)明所述的修飾抗體也可以是具有改變的恒定區(qū)的單鏈抗體結(jié)構(gòu)。因此，任何與此處所述一致的抗體修飾方法均適合本發(fā)明。在其他適合的具體情況中，使用傳統(tǒng)的程序，DNA編碼的單克隆抗體被迅速分離和測(cè)序(例如，通過(guò)使用具有特異性結(jié)合能力的寡核苷酸探針來(lái)基因編碼小鼠抗體的重鏈和輕鏈)。這種分離和亞克隆的雜交瘤細(xì)胞作為這種DNA的來(lái)源。一旦被分離，DNA就會(huì)被轉(zhuǎn)入表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)移入原核的或真核的宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，否則不產(chǎn)生免疫球蛋白。更特別的是，被分離出的DNA(可按照本發(fā)明所主方法進(jìn)行修飾)可能被用來(lái)克隆抗體的恒定和可變區(qū)序列來(lái)制備抗體，這些均納入本發(fā)明的內(nèi)容，作為本發(fā)明的參考。從本質(zhì)上講，這需要從選定的細(xì)胞中提取RNA，轉(zhuǎn)換成cDNA，使用免疫球蛋白特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正如將在下面更詳細(xì)地討論，表達(dá)所需的抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞會(huì)大量生產(chǎn)為臨床和商業(yè)提供所需的免疫球蛋白。多核苷酸編碼一種單克隆抗體可以用重組DNA技術(shù)來(lái)修飾抗體。具體而言，輕鏈和重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域，例如，鼠單克隆抗體可被取代為，I)人類抗體的恒定區(qū)而生成嵌合抗體；或2)非免疫球蛋白多肽而生成一個(gè)融合抗體。具體而言，不變的區(qū)域被截?cái)嗷騽h除，以產(chǎn)生所需的單克隆抗體的抗體片段。可變區(qū)的直接點(diǎn)突變或高密度的基因突變，可用于優(yōu)化單克隆抗體的特異性和親和力等。也可以這樣理解，DNA編碼抗體或抗體片段，也可以從抗體噬菌體庫(kù)衍生。有很多出版物已經(jīng)描述通過(guò)鏈替換制備具有高親和力的人抗體產(chǎn)物，以及組合感染和體內(nèi)重組來(lái)構(gòu)建大容量噬菌體庫(kù)。這些給傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)提供了可選的分離和克隆單克隆抗體的方法，在本發(fā)明所涉及的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的其他體現(xiàn)包括在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)中產(chǎn)生大量人類抗體，這些抗體無(wú)內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)物。例如，抗體重鏈中純合子的缺失和生殖系突變的小鼠完全抑制內(nèi)源性抗體生產(chǎn)。人類免疫球蛋白基因組如果轉(zhuǎn)移到這種生殖系突變小鼠，將面臨無(wú)法生產(chǎn)人類抗體的挑戰(zhàn)。本發(fā)明參考了另一種使用重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠產(chǎn)生人抗體 的方式，人類抗體的遺傳物質(zhì)也可以被分離和制備。它也可以進(jìn)一步理解為，本發(fā)明的范圍包括本發(fā)明所述的DNA序列的所有等位基因、變異體和突變體。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，存在制備針對(duì)本發(fā)明中涉及的多肽的單鏈抗體的方法。此外，存在構(gòu)建Fab表達(dá)庫(kù)，這種Fab片段的單克隆抗體能快速、有效識(shí)別并特異性結(jié)合MPO同型或亞型、或衍生物、片段、類似物或同源基因等。本發(fā)明的目的在于，修飾抗體包括任何類型的MPO同型或亞型相關(guān)抗體的可變區(qū)域?？勺儏^(qū)可以從任何類型哺乳動(dòng)物衍生出來(lái)的，這些哺乳動(dòng)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答并生成抗MPO同型或亞型的免疫球蛋白、。因此，修飾后的抗體可變區(qū)可以是人類、小鼠或非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如獼猴，獼猴等)。在一些具體實(shí)施例中，，修飾后的免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū)均源于人類。在其他實(shí)施例中，免疫球蛋白(通常取自動(dòng)物)的可變區(qū)通過(guò)基因工程改善成具有更好的結(jié)合屬性或降低了免疫原性的分子。在這方面，本發(fā)明的具體實(shí)施例中的可用的可變區(qū)可能是人源化的，或氨基酸序列發(fā)生過(guò)修飾的。人類抗體也是可以產(chǎn)生的。例如，現(xiàn)在可以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白的產(chǎn)生的情況下通過(guò)免疫能生產(chǎn)完整人類抗體組分。例如，抗體重鏈連接區(qū)基因的純合子缺失，和完全喪失內(nèi)源性抗體生產(chǎn)的生殖系突變小鼠。人類免疫球蛋白基因芯片的轉(zhuǎn)移進(jìn)入種系突變小鼠，將生成相應(yīng)抗原的人類抗體。本發(fā)明還包括雙特異性抗體，專門識(shí)別MPO同型或亞型。雙特異性抗體是指能夠特異性識(shí)別和結(jié)合至少兩個(gè)不同的表位的抗體。不同的表位能夠存在于同一個(gè)分子(例如相同的MPO同型或亞型)上，或者、不同的分子上，例如，抗體可以特異地識(shí)別和結(jié)合多個(gè)MPO同型或亞型。雙特異性抗體可以是完整的抗體或抗體片段。多效價(jià)抗體如三特異性抗體也可考慮。另外，噬菌體展示技術(shù)可通過(guò)未接受免疫接種的供體內(nèi)免疫球蛋白可變(V)區(qū)域結(jié)構(gòu)與基因所有組成成分，來(lái)體外生產(chǎn)人類抗體和抗體片段，。根據(jù)這項(xiàng)技術(shù)，抗體的V結(jié)構(gòu)域基因克隆到一個(gè)的絲狀噬菌體外殼蛋白基因，在噬菌體顆粒表面上表現(xiàn)出抗體片段的作用。由于絲狀噬菌體中含有單鏈DNA的噬菌體基因組，基于抗體的功能特性的選擇，也同時(shí)選擇抗體基因編碼。因此，噬菌體類似于B細(xì)胞的某些特性。噬菌體展示技術(shù)，可以以各種不同的形式來(lái)完成。V-基因可以用于噬菌體展示技術(shù)。本發(fā)明所展示的技術(shù)可用于生產(chǎn)特異性結(jié)合MPO同型或亞型的單鏈抗體。此外，本發(fā)明所述方法可用于Fab表達(dá)庫(kù)的構(gòu)建，從而快速和有效的鑒別具有MPO同型或亞型，或衍生物、片段、類似物或同源基因特異性的單克隆Fab片段?？梢杂脕?lái)制備MPO同型或亞型的抗體片段的技術(shù)包括但不限于(a)胃蛋白酶水解抗體分子產(chǎn)生F(ab’)2片段；(b)減弱F (ab’)2的二硫鍵生成Fab片段；(c)木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段，及(d)Fv片段。它可以進(jìn)一步理解為，尤其是在抗體片段的情況下，通過(guò)修飾抗體以增加其在血清半衰期。通過(guò)抗體片段中合適區(qū)域的突變將受體結(jié)合表位混合到抗體片段，或通過(guò)將表位混合到多肽，然后融合到抗體片段的一個(gè)末端或中間部位(例如，通過(guò)DNA或多肽合成)。異源偶聯(lián)抗體也屬于本發(fā)明所涉及的范圍內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體是由兩個(gè)共價(jià)結(jié)合抗體組成?？贵w可通過(guò)蛋白的化學(xué)合成的方法在體外制備，包括交聯(lián)劑。例如，免疫毒素可通過(guò)二硫鍵 交換反應(yīng)或者硫醚鍵來(lái)構(gòu)建。所述技術(shù)用于生產(chǎn)所需的特異性抗體。例如，可以生成一個(gè)對(duì)所有MPO同型或亞型的泛特異性抗體。此外，也可以制備對(duì)一個(gè)或多個(gè)MPO同型或亞型具有特異性的抗體?？梢灾苽湟粋€(gè)對(duì)MPO亞型I和亞型3具有特異性的抗體，但很少或根本不能和亞型2反應(yīng)?？梢陨梢粋€(gè)對(duì)MPO亞型具有特異性的抗體，但有很少或根本不能和任何亞型發(fā)生反應(yīng)。也可以是只能對(duì)一個(gè)MPO同型或亞型具有特異性的抗體?？梢允褂靡阎姆椒?，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法、免疫印跡來(lái)鑒別所需的特異性抗體。免疫分析測(cè)定利用包被抗體和一個(gè)標(biāo)記抗體來(lái)定量捕獲的分子的檢測(cè)系統(tǒng)是眾所周知的。本發(fā)明所示的免疫分析的方法包括但不僅限于，放射免疫法(RIA)，熒光免疫法(FLA)，化學(xué)發(fā)光法(CA)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。免疫分析可以是固相分析和液相分析。一方面，免疫測(cè)定法可設(shè)計(jì)自動(dòng)化，高通量的儀器。例如，貝克曼公司Access 系列，非常適合完成本發(fā)明的免疫測(cè)定法。Access 免疫測(cè)定系統(tǒng)允許通量可達(dá)每小時(shí)100次的快速測(cè)試，通過(guò)一個(gè)反應(yīng)容器裝載機(jī)，擁有長(zhǎng)達(dá)3小時(shí)的連續(xù)樣本處理的能力。另一方面，包被抗體的目標(biāo)分子的數(shù)量可以采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。在一個(gè)實(shí)施例中，包被抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的MPO同型或亞型或其組合物用于確定分析物的濃度。測(cè)試樣品中至少有一個(gè)MPO同型或亞型競(jìng)爭(zhēng)包被抗體的結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的標(biāo)記物后，HRP的顯色信號(hào)可以顯示結(jié)果。HRP的檢測(cè)可通過(guò)測(cè)量HRP與熱基底物的反應(yīng)在450nm處的吸光度。測(cè)試樣品中MPO同型或亞型或其組合的濃度與信號(hào)強(qiáng)度成反比的信號(hào)表不。對(duì)于固相免疫分析，包被抗體(如單克隆抗體)被固定在固相支持物上。在檢測(cè)程序前包被抗體通過(guò)吸附法、非共價(jià)結(jié)合或共價(jià)偶聯(lián)的方法固定在固相支撐物上(例如，用戊二醛或碳化二亞胺法交聯(lián)，反應(yīng)激活劑，硝酸或還原劑及的免疫沉淀法。固定使用的固相可能是任何惰性載體或不溶于水的支撐物，支持物的形式可以是表面劑、顆粒，多孔基質(zhì)等。常用的支持物包括薄板，葡聚糖凝膠，聚氯乙烯，塑料珠，用聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯制成的試驗(yàn)板或試管以及顆粒材料，如濾紙，瓊脂糖，交聯(lián)葡聚糖和其它多糖。包被抗體也被固定在支持物上，如珠聚合物，膠體金屬或氧化鐵粒子。珠可以是塑料，玻璃，或任何其他合適的材料，通常在1-20微米范圍內(nèi)。在一些具體實(shí)施例中，使用順磁性珠。膠體金與銀粒子和氧化鐵粒子的膠體金屬顆粒，可以是通過(guò)商業(yè)化的或已知的技術(shù)制備的。另外，非水溶性基質(zhì)如溴化氰可激活的碳水化合物，可用來(lái)固定包被抗體。一方面，包被抗體固定在微孔板，另一方面，固相是一個(gè)多孔板，可以一次分析多個(gè)樣品。固相板包被包被抗體，通過(guò)非共價(jià)鍵或共價(jià)相互作用或物理連接。如果是共價(jià)鍵形成，板或其他固相培養(yǎng)與交聯(lián)劑和包被抗體一起孵育。
將包被抗體粘附在固相支持物上的常用的交聯(lián)劑包括1，I- 二-氮-2-乙苯，戊二醛，N-羥基酯，同基雙功能亞氨酸酯，雙功能順丁烯二酰亞胺。涂層板封閉液封閉，封閉液沒(méi)有結(jié)合特異性，封閉液滲透到未被結(jié)合的位點(diǎn)以阻止外在的自由配體結(jié)合到微孔中。適當(dāng)?shù)淖钄鄤┌?，明膠，牛血清白蛋白，卵白蛋白，酪蛋白，脫脂乳。封閉在常溫下進(jìn)行，需要約1-4小時(shí)，一般約I. 5至3小時(shí)。包被和封閉后，對(duì)校準(zhǔn)液(已知濃度的MPO同型或亞型，作為校準(zhǔn))或檢測(cè)樣品進(jìn)行分析，適當(dāng)稀釋，添加到固定板上。通常情況下，稀釋率約為5-15% (V/V)。包被抗體的數(shù)量相對(duì)于校準(zhǔn)品足夠多，以便于給出良好的信號(hào)結(jié)果。但并不是摩爾數(shù)高于樣品中MPO同型或亞型s或其組合的最高水平。為了有足夠的靈敏度，測(cè)試樣品量應(yīng)增加，以致固定的包被抗體摩爾濃度比適當(dāng)稀釋后測(cè)試樣樣品中游離分析物最大摩爾濃度高，這種預(yù)期的最高水平，主要取決于樣品中MPO同型或亞型的濃度和被分析病人的臨床狀況之間的相關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，樣品和固定的包被抗體的孵育條件，，選擇以最大限度地提高分析靈敏度的檢測(cè)，以最大限度地減少分解，并確保分析物樣品中有足夠的分析物與固定的包被抗體結(jié)合。據(jù)了解，選擇最佳的反應(yīng)條件，一般只需要常規(guī)的實(shí)驗(yàn)。孵育是在相當(dāng)恒定的溫度范圍，從0°C至約40°C時(shí)，一般室溫來(lái)完成的。孵化的時(shí)間一般不超過(guò)10個(gè)小時(shí)左右。如果為防止降解MPO同型或亞型而添加蛋白酶抑制劑，孵育持續(xù)時(shí)間可能會(huì)更長(zhǎng)。 標(biāo)記抗體可以是任何可檢測(cè)到的示蹤物，這些可檢測(cè)到的示蹤物不干預(yù)包被抗體和檢測(cè)試劑的結(jié)合。合適的示蹤物可以是能夠直接檢測(cè)的，如熒光，化學(xué)發(fā)光物，色度劑和放射性標(biāo)記，以及需要通過(guò)反應(yīng)或衍生才能被檢測(cè)到的基團(tuán)，如酶。這些示蹤物的例子包括放射性同位素32P，14C，125I，3H，和1311，熒光基團(tuán)如稀土熒光螯合物或熒光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹酰基，傘形花內(nèi)酯，螢火蟲熒光素酶的細(xì)菌熒光素酶，熒光素，辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，淀粉酶，過(guò)氧化氫酶，內(nèi)酰胺酶，脲酶，己糖激酶，蘋果酸脫氫酶的P-半乳糖苷酶，糖化酶，溶菌酶，糖類氧化酶，如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環(huán)，如尿酸和黃嘌呤氧化酶氧化酶，采用過(guò)氧化氫的氧化染料前體的酶，如HRP，乳過(guò)氧化物酶，或微過(guò)氧化物酶，生物素/親和素，生物素/鏈霉親和素，生物素/鏈霉親和，自旋標(biāo)記，噬菌體標(biāo)簽，穩(wěn)定的自由基，諸如此類。示蹤物和標(biāo)記抗體結(jié)合，如抗體，在免疫測(cè)定技術(shù)中是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的操控程序。傳統(tǒng)的方法是蛋白質(zhì)或多肽共價(jià)結(jié)合到示蹤物部分。例如偶聯(lián)試劑戊二醛，二亞胺，順丁烯二酰胺，雙重氮化聯(lián)苯胺等，可以用上述熒光、化學(xué)發(fā)光、酶來(lái)標(biāo)記抗體。熒光或化學(xué)發(fā)光的示蹤物可將靈敏度放大至約5-10pg/mL。不是作為一種限制，與包被抗體結(jié)合的MPO同型或亞型分析物的數(shù)量，可以通過(guò)從固相支持物上洗脫未結(jié)合的標(biāo)記抗體，測(cè)量與分析物結(jié)合的標(biāo)記抗體上示蹤物的數(shù)量來(lái)檢測(cè)。示蹤物可以是一種酶。檢測(cè)信號(hào)的數(shù)量和被捕獲的分析物正相關(guān)。例如，當(dāng)HRP為示蹤物，顏色是通過(guò)量化檢測(cè)光密度值(0D值)在450nm處的吸光度來(lái)實(shí)現(xiàn)。另一方面，對(duì)與包被抗體結(jié)合的分析物可間接測(cè)定。本發(fā)明所述方法還提供了一種定量個(gè)體樣本中MPO同型或亞型水平的方法，和所述水平與疾病狀況的相關(guān)性。一方面，確定樣本中的個(gè)體MPO同型或亞型的相對(duì)水平，與特定疾病的存在或發(fā)生傾向的相關(guān)性。例如MPO亞型X水平的升高和亞型Y水平的降低預(yù)示疾病狀態(tài)I的存在或?qū)?lái)的發(fā)展趨勢(shì)，而亞型Y的水平的升高和亞型Z的水平的升高預(yù)示疾病狀態(tài)2的存在或?qū)?lái)的發(fā)展趨勢(shì)。在其他情況下，例如，亞型X和亞型Z，預(yù)示疾病狀態(tài)3的存在或?qū)?lái)的發(fā)展趨勢(shì)?？梢哉J(rèn)為，三種MPO同型或亞型的水平和/或比率可以被 用來(lái)預(yù)測(cè)疾病的存在或未來(lái)的病情發(fā)展。試劑盒本發(fā)明所述的測(cè)定方法，可以以試劑盒的形式提供。這種試劑盒是一個(gè)包裝組合，由以下基本要素組成(a)至少有一個(gè)包被抗體，該包被抗體能夠和至少一個(gè)MPO同型或亞型結(jié)合；(b)至少有一個(gè)標(biāo)記抗體，可以和MPO同型或亞型中至少一種結(jié)合，或者和一個(gè)標(biāo)記的MPO同型或亞型或其組合結(jié)合；(c)如何使用這些試劑執(zhí)行檢測(cè)方法的說(shuō)明書。一方面，該試劑盒可進(jìn)一步提供MPO同型或亞型的特定校準(zhǔn)，用于診斷過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的條件的相關(guān)性。該校準(zhǔn)器通常具有定量MPO同型或亞型多肽或其組合的功能，它能夠從自然表達(dá)MPO同型或亞型的細(xì)胞中分離出來(lái)或使用現(xiàn)有的技術(shù)重組獲得。另一方面，該試劑盒還包括包被抗體的固相支持物，這種固相支持物可作為一個(gè)單獨(dú)的元素或作為包被抗體已經(jīng)固定的元素。所以，試劑盒中的包被抗體或者已經(jīng)被固定在固相支持物上，包含在試劑盒中由客戶來(lái)執(zhí)行固定，或者作為試劑盒一個(gè)獨(dú)立的組分。標(biāo)記抗體可能是已標(biāo)記的分子(如抗體)，或未標(biāo)記的通過(guò)標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)的分子，。標(biāo)記物如果是一種酶，試劑盒通常包括酶所需的底物和輔助因子，標(biāo)記物如果是一種熒光染料，試劑盒包括染料前體；標(biāo)記是生物素，如抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白，則偶聯(lián)到一個(gè)載體上。該試劑盒進(jìn)一步包括一份說(shuō)明書，描述如何使用檢測(cè)試劑盒。


附圖為以MPO亞型的特異性單抗作為包被抗體的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本實(shí)施例通過(guò)酶聯(lián)免疫技術(shù)來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法，具體選用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)作為標(biāo)記抗體的標(biāo)記物，用HRP底物TMB作為顯色劑。試劑盒包括固相板、酶標(biāo)記的MPO亞型標(biāo)記抗體、MPO校準(zhǔn)品、TMB顯色劑、終止液、洗滌液。I.制備MPO亞型單克隆抗體分別用純化的MPO亞型蛋白免疫純系小鼠，小鼠血清產(chǎn)生相應(yīng)的抗體時(shí)，即可將小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞融合。利用HAT選擇雜交瘤細(xì)胞，并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)用有限稀釋液進(jìn)行克隆，同時(shí)保存陽(yáng)性細(xì)胞株，利用BALB/c純系小鼠制備大量的單克隆抗體，同時(shí)對(duì)抗體特異性的鑒定、識(shí)別抗原表位的鑒定、親和力的鑒定及配對(duì)試驗(yàn)，篩選出效果最好的一對(duì)細(xì)胞株。將篩選到的細(xì)胞株重新植入小鼠腹腔中，過(guò)5-6天取出腹水，利用硫酸銨鹽析及親和層析純化得到的單克隆抗體。2.微孔包被MPO亞型單克隆抗體包被到96孔I型微孔板上。在O. 2M NaP04，PH值為6. 5的緩 沖液中制備O. 01mg/Ml MPO亞型單克隆抗體溶液。將100 μ L抗體溶液添加到各微孔板中，并在4°C溫育整夜。然后除去抗體溶液，用300 μ L IOmM PH值7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗各微孔，添加150μ L含1%牛血清蛋白溶液，PH值7. 4的IOmM磷酸鹽緩沖液到各微孔中，微孔板在室溫中溫育整夜。除去含1%牛血清蛋白溶液，往各微孔中添加250μ L含2. 5%蔗糖溶液，PH值7. 4的磷酸鹽緩沖液，溫育4小時(shí)。除去蔗糖溶液，真空干燥微孔板整夜。微孔板保持干燥。3.辣根過(guò)氧化物酶的結(jié)合使用前，用IL PH值9. 6的O. OlM碳酸氫鈉緩沖液透析5mgMP0亞型單克隆抗體，2-8°C下整夜。此外，7. 5mg辣根過(guò)氧化物酶溶解于I. 9L蒸餾水中，混合式逐滴將O. 4mLO. IM的高碘酸鈉溶液加入辣根過(guò)氧化物酶中。在暗處混合25分鐘，然后用ILPH值4. 3的ImM醋酸鹽緩沖液透析該溶液，2-8°C下整夜。之后將透析的辣根過(guò)氧化物酶溶液添加到純化的MPO亞型單克隆抗體中，該溶液在室溫下暗處混合3-4小時(shí)。將定量的硼氫化鈉溶液添加到反應(yīng)混合物中，并置于2-8°C兩小時(shí)，期間不時(shí)混合。最后，用IL PH值7. 2，含O. 85%氯化鈉的O. 05M磷酸鹽緩沖液透析該溶液。再用S-300柱進(jìn)一步純化該結(jié)合物溶液。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備用胎牛血清將MPO 亞型稀釋到 0，I. 5，3. 0，6. 0，12，24，48，96，及 192ng/ml.將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品分別取100 μ L加入到各微孔板中。室溫下在3，OOOrpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上振蕩溫育60分鐘。除去溫育的混合物，用蒸餾水沖洗微孔5次，除去所有殘留水滴。往各孔中添加HRP標(biāo)記的MPO亞型標(biāo)記抗體，室溫下在3，OOOrpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上振蕩溫育60分鐘。除去溫育的混合物，用蒸餾水沖洗微孔5次，除去所有殘留水滴。添加IOOyL ΤΜΒ。室溫下在3，OOOrpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上振蕩溫育20分鐘。添加100 μ L IN HCL終止顯色反應(yīng)。在15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸收值。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖所示。5.終止液和洗滌液的制備量取83. 3mL濃鹽酸緩慢加至916. 7mL純化水中，充分溶解既得IN HCL0量取200mL0. 5M磷酸鉀緩沖液添加至795mL的純化水中，充分混勻后，加入85. Og NaCL充分溶解，再量取5mL Tween 20加入上述溶液中充分溶解，調(diào)PH至7. 2。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍。6.檢測(cè)樣本中的MPO亞型
于晨起7 10時(shí)對(duì)患者進(jìn)行空腹抽前臂血，立即加入EDTA和/或肝素等抗凝劑，離心后取血清置于_20°C備檢。將包被好的固相板編號(hào)，放置于固定的位置。在每個(gè)微孔中加入100 μ L的樣本，室溫振動(dòng)孵育2小時(shí)，轉(zhuǎn)速為750rpm。用洗滌液沖洗微孔板4次，再用蒸餾水沖洗I次，并在干凈的吸水紙將殘留的水分扣干。在每個(gè)微孔板中加入100 μ L的MPO標(biāo)記抗體，室溫振動(dòng)孵育2小時(shí)，轉(zhuǎn)速為750rpm。用洗滌液沖洗微孔板4次，再用蒸餾水沖洗I次，并在干凈的吸水紙將殘留的水分扣干。每孔中加入1000 μ L的TMB試劑，室溫暗處振動(dòng)孵育20分鐘，轉(zhuǎn)速為750rpm。在每孔中加入100 μ L的鹽酸終止液，輕輕混勻20秒，在20分鐘內(nèi)，于Α450處讀取吸光度。7.取本實(shí)施例所訴的試劑盒，對(duì)20份急性冠狀動(dòng)脈綜合癥患者血樣和15份正常人血樣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示20份急性冠狀動(dòng)脈綜合癥患者血樣中檢出MPO亞型，15份正常人血樣中14份未檢出MPO亞型的存在，I份血樣中含有微量MPO亞型。說(shuō)明本實(shí)施例試劑盒具有良好的特異性和靈敏度。 雖然本發(fā)明的具體情況已經(jīng)在上述具體實(shí)施例中加以描述，但是應(yīng)該理解，這些僅僅是以具體實(shí)施例的形式展現(xiàn)給專業(yè)內(nèi)同行，并不是限制其適用范圍和方式。它將給技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的人士揭示各種形式和細(xì)節(jié)的變化而不分離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的廣度和范圍不應(yīng)只限于由任何上述的模式體現(xiàn)，而應(yīng)該理解為落在本發(fā)明權(quán)利要求和其等價(jià)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶(MPO)同型或亞型或其組合物來(lái)診斷或預(yù)后過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病狀態(tài)的方法，包括:ΜΡ0同型、亞型或其組合物中的至少一種能夠和特異性結(jié)合的包被抗體結(jié)合;ΜΡ0同型、亞型或其組合物中的至少一種能夠和一個(gè)標(biāo)記抗體結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述MPO同型或亞型或其組合能夠被所述MPO同型或亞型或其組合的特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記抗體為單克隆抗體、單一特異性多克隆抗體、抗體結(jié)合片段中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記抗體包括一種可檢測(cè)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記為化學(xué)發(fā)光劑、比色劑、酶、酶反應(yīng)的底物、熒光劑或放射性同位素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶可以是堿性磷酸酶，淀粉酶，熒光素酶，過(guò)氧化氫酶，β -半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，己糖激酶，辣根過(guò)氧化物酶，內(nèi)酰胺酶，脲酶，蘋果酸脫氫酶中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述包被抗體為單克隆抗體、單一特異性多克隆抗體或抗體結(jié)合片段中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被抗體是偶聯(lián)到具有蛋白偶聯(lián)表面的固相支持物上的，所述固相支撐物可以是一種滴定板，一種膠體金粒子，一種氧化鐵離子或聚珠。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述診斷和預(yù)后的方法是固相免疫分析法。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述測(cè)試樣品可以是全血、血漿、血清、細(xì)胞提取物或組織提取物中的一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述對(duì)MPO同型或亞型或其組合的檢測(cè)是和過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫疾病相關(guān)的。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述炎癥疾病為炎性腸病，所述自身免疫疾病為急性播散性腦脊髓炎，阿狄森氏病，強(qiáng)直性脊柱炎，抗磷脂抗體綜合征，再生障礙性貧血，自身免疫性肝炎，腹腔疾病，克羅恩病的糖尿病，橋本氏病，特發(fā)性血小板減少性紫癜，紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化癥，重癥肌無(wú)力，視神經(jīng)炎，天皰瘡，原發(fā)性膽汁性肝硬化，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，干燥綜合征，自身免疫性溶血性貧血或韋格納肉芽腫中的一種。
12.—種檢測(cè)樣本中MPO同型或亞型或其組合的試劑盒,包括包被抗體、標(biāo)記抗體和固相載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述包被抗體為單克隆抗體、單一特異性多克隆抗體或抗體結(jié)合片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述包被抗體是偶聯(lián)到具有蛋白偶聯(lián)表面的固相支持物上的，所述固相支撐物可以是一種微孔板，一種膠體金粒子，一種氧化鐵離子或聚珠。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記抗體為單克隆抗體、單一特異性多克隆抗體、抗體結(jié)合片段中的一種。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記抗體包括一種可檢測(cè)標(biāo)記，可檢測(cè)標(biāo)記為化學(xué)發(fā)光劑、比色劑、能量轉(zhuǎn)移劑、酶、酶反應(yīng)的底物、熒光劑或放射性同位素。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含一種定量檢測(cè)樣本中至少一種MPO同型或亞型或其組合物的校準(zhǔn)品。 ·
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶(MPO)同型或亞型或其組合物的方法，特別是一種通過(guò)檢測(cè)樣本中MPO同型或亞型或其組合物中的一種，而不是全部的高特異性和高靈敏度的免疫測(cè)定方法。輔助診斷患者是否有過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病，或預(yù)后患者發(fā)展為過(guò)敏性疾病、炎癥疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病風(fēng)險(xiǎn)的分析。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于實(shí)施所述方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/573GK102914651SQ201210334748
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者張開(kāi)山, 蘇廣宇, 高陽(yáng) 申請(qǐng)人:杭州華得森生物技術(shù)有限公司