專利名稱：雜交連接物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種共價偶聯(lián)(couple)兩個或多個部分的方法。本發(fā)明涉及兩個或多個各自包含可雜交區(qū)域的連接物的用途以及兩個或多個能夠形成共價鍵的基團的用途。 所述連接物上的可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分。然后所述連接的部分通過所述基團之間形成共價鍵而偶聯(lián)。
背景技術：
兩個或多個部分的共價偶聯(lián)在化學和生物化學領域中有很多應用。當使用化學偶聯(lián)方法時，部分之間的反應速率依賴于能夠反應的所述部分的濃度。如果所述部分的濃度低，那么所述反應速率可能會由所述部分的濃度限速。對于很多應用來說，所述部分的濃度可能較低，因此需要提高反應速率的方法(或者，降低所需的部分的濃度的方法)。已知可以制備一些分子或分子集合來進行自組裝以形成更大的、更復雜的結構， 這些的實例包括DNA、蛋白質、脂質、液晶、聚合物等。這些物質的分子組分通常相互之間有很高的親和力，并且在低濃度下可以自組裝。自組裝系統(tǒng)的一個缺點是它們經常通過非共價相互作用聚集，因此穩(wěn)定性有限。

發(fā)明內容
發(fā)明人出乎意料地證明利用自組裝系統(tǒng)的高親和性，可在低濃度下使兩個或多個部分共價偶聯(lián)。更具體地，發(fā)明人出乎意料地證明兩個或多個高親和力雜交連接物可被用于連接兩個或多個部分，然后再將所述部分使用能夠一起共價反應的化學基團偶聯(lián)。所得到的復合物的穩(wěn)定性比僅使用高親和力雜交連接物形成的等價非共價復合物的穩(wěn)定性高。因此，本發(fā)明提供共價偶聯(lián)兩個或多個部分的方法，所述方法包括(a)提供第一部分，其上共價連接有(i)至少一個第一連接物，其包含第一可雜交區(qū)域；和(ii)至少一個能夠形成共價鍵的第一基團；(b)提供第二部分，其上共價連接有(i)至少一個第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域；和(ii)至少一個能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團；(c)在允許所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分的條件下使所述第一和第二部分接觸；并且(d)將所述連接的部分暴露于允許所述第一和第二基團之間形成共價鍵的條件。本發(fā)明還提供-使用本發(fā)明的方法偶聯(lián)的第一和第二部分；-使用本發(fā)明的第一和第二連接物偶聯(lián)至第二部分的第一部分；-一對本發(fā)明的第一和第二連接物；和-本發(fā)明的一對連接物用于將第一部分偶聯(lián)至第二部分的用途。


圖1顯示EcoExo I結構的卡通圖，其顯示天然存在的半胱氨酸的位置和殘基數(shù)目 (從晶體結構得到)。圖2顯示EcoExo I的表面圖，顯示可及的半胱氨酸的位置(從晶體結構得到)。圖3顯示與野生型比較的Exo I突變體的相對活性。圖4顯示EcoExo I的圖，顯示可引入用于與蛋白質納米孔偶聯(lián)的單個半胱氨酸的位置。圖fe和恥顯示與野生型比較的Exo I突變體的相對活性。圖6顯示核酸外切酶I測定法的圖示。圖7顯示來自核酸外切酶I測定法的數(shù)據(jù)的實例。圖8顯示連接物與EXO-ATTTT-A83C的連接不影響酶活性。Y-軸是相對活性。左邊的一對柱是0NLP1403，右邊的一對柱是0NLP1405。在每對柱中，左邊柱(深色柱)是帶有連接物的酶，右邊柱(淺色柱)是沒有連接物的酶。圖9顯示PNA與EXO-ATTTT-A83C的連接不影響酶活性。Y-軸是相對活性。右邊柱是ONLP1498，左邊柱是ONLP1499。圖10顯示PEG連接物與Exo-ATTTT或Exo-ATTTT_M184C的連接不影響酶活性。 Y-軸是相對活性。左邊的一對柱是Exo-ATTTT，右邊的一對柱是Exo-ATTTT-M184C。在每對柱中，左邊柱(深色柱)是有連接物的酶，右邊的(淺色柱)是沒有連接物的酶。圖11顯示在實施例中所使用的銅(I)結合配體。序列表的說明SEQ ID NO=I顯示編碼野生型α -溶血素(α -HL)的一個亞基的多核苷酸序列。SEQ ID NO 2顯示野生型α -HL的一個亞基的氨基酸序列。氨基酸2至6、73至 75,207至209、214至216和219至222形成α -螺旋。氨基酸22至30、；35至44、52至62、 67 至 71、76 至 91、98 至 103、112 至 123、137 至 148、154 至 159、165 至 172、229 至 235、243 至沈1、266至271、285至286和291至293形成β-折疊。所有其他非末端氨基酸，也就是 7 至 21、31 至 34、45 至 51、63 至 66、72、92 至 97、104 至 111、124 至 136、149 至 153、160 至 164,173 至 206,210 至 213、217、218、223 至 228,236 至 242,262 至 265,272 至 274 和 287 至290形成環(huán)區(qū)域。氨基酸1和294是末端氨基酸。SEQ ID NO :3顯示編碼α-HL L135C/N139Q (HL-CQ)的一個亞基的多核苷酸序列。SEQ ID Ν0:4顯示α-HL L135C/N139Q(HL-CQ)的一個亞基的氨基酸序列。在野生型α-HL中形成α-螺旋、β-折疊和環(huán)區(qū)域的相同氨基酸在該亞基中形成相應的區(qū)域。SEQ ID NO 5顯示衍生自大腸桿菌(E. coli) sbcB基因的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。它編碼來自大腸桿菌的核酸外切酶I (EcoExo I)。SEQ ID NO :6顯示來自大腸桿菌的核酸外切酶I (EcoExo I)的氨基酸序列。該酶從5，至3，方向從單鏈DNA(ssDNA)持續(xù)消化5，單磷酸核苷。氨基酸60至68、70至78、80 至 93、107 至 119,124 M 128,137 M 148,165 M 172、182 至 211、213 至 221、234 至 241、268 至 286、313 至 324、3洸至；352、362 至 370、373 至 391、401 至妨4 和 457 至 475 形成 α -螺旋。氨基酸10至18J8至洸、47至50、97至101、133至136、2四至232、243至251、258至沈3、298至302和308至311形成β-折疊。所有其他非末端氨基酸，19至27、37至46、51至 59、69、79、94 至 96、102 至 106、120 至 123、129 至 132、149 至 164、173 至 181、212、222 至 228、233、242、252 至 257,264 至 267,287 至 297,303 至 307、312、325、353 至 361、371、372、 392至400、455和456形成環(huán)。氨基酸1至9是末端氨基酸。酶整體折疊為三個區(qū)域結合形成外形為字母C的分子，但是在晶體結構中無序的殘基355-358可有效地將該C轉變?yōu)?0-樣形狀。氨基末端(1-206)形成核酸外切酶結構域，與DnaQ超家族有同源性，后面的殘基(202-354)形成SH3-樣結構域，羧基結構域(359-475)伸出所述核酸外切酶結構域以形成所述分子的C-樣形狀。EcoExo I的4個酸性殘基與所述DnaQ超家族的活性位點殘基是保守的(對應于D15、E17、D108和D186)。據(jù)稱殘基D15和108結合有單個金屬離子。DNA 的水解可能是通過活化的水分子攻擊易被切斷的磷酸基來催化的，H181是催化殘基并對準所述核苷酸底物。SEQ ID NO :7 顯示編碼 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C51A (0NLD0393)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :8 顯示 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C51A (0NLD0393)的氨基酸序列。SEQ ID NO :9 顯示編碼 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C 144M(0NLD0403)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO 10 顯示 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C144M(0NLD0403)的氨基酸序列。SEQ ID NO 11 顯示編碼 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C144T (0NLD0404)的密碼子優(yōu)化多核苷酸序列。SEQ ID NO 12 顯示 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C144T (0NLD0404)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98S/C144M/C306S/C330T/ V42C (0NLD0415)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :14 顯示 EcoExo I C51A/C98S/C144M/C306S/C330T/V42C (0NLD0415)的
氨基酸序列。SEQ ID NO: 15 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98S/C144T/C306S/C330T/ V42C (0NLD0416)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO 16 顯示 EcoExo I C51A/C98S/C144T/C306S/C330T/V42C (0NLD0416)的
氨基酸序列。SEQ ID NO: 17 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98S/C144M/C306S/C330T/ M184C (0NLD0417)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :18EcoExo I C51A/C98S/C144M/C306S/C330T/M184C (0NLD0417)的氨
基酸序列。SEQ ID NO: 19 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98S/C144T/C306S/C330T/ M184C (0NLD0418)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :20 顯示 EcoExo I C51A/C98S/C144T/C306S/C330T/M184C (0NLD0418)
的氨基酸序列。SEQ ID NO :21 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98S/C144T/C306S/C330T (0NLD0411)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。
SEQ ID NO :22 顯示 EcoExo I C51A/C98S/C144T/C306S/C330T (0NLD0411)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :23 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306S/C330T (0NLD0432)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :24 顯示EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306S/C330T (0NLD0432)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :25 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306T/C330T (0NLD0433)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :26 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306T/C330T (0NLD0433)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :27 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98T/C144M/C306S/C330T (0NLD0451)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :28 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144M/C306S/C330T (0NLD0451)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :29 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98T/C144M/C306T/C330T (0NLD0452)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :30 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144M/C306T/C330T (0NLD0452)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :31 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98G/C144T/C306S/C330T (0NLD0453)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :32 顯示 EcoExo I C51A/C98G/C144T/C306S/C330T (0NLD0453)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :33 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98D/C144T/C306S/C330T (0NLD0491)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :34 顯示 EcoExo I C51A/C98D/C144T/C306S/C330T (0NLD0491)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :35 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98K/C144T/C306S/C330T (0NLD0454)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :36 顯示 EcoExo I C51A/C98K/C144T/C306S/C330T (0NLD0454)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :37 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98L/C144T/C306S/C330T (0NLD0455)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :38 顯示 EcoExo I C51A/C98L/C144T/C306S/C330T (0NLD0455)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :39 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98V/C144T/C306S/C330T (0NLD0456)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :40 顯示 EcoExo I C51A/C98V/C144T/C306S/C330T (0NLD0456)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :41 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98V/C144T/C306T/C330T (0NLD0476)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :42 顯示 EcoExo I C51A/C98V/C144T/C306T/C330T (0NLD0476)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :43 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98T/C144T/C306M/C330T (0NLD0477)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :44 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306M/C330T (0NLD0477)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :45 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306N/C330T (0NLD0478)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :46 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306N/C330T (0NLD0478)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :47 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98T/C144T/C306D/C330T (0NLD0479)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :48 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306D/C330T (0NLD0479)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :49 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98T/C144T/C306A/C330T (0NLD0480)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :50 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306A/C330T (0NLD0480)的氨基
酸序列。在SEQ ID NO :7至50所描述的全部突變體中，在野生型EcoExo I中形成α -螺旋、β-折疊和環(huán)區(qū)域的相同氨基酸在該突變體中形成相應區(qū)域。SEQ ID NO 51顯示衍生自大腸桿菌xthA基因的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。它編碼大腸桿菌的核酸外切酶III。SEQ ID NO :52顯示來自大腸桿菌的核酸外切酶III的氨基酸序列。該酶從3，_5， 方向從雙鏈DNA(dsDNA)的一條鏈上分配性消化5’單磷酸核苷。在鏈上的酶啟動需要大約 4個核苷酸的5，突出。氨基酸11至13、15至25、39至41、44至49、85至89、121至139、 158 至 160、165 至 174、181 至 194、198 至 202、219 至 222、2；35 至 240 和 248 至 252 形成 α-螺旋。氨基酸2至7、四至33、53至57、65至70、75至78、91至98、101至109、146至 151、195至197、2四至234和241至246形成β-折疊。所有其他非末端氨基酸，8至10、 26 至 28,34 至 38、42、43、50 至 52,58 至 64,71 至 74,79 至 84、90、99、100、110 至 120,140 至 145、152 至 157、161 至 164、175 至 180、203 至 218、223 至 2沘、247 和 253 至形成環(huán)。氨基酸1、267和268是末端氨基酸。酶活性位點是通過連接 ^-α^ ^-βρ ^-βρ β ΙΠ- α ρ β ιν_ α π 禾口 β ν_ β VI 的環(huán)區(qū)域(分別由氨基酸 8-10、58-64、90、110-120、152-164、 175-180、223-2觀和253-261構成)形成的。單個二價金屬離子結合在殘基E34上，幫助 D229和H259組氨酸-天冬氨酸催化對親核攻擊磷酸二酯鍵。SEQ ID NO 53顯示衍生自嗜熱棲熱菌(T. thermophilus)的recj基因的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。它編碼來自嗜熱棲熱菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)。SEQ ID NO力4顯示嗜熱棲熱菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)的氨基酸序列。該酶從 5’-3’方向從ssDNA持續(xù)消化5’單磷酸核苷。鏈上的酶啟動需要至少4個核苷酸。氨基酸 19 至 33、44 至 61、80 至 89、103 至 111、136 至 140、148 至 163、169 至 183、189 至 202、 207 至 217、223 至 240、242 至 252、254 至沘7、302 至 318、338 至 350 和 365 至 382 形成 α -螺旋。氨基酸36至40、64至68、93至96、116至120、133至135J94至四7、321至 325,328至332、352至355和359至363形成β -折疊。所有其他非末端氨基酸，34,35,41 至 43、62、63、69 至 79,90 至 92,97 至 102,112 至 115,121 至 132,141 至 147,164 至 168、 184 至 188,203 至 206,218 至 222、241、253、288 至 293,298 至 301、319、320、326、327、333 至337、351至358和364形成環(huán)。氨基酸1至18和383至425是末端氨基酸。僅對嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的RecJ的核心結構域(殘基40-463)的晶體結構進行了解析。為了確保RecJ核心結構域的翻譯起始和體內表達，在其氨基末端加入了甲硫氨酸殘基，而這在晶體結構信息中不存在。所解析的結構顯示兩個結構域一氨基(2-253)和羧基 (288-463)區(qū)域，通過長的α-螺旋(254-287)連接。催化殘基(D46、D98、Η122和D183) 與單個二價金屬離子配位以親核攻擊所述磷酸二酯鍵。D46和Η120被認為是所述催化對； 但是，對大腸桿菌RecJ中的這些保守殘基任意一個的突變都被證明可消除活性。SEQ ID NO :55顯示衍生自噬菌體λ exo (redX)基因的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。它編碼噬菌體λ核酸外切酶。SEQ ID NO :56顯示噬菌體λ核酸外切酶的氨基酸序列。所述序列是組裝成三聚體的三個相同亞基之一的序列。所述酶高度持續(xù)地從dsDNA的一條鏈上消化核苷酸，方向是3’-5’。在鏈上的酶啟動優(yōu)先地需要大約4個具有5’磷酸的核苷酸的5’突出端。氨基酸 3 至 10、14 至 16、22 至洸、；34 至 40、52 至 67、75 至 95、1；35 至 149、152 至 165 和 193 至 216 形成 α-螺旋。氨基酸 100 至 101、106 至 107、114 至 116、120 至 122、127 至 131、169 至175和184至190形成β-折疊。所有其他非末端氨基酸，11至13、17至21、27至33、 41 至 51,68 至 74,96 至 99,102 至 105,108 至 113,117 至 119,123 至 126,132 至 134,150 至151、166至168、176至183、191至192、217至222形成環(huán)。氨基酸1、2和2 是末端氨基酸。λ核酸外切酶是同源三聚體，所述同源三聚體形成圓環(huán)結構(toroid)，其具有穿過中間的錐形通道，該通道在一端顯然大到足以使dsDNA進入，而另一端僅能使ssDNA出去。 未確定催化殘基，但是單個二價金屬離子看起來通過殘基Dl 19、EU9和L130與各個亞基結
口 OSEQ ID NO :57顯示核酸序列，從其可產生優(yōu)選的核酸連接物。SEQ ID NO :58顯示優(yōu)選的核酸連接物。MAL是馬來酰亞胺。該連接物與SEQ ID N0:61結合使用。SEQ ID NO :59顯示優(yōu)選的核酸連接物。MAL是馬來酰亞胺。該連接物與SEQ ID NO:62結合使用。SEQ ID NO :60顯示優(yōu)選的核酸連接物。MAL是馬來酰亞胺。該連接物與SEQ ID N0:63結合使用。SEQ ID NO :61顯示優(yōu)選的核酸連接物。MAL是馬來酰亞胺。該連接物與SEQ ID NO 58互補并且用于與SEQ ID NO 58結合使用。SEQ ID NO :62顯示優(yōu)選的核酸連接物。MAL是馬來酰亞胺。該連接物與SEQ ID NO 59互補并且與SEQ ID NO 59結合使用。SEQ ID NO :63顯示優(yōu)選的核酸連接物。MAL是馬來酰亞胺。該連接物與SEQ IDNO 60互補并且與SEQ ID NO 60結合使用。SEQ ID NO 64顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO 65結合使用。SEQ ID NO 65顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO 64結合使用。SEQ ID NO 66顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO 68結合使用。SEQ ID NO 67顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO 69結合使用。SEQ ID NO :68顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO :66互補并且與 SEQ ID NO 66結合使用。SEQ ID NO :69顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO :67互補并且與 SEQ ID NO 67結合使用。SEQ ID NO :70顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO :73互補并且與 SEQ ID NO 73結合使用。SEQ ID NO :71顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO :74互補并且與 SEQ ID NO: 74結合使用。SEQ ID NO 72顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO 75結合使用。SEQ ID NO 73顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO 70結合使用。SEQ ID NO 74顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO 71結合使用。SEQ ID NO :75顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO :72互補并且與 SEQ ID NO 72結合使用。SEQ ID NO 76顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO 77結合使用。SEQ ID NO 77顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO 76結合使用。SEQ ID NO :78顯示優(yōu)選的核酸連接物。該連接物與SEQ ID NO :67互補并且與 SEQ ID NO 67結合使用。
具體實施例方式應理解所公開的產物和方法的不同應用可根據(jù)本領域具體需要而調整。還應理解本文使用的術語僅用于描述本發(fā)明的具體實施方案的目的，并且無意于限制。此外，除非上下文明確說明相反，否則本說明書和所附權利要求書所使用的單數(shù)形式“一種”、“一個”和“所述”包括復數(shù)指示物。因此，例如，提及“一種連接物”包括“多種連接物”，提及“一種跨膜蛋白質孔”包括兩種或多種這樣的孔，提及“一種部分”包括兩種或多種這樣的部分，等。本文引用的所有出版物、專利和專利申請，無論是在上文還是在下文中，都以引用的方式全文納入本說明書。本發(fā)明提供用于偶聯(lián)兩個或多個部分的方法。本發(fā)明涉及(1)兩個或多個各自包含可雜交區(qū)域的連接物和( 兩個或多個能夠形成共價鍵的基團的用途。所述連接物中的可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分。然后所述連接的部分通過所述基團之間形成的共價鍵偶聯(lián)。本發(fā)明的方法共價地偶聯(lián)兩個或多個部分。所述方法包括提供第一部分，其上共價連接有(i)至少一個第一連接物，其包含第一可雜交區(qū)域；和(ii)至少一個能夠形成共價鍵的第一基團。所述方法還包括提供第二部分，其上共價連接有(i)至少一個第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域；和(ii)至少一個能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團。在允許所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分的條件下使所述第一和第二部分接觸。所述雜交反應的高親和性使得所述部分可以在低濃度下連接。這將在下文中進一步詳細討論。然后將所述連接的部分暴露于允許所述第一和第二基團之間形成共價鍵的條件。一個或多個共價鍵的形成可加強所述兩個部分之間的連接，并且形成比僅用雜交實現(xiàn)時的更穩(wěn)定的復合物。本發(fā)明中使用的所有基團優(yōu)選地不與本身反應。這會在偶聯(lián)兩個或多個不同部分時提高所述方法的產率，因為它會防止一個部分與其自身的另一個形式偶聯(lián)，而不與其應該偶聯(lián)的不同部分偶聯(lián)。在一個實施方案中，所述至少一個第一基團直接共價連接至所述第一部分，或者通過單獨的連接物(例如，與所述第一連接物不同的連接物)連接至所述第一部分，并且 /或者所述至少一個第二基團直接共價連接至所述第二部分，或者通過單獨的連接物(即， 與所述第二連接物不同的連接物)連接至所述第二部分。所述單獨的連接物可以是任意類型的連接物。合適的連接物是本領域中已知的，并且可以是下文更詳細描述的任意連接物。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個第一基團通過所述第一連接物共價連接至所述第一部分，并且/或者至少一個所述第二基團通過所述第二連接物共價連接至所述第二部分。在該實施方案中，所述第一部分優(yōu)選地共價連接有至少一個第一連接物，其包含第一可雜交區(qū)域和能夠形成共價鍵的第一基團；并且/或者所述第二部分優(yōu)選地共價連接有第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域和能夠與第一基團形成共價鍵的第二基團。在最優(yōu)選的實施方案中，所述第一和第二基團分別通過所述第一和第二連接物共價連接至所述第一和第二部分。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括(a)提供第一部分，其上共價連接有至少一個第一連接物，其包含第一可雜交區(qū)域和能夠形成共價鍵的第一基團；(b)提供第二部分，其上共價連接有至少一個第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域和能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團；(c)在允許所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分的條件下使所述第一和第二部分接觸；并且(d)將所述連接的部分暴露于允許所述第一和第二基團之間形成共價鍵的條件。每個部分都共價連接有至少一個連接物。用于將連接物共價連接至部分的方法是本領域中公知的。例如，所述連接物可通過二硫鍵連接至蛋白質部分的半胱氨酸殘基。這將在下文更詳細地描述。每個部分均可共價連接有超過一個連接物，例如2、3、4或更多個連接物。在這樣的實施方案中，被偶聯(lián)的所述兩個或多個部分一般具有相同數(shù)目的連接物共價連接于其上。然而，被偶聯(lián)的所述兩個或多個部分可各自具有不同數(shù)目的連接物共價連接其上。這還將在下文更詳細地描述。如果每個部分使用超過一個連接物，則優(yōu)選每個部分上的連接物形成連接在一起的連接物對。換言之，各個部分上的兩個連接物的可雜交區(qū)域優(yōu)選地能夠彼此特異性地雜交。實現(xiàn)上述內容的最簡單的方法是將兩個連接物的可雜交區(qū)域設計為使得它們僅彼此雜交而不與本發(fā)明使用的任何其他可雜交區(qū)域雜交。如果所述第一和第二基團連接至所述第一和第二連接物，則還可使用下文描述的鏈接化學(click chemistry)形成連接物對。
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在一個優(yōu)選的實施方案中，所述第一部分共價連接有2、3或4個第一連接物，而第二部分共價連接有相應數(shù)目的第二連接物，并且所述連接物形成一個或多個第一和第二連接物對，在所述連接物對中，每對中的可雜交區(qū)域相互特異性地雜交，但不與其他連接物對的任何可雜交區(qū)域雜交。在該實施方案中，所述部分會形成穩(wěn)定的復合物，因為它們會由2、 3或4個共價鍵連接。該實施方案還可被用于以需要的取向固定所述兩個部分。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述部分由兩個連接物連接，所述方法包括(a)提供第一部分，其上共價連接有(i)第一連接物，其包含第一可雜交區(qū)域，(ii)能夠形成共價鍵的第一基團，(iii)包含第三可雜交區(qū)域的第三連接物，和(iv)能夠形成共價鍵的第三基團；(b)提供第二部分，其上共價連接有(i)第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域，(ii)能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團，(iii) 包含能夠與所述第三可雜交區(qū)域雜交的第四可雜交區(qū)域的第四連接物，和(iv)能夠與所述第三基團形成共價鍵的第四基團；(C)在允許所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交并允許所述第三和第四可雜交區(qū)域雜交并且連接所述部分的條件下使所述第一和第二部分接觸；并且(d)將所述連接的部分暴露于以下條件即允許所述第一和第二基團之間和所述第三和第四基團之間形成共價鍵。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括(a)提供第一部分，其共價連接有(1)第一連接物，其包含第一可雜交區(qū)域和能夠形成共價鍵的第一基團， 和(2)第三連接物，其包含第三可雜交區(qū)域和能夠形成共價鍵的第三基團；(b)提供第二部分，其共價連接有(1)第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域和能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團，和( 第四連接物，其包含能夠與所述第三可雜交區(qū)域雜交的第四可雜交區(qū)域和能夠與所述第三基團形成共價鍵的第四基團； (c)在允許所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交并允許所述第三和第四可雜交區(qū)域雜交并且連接所述部分的條件下使所述第一和第二部分接觸；并且(d)將所述連接的部分暴露于以下條件即允許所述第一和第二基團之間和第三和第四基團之間形成共價鍵。優(yōu)選地，所述第一可雜交區(qū)域不與所述第三和第四可雜交區(qū)域雜交，所述第二可雜交區(qū)域不與所述第三和第四可雜交區(qū)域雜交，所述第三可雜交區(qū)域不與所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交，并且所述第四可雜交區(qū)域不與所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交。使用每個部分上不同數(shù)目的連接物來偶聯(lián)所述兩個或多個部分也有益處。例如， 可控制所述部分的相對取向。在一個實施方案中，所述部分之一有2、3或4個連接物，而另一個部分僅有1個連接物。所述單個或單獨的連接物當然需要包含能夠與相應部分上多個連接物的可雜交區(qū)域雜交的2、3或4個可雜交區(qū)域。與多個連接物的雜交可引起所述單個或單獨的連接物彎曲或折曲。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述第一部分共價連接有(i) 包含第一可雜交區(qū)域的第一連接物，(ii)能夠形成共價鍵的第一基團，(iii)包含第三可雜交區(qū)域的第三連接物，和(iv)能夠形成共價鍵的第三基團；并且所述第二部分共價連接有(i)第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域和能夠與所述第三可雜交區(qū)域雜交的第四可雜交區(qū)域，( )能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團，和(iii)能夠與所述第三基團形成共價鍵的第四基團。在一個更優(yōu)選的實施方案中， 所述第一部分共價連接有第一連接物和第三連接物，而所述第二部分共價連接有第二連接物，其中所述第一連接物包含第一可雜交區(qū)域和能夠形成共價鍵的第一基團，其中所述第三連接物包含第三可雜交區(qū)域和能夠形成共價鍵的第三基團，并且其中所述第二連接物包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域、能夠與所述第三可雜交區(qū)域雜交的第四可雜交區(qū)域和能夠與所述第一和第三基團形成共價鍵的第二和第四基團。每個部分均共價連接有至少一個基團。用于將基團共價連接至所述部分或所述連接物的方法是本領域中公知的。這將在下文中更詳細地描述。每個部分均共價連接有超過一個基團，例如2、3、4或更多個基團。這使得可形成包含所述部分的牢固復合物。所述連接物和基團還可被設計來以所需的所述部分相互之間的空間取向固定所述部分。還可使用多個基團來限制所述部分相互之間的活動性。例如，可使用多個基團來限制一個部分旋轉的自由度或其移動遠離另一個部分的能力。根據(jù)本發(fā)明，可偶聯(lián)超過兩個部分，例如3、4、5、6或更多個部分。這使得可以形成包含數(shù)個部分的復合物。它還使得可以形成包含具有特定排布方式的數(shù)個部分的復合物。例如，可將所述連接物的可雜交區(qū)域或基團設計為使它們以特定排布方式偶聯(lián)所述部分。例如，如果使用三個部分(A、B或C)，則可以各個特定的排布來方式偶聯(lián)它們，也就是 A-B-C、A-C-B、B-A-C、B-C-A、C-A-B和C-B-A。任意這些排布的末端部分還可被偶聯(lián)起來形成部分的“環(huán)”。本領域技術人員能夠設計出合適的部分和連接物組合來使所述部分可以連接起來。例如，如果如上所述使用三個部分(A、B和C)，則可通過提供共價連接有兩個連接物的 B來形成A-B-C，所述連接物之一允許通過A上的單個連接物進行偶聯(lián)，而所述連接物的另一個允許通過B上的單個連接物進行偶聯(lián)?；蛘?，每個部分都可以共價連接有兩個連接物。 如果A上的一個連接物允許通過B上的一個連接物進行偶聯(lián)，B上的另一個連接物允許通過C上的一個連接物進行偶聯(lián)，C上的另一個連接物允許通過A上的余下連接物進行偶聯(lián)， 則所述三個部分可以偶聯(lián)成“環(huán)”。還可如上文所述使用多個連接物來偶聯(lián)每個部分。在另一個實施方案中，可將所述連接物設計為可自組裝為共價連接有所述部分的結構。核酸自組裝是本領域中公知的。合成的寡核苷酸之間的相互作用以及因此它們通過雜交形成的結構可通過使用簡單規(guī)則(Watson-Crick堿基配對，加上規(guī)定結構基序(例如連接點、G-四鏈體、i-基序等)設計的規(guī)則)設計它們的核苷酸序列來加以控制。例如，Seeman等人已制備了多種三維DNA晶體(例如NC Seeman et al.，J. Theor. Biol. 99， 237(1982))。所述自組裝結構可通過所述連接物上的所述基團之間形成的共價鍵來偶聯(lián)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括偶聯(lián)3、4或5個部分，并且其中每個部分共價連接有(i)至少一個連接物，其包含能夠與不同部分上的連接物的可雜交區(qū)域雜交的可雜交區(qū)域，和(ii)至少一個能夠與不同部分上的基團形成共價鍵的共價基團。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括連接3、4或5個部分，并且其中每個部分共價連接有至少一個連接物，其包含能夠與另一個連接物的可雜交區(qū)域雜交的可雜交區(qū)域和能夠與另一個連接物上的基團形成共價鍵的共價基團。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括a)提供第一部分，其共價連接有(i)包含第一可雜交區(qū)域的第一連接物，和(ii)能夠形成共價鍵的第一基團；b)提供第二部分，其共價連接有(i)第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域，和(ii)能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團，(iii)包含第三可雜交區(qū)域的第三連接物，和(iv)能夠形成共價鍵的第三基團；c)提供第三部分，其共價連接有 (i)第四連接物，其包含能夠與所述第三可雜交區(qū)域雜交的第四可雜交區(qū)域，(ii)能夠與所述第三基團形成共價鍵的第四基團；d)在允許所述可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分的條件下使所述第一、第二和第三部分接觸；并且e)將所述連接的部分暴露于允許所述基團之間形成共價鍵的條件。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括(a)提供第一部分，其共價連接有第一連接物，所述第一連接物包含第一可雜交區(qū)域和能夠形成共價鍵的第一基團；(b) 提供第二部分，其共價連接有(1)第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域和能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團，和( 第三連接物，其包含第三可雜交區(qū)域和能夠形成共價鍵的第三基團；(c)提供第三部分，其共價連接有第四連接物，所述第四連接物包含能夠與所述第三可雜交區(qū)域雜交的第四可雜交區(qū)域和能夠與所述第三基團形成共價鍵的第四基團；(d)在允許所述可雜交區(qū)域雜交并且連接所述部分的條件下使所述第一、第二和第三部分接觸；并且(e)將所述連接的部分暴露于允許所述基團之間形成共價鍵的條件。部分所述兩個或多個部分可以是可使用連接物共價偶聯(lián)的任意物質或表面。優(yōu)選的部分包括但不局限于多肽、蛋白質、核酸、化學基團、染料、親和標簽、聚合物、小珠、抗體、載體、固定的金屬親和基質、谷胱甘肽瓊脂糖凝膠、糊精瓊脂糖凝膠、親和基質、IgG瓊脂糖凝膠、活化的巰基-瓊脂糖凝膠、金屬薄膜、納米顆粒、玻璃、經處理的玻璃、塑料、樹脂表面、 固態(tài)納米孔、傳感器表面和單分子探測器。合適的固態(tài)孔包括但不局限于氮化硅孔、二氧化硅孔和石墨烯(graphene)孔。美國專禾Ij No. 6，464，842、WO 03/003446、W02005/061373、美國專利 No. 7，258，838、美國專利 No. 7，466，069、美國專利No. 7，468，271和美國專利No. 7，253，434中描述了其他合適的固態(tài)孔和生產它們的方法。 所述兩個或多個部分可以是相同的或者是不同的。優(yōu)選地，所述第一部分是蛋白質，所述第二部分是蛋白質、核酸、報告基團、親和標簽或載體。所述兩個或多個部分可以任意構型連接。例如，如果它們是蛋白質，它們可通過其末端(即氨基或羧基末端)氨基酸連接。更優(yōu)選地，所述第一部分是核酸結合蛋白，第二部分是跨膜蛋白質孔。合適的構型包括但不局限于，所述核酸結合蛋白的氨基末端連接至所述跨膜蛋白質孔的羧基末端，反之亦然。或者，所述兩個組分可通過其序列中的氨基酸連接。例如，所述核酸結合蛋白可連接至所述部分的環(huán)區(qū)域中的一個或多個氨基酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸結合蛋白的末端氨基酸連接至所述部分的環(huán)區(qū)域中的一個或多個氨基酸。下文將描述末端氨基酸和環(huán)區(qū)域。如果所述第一部分是核酸結合蛋白，所述第二部分是跨膜蛋白質孔，則所述第一和第二基團優(yōu)選地與它們各自的部分相距0. 05nm至lOnm，更優(yōu)選地相距0. 05nm至5nm，最優(yōu)選地與它們各自的部分相距約0. Inm或3個核苷酸。如果所述第一部分是核酸結合蛋白， 所述第二部分是跨膜蛋白質孔，則所述偶聯(lián)的第一和第二部分之間的距離優(yōu)選地是0. Inm 至lOOnm，更優(yōu)選地是0. Inm至25nm，更優(yōu)選地是0. Inm至5nm，最優(yōu)選地是0. 5nm。為了達到部分之間約0. 5nm的距離，需要使所述連接的連接物以“頭對頭”方式排布。如果所述連接物以“頭對尾”的排布方式使用，則每個連接物中需要最少有5或6個核苷酸以提供充分的雜交。更短的連接物即使能雜交，也不能夠充分地雜交，因此只有使用不同的構型才能達到更短的部分-部分距離。在一個優(yōu)選的實施方案中，選擇所述共價連接的位點以使得當所述部分為孔時， 所述核酸結合蛋白會以這樣的方式處理靶核酸序列，即使得所述靶序列中的一部分核苷酸與所述孔相互作用。然后根據(jù)核苷酸影響所述相互作用期間流經所述孔的電流的不同方式，區(qū)分所述核苷酸。有很多可將所述孔用于對核酸分子測序的方法。一種方法涉及核酸外切酶例如脫氧核糖核酸酶的使用。在該方法中，所述核酸外切酶被用于從靶核酸鏈中連續(xù)分離核苷酸。 然后所述孔可按照所述核苷酸釋放的順序對其進行檢測和分辨，從而讀出原始鏈的序列。 對于這樣的實施方案，優(yōu)選將所述核酸外切酶連接至孔亞基，這樣使得從所述靶核酸上釋放的一部分核苷酸就能夠進入包含所述亞基的孔的桶狀體或通道，并且與其相互作用。優(yōu)選將所述核酸外切酶連接至所述亞基中緊密靠近形成所述孔的桶狀體或通道開口的亞基部分的位置。所述核酸外切酶更優(yōu)選地被連接至所述亞基，這樣使得其核苷酸出口軌道位置的取向就朝向形成所述孔的開口部分的亞基部分。對核酸測序的另一種方法包括將所述靶核酸推過或者拉過所述孔的酶與外加電勢的結合使用。在該方法中，離子電流隨著所述靶鏈中的核苷酸通過所述孔而波動。所述電流波動指示所述鏈的序列。對于這樣的實施方案，優(yōu)選將所述酶連接至孔亞基，這樣使得它就能夠將所述靶核酸推過或拉過包含所述亞基的孔的桶狀體或通道而不影響通過所述孔的離子電流。優(yōu)選地將所述酶連接至所述亞基中緊密靠近形成所述孔的桶狀體或通道的開口部分的亞基部分的位置。更優(yōu)選將所述酶連接至所述亞基使得其活性位點的取向朝向形成所述孔的開口部分的亞基部分。對核酸鏈測序的第三種方法是檢測緊密靠近孔檢測器的聚合酶的副產物。在該方法中，將核苷磷酸(核苷酸)標記，這樣使得向所述核苷酸鏈加入聚合酶后，磷酸標記的物質(phosphate labeled species)就會釋放出來，并且所述磷酸標記的物質會被所述孔檢測到。所述磷酸物質包含針對每種核苷酸特異性的標記。隨著核苷酸被順序地加入所述核酸鏈，可檢測到堿基添加的副產物。所述磷酸標記的物質被檢測到的順序可被用于確定所述核酸鏈的序列。所述核酸結合蛋白優(yōu)選地連接至孔或其亞基中形成所述孔順側(cis side)部分的部分。在電生理學中，所述順側按照慣例是接地的一側。如果溶血素孔被正確地插入電生理裝置中，則所述Cap區(qū)域位于順側。已知在正電勢下，核苷酸將從用于隨機傳感的孔的順側遷移至反側(trans side)。將所述核酸結合蛋白放置在孔的順側會使其能夠處理所述靶核酸，這樣使得所述序列中的一部分核苷酸能夠進入所述孔的桶狀體或通道并與其相互作用。優(yōu)選地，所述序列中至少20 %、至少40 %、至少50 %、至少80 %或至少90 %的核苷酸會進入所述孔的桶狀體或通道并與其相互作用。優(yōu)選地選擇共價連接的位點和方法，從而使得限制所述核酸結合蛋白的移動性。 這有助于確保所述蛋白質以這樣的方式處理所述靶核酸序列，即使所述靶序列中的一部分核苷酸與所述孔相互作用。例如，限制核酸結合蛋白移動的能力的含義是它的活性位點的取向可永久地朝向形成所述孔的桶狀體或通道的開口部分的亞基部分。可通過增加所述蛋白連接至所述部分的位點的數(shù)量并且/或者使用特異性的連接物來限制所述核酸結合蛋白的移動性。生物學活性部分一般以保持它們的生物活性的方式偶聯(lián)。可使用本領域中公知的方法來確定本文描述的任何部分的生物學活性。如果核酸結合蛋白和跨膜蛋白質孔被偶聯(lián)在一起，則這兩種蛋白質優(yōu)選地分別保持它們的結合特性和孔特性。如果一個或多個所述部分是蛋白質，可如要求美國申請No. 61/148，726的優(yōu)先權并與該申請同時提交的共同未決國際申請[J A Kemp & Co Ref :N. 106566A ；Oxford Nanopore Technologies Ref ONL IP 007]中所描述的，可從所述蛋白質中除去至少一個天然可及的半胱氨酸殘基。但是，所述蛋白質可包含一個或多個可及的半胱氨酸殘基，并且可通過這些殘基連接至其他部分。存在有限數(shù)量的可及半胱氨酸殘基使得可以控制部分之間的偶聯(lián)。半胱氨酸殘基的可離子化側鏈是用于進行加成反應的強效親核體，因此廣泛地被選用于生物綴合(bioconjugation)技術。但是，對于這些技術有效使用的一個常見障礙是存在于野生型蛋白質中的天然半胱氨酸殘基。對一個或多個所述天然半胱氨酸殘基的修飾可導致不明確的酶活性和不受控制的連接。本發(fā)明可涉及蛋白質部分的天然半胱氨酸殘基的定點誘變。可保留一個或多個所述可及的天然半胱氨酸，除去其他可及的天然半胱氨酸?；蛘撸沙ト靠杉暗陌腚装彼釟埢?，并向所述蛋白質引入一個或多個半胱氨酸殘基。特定的可及半胱氨酸殘基的存在便于所述結合蛋白與另一部分的連接，所述另一部分例如另一蛋白質、固體載體或化學試劑。天然半胱氨酸殘基的移除以及單個或多個半胱氨酸的靶向添加改進了之前的方法，因為它賦予控制偶聯(lián)的能力，同時還使得所述蛋白質彼此之間可能的相互作用最小化， 所述相互作用通過不需要的表面巰基形成二聚體、三聚體等。如果所述蛋白質僅在其結構中的預定位點處含有單個半胱氨酸殘基，那么該殘基的巰基基團能夠被用于與其他巰基基團形成直接的二硫鍵或者可通過反應活性連接物介導偶聯(lián)。這些被靶向的半胱氨酸殘基可確保只有需要數(shù)量的酶分子與需要數(shù)量的靶分子交聯(lián)，同時還賦予一定程度的有利構象， 這樣使得例如活性位點就能夠最優(yōu)地取向。存在于野生型蛋白質中的天然半胱氨酸殘基使得不能容易地使用包含巰基反應活性基團的特定連接物，例如馬來酰亞胺、碘乙酰胺或鄰-吡啶基-二硫化物 (ortho-pyridyl disulphide (OPSS))。與任意在結構和催化方面重要的半胱氨酸殘基反應的可能性能夠影響所述蛋白的活性，這對于用于單分子應用很重要。優(yōu)選使用用于生物綴合的連接物以確保一定的空間分離，這樣使得蛋白活性不因與另一個部分(例如蛋白質或表面)緊密接近而受到影響。核酸結合蛋白一種所述部分優(yōu)選地是核酸結合蛋白。這類蛋白的實例包括但不局限于核酸處理酶，例如核酸酶、聚合酶、拓撲異構酶、連接酶和解旋酶；和非催化的結合蛋白，例如由 SCOP(蛋白質的結構分類)分類在核酸結合蛋白超家族(50M9)下的那些。如上文所述和如要求美國申請No. 61/148，726的優(yōu)先權并與本申請同時提交的共同未決國際申請[J A Kemp & Co Ref :N. 106566A ；Oxford Nanopore Technologies Ref :0NL IP 007]中所述,將所述核酸處理酶修飾以去除并且/或者代替半胱氨酸殘基。優(yōu)選地從所述核酸結合蛋白中去除至少一個天然可及的半胱氨酸殘基。然而，所述核酸結合蛋白包含一個或多個可及的半胱氨酸殘基，并且通過這些殘基連接至另一部分。有限數(shù)量可及半胱氨酸殘基的存在使得可以控制與另一部分的連接。核酸是包含兩個或多個核苷酸的大分子。由蛋白質結合的核酸可包含任意核苷酸的任意組合。所述核苷酸可以是天然存在的或者是人造的。所述核苷酸可被氧化或者甲基化。核苷酸一般包含核堿基、糖和至少一個磷酸基團。所述核堿基一般是雜環(huán)的。核堿基包括但不局限于嘌呤和嘧啶，更具體地是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖一般是戊糖。核苷酸糖包括但不局限于核糖和脫氧核糖。所述核苷酸一般是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。所述核苷酸一般包含單磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可連接在核苷酸的5’或3’側。核苷酸包括但不限于單磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、 單磷酸鳥苷(GMP)、二磷酸鳥苷(GDP)、三磷酸鳥苷(GTP)、單磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷 (TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、單磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、單磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)單磷酸鳥苷(cGMP)、單磷酸脫氧腺苷(dAMP)、二磷酸脫氧腺苷(dADP)、三磷酸脫氧腺苷(dATP)、單磷酸脫氧鳥苷(dGMP)、二磷酸脫氧鳥苷(dGDP)、三磷酸脫氧鳥苷(dGTP)、單磷酸脫氧胸苷(dTMP)、二磷酸脫氧胸苷(dTDP)、三磷酸脫氧胸苷(dTTP)、單磷酸脫氧尿苷(dUMP)、二磷酸脫氧尿苷(dUDP)、三磷酸脫氧尿苷(dUTP)、單磷酸脫氧胞苷(dCMP)、二磷酸脫氧胞苷 (dCDP)和三磷酸脫氧胞苷(dCTP)。所述核苷酸優(yōu)選選自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、 dTMP、dGMP 或 dCMP。所述核酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。所述核酸可以是本領域中已知的任意合成的核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、蘇糖核酸(TNA)、鎖核酸 (LNA)或具有核苷酸側鏈的其他合成的聚合物。由蛋白質結合的核酸優(yōu)選地為單鏈的，例如 cDNA、RNA、GNA、TNA或LNA。由蛋白質結合的核酸優(yōu)選地是雙鏈的，例如DNA。結合單鏈核酸的蛋白質可被用于對雙鏈DNA測序，條件是所述雙鏈DNA在其被所述蛋白質結合之前解離為單鏈。優(yōu)選地，所述核酸結合蛋白的三級結構是已知的。所述結合蛋白的三維結構的知識可使得對所述蛋白質做出修飾以促進其在所述偶聯(lián)結構中的功能。所述蛋白質可具有任意大小和任意結構。例如，所述蛋白質可以是低聚體，例如二聚體或三聚體。所述蛋白質優(yōu)選地是由一個單體形成的小的球狀多肽。這樣的蛋白質容易處理并且干擾其他部分的可能性較小。例如，這樣的蛋白質干擾孔亞基的孔形成能力的可能性較小。還優(yōu)選地，所述蛋白質的活性位點的位置和功能是已知的。這可以防止對所述活性位點做出修飾可消除所述蛋白質活性的修飾。還允許所述蛋白質連接至其他部分，這樣使得所述蛋白質以特定的方式結合所述靶核酸序列。例如，如果所述蛋白質被連接于用于測序的跨膜蛋白質孔，則它使得靶序列中的一部分核苷酸與所述孔相互作用，如下文中所描述。在這樣的實施方案中，將所述蛋白質的活性位點設置在盡可能靠近所述孔通道的桶狀體的開口處并且使得所述蛋白質本身不會阻斷電流是有益的。關于其中蛋白質對核酸取向的方式的知識也使得可設計有效的偶聯(lián)結構?？赡鼙仨毤兓杀景l(fā)明所述方法產生的所述結構。優(yōu)選所述核酸結合蛋白能夠承受用于純化所述結構的條件。所述另一個部分可包含孔。這樣的孔可被用于對核酸測序。為了使所述靶核酸中的大部分核苷酸可通過隨機傳感被正確地鑒定，所述蛋白質優(yōu)選地在緩沖液背景下結合所述核酸，所述緩沖液背景適于所述核苷酸的辨別。所述蛋白質優(yōu)選地在遠超于正常生理水平的鹽濃度(例如IOOmM至2000mM)下至少具有殘余活性。更優(yōu)選地，將所述蛋白質修飾以增加其在高鹽濃度下的活性。還可對所述蛋白質修飾以提高其持續(xù)處理能力、穩(wěn)定性和保存期限?？筛鶕?jù)對來自嗜極微生物(extremphile)的核酸處理酶的表征以及改變嗜溫或嗜熱核酸外切酶的耐鹽性、穩(wěn)定性和溫度依賴性的定向進化方法來確定合適的修飾，所述嗜極微生物例如嗜鹽細菌、中度嗜鹽細菌，嗜熱生物和中度嗜熱生物。所述酶還優(yōu)選地在10°C至60°C的溫度(例如室溫)下保持至少部分活性。這使得可在多種溫度(包括室溫)下對核酸測序。所述核酸結合蛋白優(yōu)選地是核酸處理酶。核酸處理酶是能夠與核酸相互作用并且改變核酸的至少一個性質的多肽。所述酶可通過切割所述核酸以形成單個核苷酸或較短的核苷酸鏈(例如二核苷酸或三核苷酸)來修飾所述核酸。所述酶可通過對所述核酸取向或將其移動至特定位置來修飾所述核酸。所述核酸處理酶優(yōu)選地來自溶核酶。所述核酸處理酶更優(yōu)選地來自酶分類(EC) 組 3. 1. 11,3. 1. 13,3. 1. 14,3. 1. 15,3. 1. 16,3. 1. 21,3. 1. 22,3. 1. 25,3. 1. 26,3. 1. 27、 3. 1. 30和3. 1. 31中任一組的成員。所述核酸處理酶更優(yōu)選地基于以下酶中的任一種
1.11.-產生5'-磷酸單酯的脫氧核糖核酸外切酶。 1.11.1脫氧核糖核酸外切酶I。 1. 11.2脫氧核糖核酸外切酶III。 1. 11. 3脫氧核糖核酸外切酶(λ誘導的)。 1.11.4脫氧核糖核酸外切酶(噬菌體SP3誘導的)。 1. 11.5脫氧核糖核酸外切酶V。 1. 11. 6脫氧核糖核酸外切酶VII。
1.13.-產生5'-磷酸單酯的核糖核酸外切酶。 1. 13. 1核糖核酸外切酶II。 1. 13. 2核糖核酸外切酶H。 1. 13. 3寡核苷酸酶。 1. 13. 4Poly(A)_特異的核糖核酸酶。 1. 13. 5核糖核酸酶D。
1.14.-產生3'-磷酸單酯的核糖核酸外切酶。 1. 14. 1酵母核糖核酸酶。
1. 15.-產生5'-磷酸單酯的可作用于核糖核酸或脫氧核糖核酸的核酸外切 1. 15. 1 毒液核酸夕卜切酶(Venom exonuclease)。
1. 16.-產生3'-磷酸單酯的可作用于核糖核酸或脫氧核糖核酸的核酸外切酶。
0161] 30162]〇30163]〇30164]〇30165]〇30166]〇30167]〇30168] 30169]〇30170]〇30171]〇30172]〇30173]〇30174] 30175]〇30176] 3酶。O 3.·3.
〇 3. 1. 16. 1 脾臟核酸外切酶(Spleen exonuclease)。· 3. 1. 21.-產生5'-磷酸單酯的脫氧核糖核酸內切酶。〇3. 1.21. 1脫氧核糖核酸酶I。〇3. 1. 21. 2脫氧核糖核酸酶IV(噬菌體_TG)-誘導的)。〇3. 1. 21. 31型位點特異的脫氧核糖核酸酶。〇3. 1. 21. 411型位點特異的脫氧核糖核酸酶。〇3. 1. 21. 5III型位點特異的脫氧核糖核酸酶。〇3. 1. 21. 6CC-嗜性脫氧核糖核酸內切酶(CC-preferring endodeoxyribonuclease)。〇3. 1. 21. 7脫氧核糖核酸酶V。· 3. 1. 22.-不產生5'-磷酸單酯的脫氧核糖核酸內切酶。〇3. 1. 22. 1脫氧核糖核酸酶II。〇3. 1. 22. 2曲霉屬(Aspergillus)脫氧核糖核酸酶K(I)。〇 3. 1. 22. 3 轉向條目3. 1. 21. 7。〇3. 1. 22. 4交換型連接脫氧核糖核酸內切酶(Crossover junction endodeoxyribonuclease)。〇3. 1. 22. 5脫氧核糖核酸酶X?！?3. 1. 25.-特異性用于改變的堿基的位點特異的脫氧核糖核酸內切酶。〇3. 1. 25. 1脫氧核糖核酸酶(嘧啶二聚體)。〇 3. 1. 25. 2 轉向條目4. 2. 99. 18。·3. 1. .-產生5'-磷酸單酯的核糖核酸內切酶。〇3. 1.沈.1絨胞菌多聚腦磷脂核糖核酸酶(Wiysarum polycephalum ribonuclease)。〇3.1.26.2核_麵騰α ο
〇3.1.26.3核_麵騰 III。
〇3.1.26.4核_麵膽扎
〇3.1.26.5核_麵騰P。
〇3.1.26.6核_麵騰IV。
〇3.1.26.7核_麵騰Ρ4。
〇3.1.26.8核_麵^|Μ5。
〇3.1.26.9核_麵騰(poly-(U)-特異的)。
〇3.1.26.10核1翻脧酶IX。
〇3.1.26.11核1翻脧酶Z。
3.1.27.-不產生5‘-磷酸單酯的核糖核酸內切酶。
〇3.1.27.1核_麵!■τ⑵。
〇3.1.27.2枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)核糖核酸酶。
〇3.1.27.3核_麵!■τα)。
〇3.1.27.4核_麵!酶U⑵。
〇3.1.27.5胰核糖核酸酶。
〇 3. 1. 27. 6 腸桿菌屬核糖核酸酶(Enterobacter ribonuclease)。〇3. 1. 27. 7核糖核酸酶F。〇3. 1. 27. 8核糖核酸酶V。〇3. 1. 27. 9tRNA-內含子核酸內切酶。〇 3. 1. 27. IOrRNA 核酸內切酶。#3. 1.30.-產生5'-磷酸單酯的可作用于核糖核酸或脫氧核糖核酸的核糖核酸內切酶。〇3. 1.30. 1曲霉屬核酸酶S(I)。O 3. 1. 30. 2 粘質沙雷氏菌核酸酶(Serratia marcescens nuclease)?！?3. 1. 31.-產生3'-磷酸單酯的可作用于核糖或脫氧核糖的核糖核酸內切酶。3. 1. 31. 1 微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease)。所述酶最優(yōu)選地衍生自核酸外切酶，例如脫氧核糖核酸酶，其切斷核酸以形成個體核苷酸。脫氧核糖核酸外切酶的優(yōu)點在于它們可作用于單鏈和雙鏈DNA并且可從5’-3’ 或3’ -5’方向水解堿基。個體核苷酸是單個核苷酸。個體核苷酸是不與另一個核苷酸或核酸以任意鍵(例如磷酸二酯鍵)結合的核苷酸。磷酸二酯鍵包含結合在另一個核苷酸糖基團上的核苷酸磷酸基團之一。個體核苷酸一般是不與另一核酸序列以任意方式結合的核苷酸，所述另一核酸序列有至少5個、至少10個、至少20個、至少50個、至少100個、至少200個、至少500 個、至少1000個或至少5000個核苷酸。用于本發(fā)明的優(yōu)選的酶包括來自大腸桿菌的核酸外切酶I(SEQ ID N0:6)，來自大腸桿菌的核酸外切酶ΠΙ (SEQ ID NO :52)、來自嗜熱棲熱菌的RecJ(SEQ ID NO 54)和噬菌體λ核酸外切酶(SEQ ID NO 56)以及它們的變體。SEQ ID NO :56的三個相同亞基相互作用以形成三聚體核酸外切酶。所述酶最優(yōu)選地以來自大腸桿菌的核酸外切酶I (SEQ ID NO 6)為基礎。所述核酸處理酶優(yōu)選地衍生自包含SEQ ID NO =6,52,54和56所示序列中任一個或其變體的核酸外切酶。換言之，所述酶優(yōu)選地在如上文所述修飾其半胱氨酸前包含SEQ ID NO =6,52,54和56所示序列中任一個或其變體。SEQ ID NO =6,52,54或56的變體是具有與SEQ ID NO =6,52,54或56的氨基酸序列不同的氨基酸序列但是保持核酸處理能力的酶。所述變體處理核酸的能力可使用本領域中已知的任意方法來分析。例如，可如實施例中所描述的來測定變體處理核酸的能力。如實施例中所述，所述變體還必須保持其被表達的能力。所述變體可包括有助于處理所述核酸并且/或者促進其在高鹽濃度和/或室溫下的活性的修飾。所述酶可以是由生物體(例如由大腸桿菌)表達的天然存在的變體。變體還包括由重組技術產生的非天然存在的變體。在SEQ ID而6、5254或56的氨基酸序列全長中，基于氨基酸同一性，變體優(yōu)選地與該序列有至少50%的同源性。更優(yōu)選地，基于氨基酸同一性，所述變體多肽可與SEQ ID而6、52、討或56的氨基酸序列在全長序列上具有至少 55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、并且更優(yōu)選至少95%、97%或99%的同源性。在200或更多(例如230、250、270、280或者更多)個連續(xù)氨基酸的片段上有至少80%例(如至少日日^^卯^或日日1^)的氨基酸同一性(“硬同源性(hard homology)”)。可以用本領域中的標準方法來確定同源性。例如，UWGCG軟件包提供的BESTFIT 程序可以用于計算同源性(例如使用它的默認設置)(Devereux et al (1984)Nucleic Acids Research 12,387-395) 例如，如 Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) JMol Biol 215 :403-10 中所述，可以使用 PILEUP 和 BLAST 算法計算同源性或者對序列進行比對(例如鑒定等價殘基或對應序列(一般使用它們的默認設置))。進行BLAST分析的軟件公眾可以從美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。所述算法涉及到首先鑒別高打分序列對(HSP)，所述鑒別步驟通過如下方式實現(xiàn)鑒別查詢序列中長度為W的短字，所述短字就是在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比較時，能匹配或者滿足某些正值閾值分值T的字。T是指鄰近字分值閾值(Altschul et al，見上文)。將這些初始鄰近字匹配作為種子啟動檢索，以發(fā)現(xiàn)包含它們的HSP。在累積比對分值能夠增加期間， 在沿每條序列的兩個方向上進行字匹配延伸。字匹配在每個方向上的延伸停止的條件是 所述累積比對分值從其所達到的最大值下降X量；由于一個或多個負打分值殘基比對的累積，所述累積分值降到O或小于O ；或者達到任何一個序列的端點。所述BLAST算法的參數(shù) W、T和X決定了比對的敏感度和速度。所述BLAST程序使用的默認字段(W)為11，BL0SUM62 打分矩陣(見 Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919) 比對⑶為50，期望值(E)為10，M = 5，N = 4，并且是進行雙鏈比較。所述BLAST算法可進行兩個序列之間的相似性的統(tǒng)計分析；參見例如Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787。所述 BLAST 算法提供的一種相似性的量度是最小和概率(P(N))，所述最小和概率表示兩個氨基酸序列之間隨機出現(xiàn)匹配的概率。例如，如果一個序列與另一個序列比較中的最小和概率小于約1，優(yōu)選小于約0. 1， 更優(yōu)選小于約0. 01，并且最優(yōu)選小于約0. 001，那么所述第一序列被認為與所述第二序列相似。除了上文所描述的那些之外，還可以對SEQ ID NO :6、52、M或56的氨基酸序列做出氨基酸置換，例如，最多達1、2、3、4、5、10、20或30個置換。例如，可根據(jù)下表1做出保守
性置換。表1-保守性置換在第二列同一格，優(yōu)選在第三列同一行中的氨基酸可相互置換。
2權利要求
1.一種共價偶聯(lián)兩個或多個部分的方法，所述方法包括(a)提供第一部分，其上共價連接有(i)至少一個第一連接物，其包含第一可雜交區(qū)域；和(ii)至少一個能夠形成共價鍵的第一基團；(b)提供第二部分，其上共價連接有(i)至少一個第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域；和(ii)至少一個能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團；(c)在允許所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分的條件下使所述第一和第二部分接觸；并且(d)將所述連接的部分暴露于允許所述第一和第二基團之間形成共價鍵的條件。
2.權利要求1的方法，其中a)所述至少一個第一基團直接共價連接至所述第一部分，或者通過單獨的連接物連接至所述第一部分，并且/或者b)所述至少一個第二基團直接共價連接至所述第二部分，或者通過單獨的連接物連接至所述第二部分。
3.權利要求1的方法，其中所述至少一個第一基團通過所述第一連接物共價連接至所述第一部分，并且/或者所述至少一個第二基團通過所述第二連接物共價連接至所述第二部分。
4.權利要求1至3任一項的方法，其中所述第一部分共價連接有2、3或4個第一連接物，而所述第二部分連接有相應數(shù)目的第二連接物，并且其中所述連接物形成一個或多個第一和第二連接物的對，在所述連接物對中，每對中的可雜交區(qū)域相互特異性雜交，但不與其他連接物對中的任何可雜交區(qū)域雜交。
5.權利要求4的方法，其中所述方法包括(a)提供第一部分，其上共價連接有(i)第一連接物，其包含第一可雜交區(qū)域；( )能夠形成共價鍵的第一基團；(iii)包含第三可雜交區(qū)域的第三連接物；和(iv)能夠形成共價鍵的第三基團；(b)提供第二部分，其上共價連接有(i)第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域；(ii)能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團；(iii)第四連接物，其包含能夠與所述第三可雜交區(qū)域雜交的第四可雜交區(qū)域；和(iv)能夠與所述第三基團形成共價鍵的第四基團；(c)在允許所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交并允許所述第三和第四可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分的條件下使所述第一和第二部分接觸；并且(d)將所述連接的部分暴露于允許所述第一和第二基團之間和所述第三和第四基團之間形成共價鍵的條件。
6.權利要求1至3任一項的方法，其中所述第一部分共價連接有(i)包含第一可雜交區(qū)域的第一連接物，(ii)能夠形成共價鍵的第一基團，(iii)包含第三可雜交區(qū)域的第三連接物，和(iv)能夠形成共價鍵的第三基團；并且所述第二部分共價連接有(i)第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域和能夠與所述第三可雜交區(qū)域雜交的第四可雜交區(qū)域，(ii)能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團，和(iii)能夠與所述第三基團形成共價鍵的第四基團。
7.權利要求1的方法，其中所述方法包括偶聯(lián)3、4或5個部分，并且其中每個部分均共價連接有(i)至少一個連接物，其包含能夠與不同部分上的連接物的可雜交區(qū)域雜交的可雜交區(qū)域，和(ii)至少一個能夠與不同部分上的基團形成共價鍵的共價基團。
8.權利要求7的方法，其中所述方法包括a)提供第一部分，其共價連接有(i)包含第一可雜交區(qū)域的第一連接物，和(ii)能夠形成共價鍵的第一基團；b)提供第二部分，其共價連接有(i)第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域，和(ii)能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團，(iii)包含第三可雜交區(qū)域的第三連接物，和(iv)能夠形成共價鍵的第三基團；c)提供第三部分，其共價連接有(i)第四連接物，其包含能夠與所述第三可雜交區(qū)域雜交的第四可雜交區(qū)域，(ii)能夠與所述第三基團形成共價鍵的第四基團；d)在允許所述可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分的條件下使所述第一、第二和第三部分接觸；并且e)將所述連接的部分暴露于允許所述基團之間形成共價鍵的條件。
9.權利要求5至8任一項的方法，其中所述基團通過包含一個或多個可雜交區(qū)域的所述連接物共價連接至它們各自的部分。
10.前述權利要求任一項的方法，其中全部所述基團都不與自身反應。
11.前述權利要求任一項的方法，其中所述第一部分和/或所述第二部分是多肽、蛋白質、核酸、化學基團、染料、親和標簽、聚合物、小珠、抗體、載體、固定的金屬親和基質、谷胱甘肽瓊脂糖凝膠、糊精瓊脂糖凝膠、親和基質、IgG瓊脂糖凝膠、活化的巰基-瓊脂糖凝膠、 金屬膜、納米顆粒、玻璃、處理的玻璃、塑料、樹脂表面、固態(tài)納米孔、傳感器表面和單分子探測器。
12.權利要求11的方法，其中所述第一部分是蛋白質，所述第二部分是蛋白質、核酸、 報告基團、親和標簽或載體。
13.權利要求12的方法，其中所述第一部分是核酸結合蛋白，所述第二部分是跨膜蛋白質孔。
14.權利要求13的方法，其中所述核酸結合蛋白源自于核酸外切酶、核酸酶、聚合酶、 螺旋酶或拓撲異構酶。
15.權利要求14的方法，其中所述核酸外切酶包含SEQID NO 6或其變體中任一個所示的序列。
16.權利要求15的方法，其中所述核酸外切酶包含SEQID NO :6、52、54和56或其變體中任一個所示的序列。
17.權利要求13至16任一項的方法，其中所述跨膜蛋白質孔是α-溶血素(α-HL)。
18.權利要求17的方法，其中所述孔包含SEQID NO :2或4或其變體所示的序列。
19.權利要求13至18任一項的方法，其中所述第一和第二基團距離它們各自的部分 0. 05nm 至 10nm。
20.權利要求13至19任一項的方法，其中所述偶聯(lián)的第一和第二部分之間的距離為 0. Inm 至 500nm。
21.前述權利要求任一項的方法，其中所述第一和第二可雜交區(qū)域包含核酸。
22.權利要求21的方法，其中所述核酸長6至15個核苷酸。
23.前述權利要求任一項的方法，其中所述第一和第二可雜交區(qū)域在IpM至ImM的濃度下具有0. IfM至0. ΙμΜ的親和力。
24.前述權利要求任一項的方法，其中所述第一可雜交區(qū)域對應于來自SEQID Ν0:57 的5，末端的前15、25或35個核苷酸。
25.前述權利要求任一項的方法，其中所述第一和第二可雜交區(qū)域分別包含以下序列(a)SEQIDNO58和61所示的核苷酉堯序列；(b) SEQIDNO59和62所示的核苷酉堯序列；(c) SEQIDNO60和63所示的核苷酉堯序列；(d) SEQIDNO64和65所示的核苷酉堯序列；(e) SEQIDNO66和68所示的核苷酉堯序列；(f) SEQIDNO67和69所示的核苷酉堯序列；(g) SEQIDNO70和73所示的核苷酉堯序列；(h)SEQIDNO:71和74所示的核苷酉堯序列；(i)SEQIDNO72和75所示的核苷酉堯序列；(j)SEQIDNO76和77所示的核苷酉堯序列；或(k)SEQIDNO78和67所示的核苷酉I序列。
26.前述權利要求任一項的方法，其中所述第一和第二基團通過鏈接化學形成共價鍵。
27.權利要求沈的方法，其中所述第一基團是疊氮基團，第二基團是炔基團。
28.權利要求1至25任一項的方法，其中所述第一和第二基團形成二硫鍵、碘乙酰胺鍵或通過復分解反應形成的鍵。
29.使用前述權利要求任一項的方法偶聯(lián)的第一和第二部分。
30.使用權利要求1至觀任一項中所定義的第一和第二連接物偶聯(lián)至第二部分的第一部分。
31.權利要求1至觀任一項中所定義的第一和第二連接物的對。
32.權利要求31的連接物對用于將第一部分偶聯(lián)至第二部分的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種共價連接兩個或多個部分的方法，所述方法包括(a)提供第一部分，其上共價連接有(i)至少一個第一連接物，其包含第一可雜交區(qū)域；和(ii)至少一個能夠形成共價鍵的第一基團；(b)提供第二部分，其上共價連接有(i)至少一個第二連接物，其包含能夠與所述第一可雜交區(qū)域雜交的第二可雜交區(qū)域；和(ii)至少一個能夠與所述第一基團形成共價鍵的第二基團；(c)在允許所述第一和第二可雜交區(qū)域雜交并連接所述部分的條件下使所述第一和第二部分接觸；并且(d)將所述連接的部分暴露于允許在所述第一和第二基團之間形成共價鍵的條件。
文檔編號C12N15/11GK102439043SQ201080014472
公開日2012年5月2日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權日2009年1月30日
發(fā)明者J·克拉克, J·懷特, J·米爾頓, L·賈雅辛格, L·麥克尼爾, R·莫伊希 申請人:牛津納米孔技術有限公司