抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體，以及使用該單克隆抗體制備的藥物 組合物、試劑盒等應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉（porcineepidemicdiarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒 (porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一種腸道傳染病，主要引起哺乳仔豬嘔 吐、水樣腹瀉、脫水等癥狀，嚴(yán)重時可造成仔豬的死亡，死亡率能達(dá)到50 %-100 %。近年，自 2010年冬季，在我國的大部分地區(qū)爆發(fā)流行，之后相繼在韓國、日本、臺灣等地區(qū)也大范圍 爆發(fā)此病。2013年上半年在北美地區(qū)也爆發(fā)此病，并迅速傳播，給全球的養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重 的損失。
[0003] 目前，檢測豬流行性腹瀉病毒的方法包括病毒分離鑒定和血清檢查，但耗時過長； PCR方法雖然靈敏，但需昂貴的儀器和專業(yè)的操作人員。因而，現(xiàn)有技術(shù)中亟需研制一種簡 單、快速、準(zhǔn)確檢測豬流行性腹瀉病毒的產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了兩個抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體， 以及含單克隆抗體的試劑盒、藥物組合物及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合豬流行性腹瀉病毒的鼠單克隆抗體PEDV-McABl的可 變區(qū)序列，其中，1)重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)過 一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守性變異體;2)輕鏈可變區(qū) 氨基酸序列為SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)過一個或多個氨基酸添加、刪除、 替換或修飾保守性突變獲得的保守性變異體。
[0006] 本發(fā)明還涉及具有上述可變區(qū)序列的抗體或其片段，所述抗體或其片段仍保持特 異性結(jié)合豬流行性腹瀉病毒的能力。
[0007]本發(fā)明還涉及一種特異性結(jié)合豬流行性腹瀉病毒的鼠單克隆抗體PEDV-MCAB2的 可變區(qū)序列，其中，1)重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQIDNo.6所示的氨基酸序列或該序列經(jīng) 過一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守性變異體;2)輕鏈可變 區(qū)氨基酸序列為SEQIDNo.8所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)過一個或多個氨基酸添加、刪 除、替換或修飾保守性突變獲得的保守性變異體。
[0008] 本發(fā)明還涉及具有上述可變區(qū)序列的抗體或其片段，所述抗體或其片段仍保持特 異性結(jié)合豬流行性腹瀉病毒的能力。
[0009] 本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含免疫量的含有所述的 鼠單克隆抗體PEDV-McAB2的可變區(qū)序列的抗體或所述抗體的片段，以及藥學(xué)上可接受的載 體。
[0010] 本發(fā)明還涉及所述藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療豬流行性腹瀉病毒感染相關(guān) 疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括有效量的具有鼠單克隆抗體 PEDV-McAB1的可變區(qū)序列的抗體或所述抗體的片段，和/或有效量的具有鼠單克隆抗體 PEDV-McAB2的可變區(qū)序列的所述的抗體或所述抗體的片段，以及用于對豬流行性腹瀉病毒 進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測的檢測試劑、陰性對照、陽性對照。
[0012] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括有效量的具有鼠單克隆抗體 PEDV-McAB1的可變區(qū)序列的抗體或所述抗體的片段，和/或有效量的具有鼠單克隆抗體 PEDV-McAB2的可變區(qū)序列的抗體或所述抗體的片段，以及用于對豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行抗 原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測的檢測試劑、陰性對照、陽性對照，其中，所述用于對豬流行性腹瀉病 毒進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測的檢測試劑為與所述抗體或所述抗體的片段結(jié)合的酶標(biāo)二 抗以及與所述標(biāo)記的酶產(chǎn)生顏色反應(yīng)的底物，所述酶標(biāo)二抗包括酶標(biāo)羊抗鼠多抗、酶標(biāo)羊 抗鼠二抗。
[0013] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括有效量的所述單克隆抗體PEDV-McABl、有效量的所述單克隆抗體PEDV-McAB2，以及用于對豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行抗原抗體 反應(yīng)進(jìn)行檢測的檢測試劑;其中，所述試劑盒包括膠體金檢測試紙條，所述膠體金檢測試紙 條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有 濾紙、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述硝酸纖維素膜與金標(biāo)墊接觸或與樣品 墊、金標(biāo)墊接觸使得抗原與所述單克隆抗體PEDV-McAB2的結(jié)合體能在其上向底板第二端迀 移;所述金標(biāo)墊上含有膠體金標(biāo)記的所述單克隆抗體PEDV-McAB2,所述硝酸纖維素膜上近 所述底板第二端的位置包括一條檢測線和一條質(zhì)控線，所述檢測線上固定化有所述單克隆 抗體PEDV-McABl，所述質(zhì)控線上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0014] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括有效量的所述單克隆抗體PEDV-McABl、有效量的所述單克隆抗體PEDV-McAB2，以及用于對豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行抗原抗體 反應(yīng)進(jìn)行檢測的檢測試劑;其中，所述試劑盒包括緩沖液供應(yīng)單元和酶免疫層析檢測試紙 條;所述緩沖液供應(yīng)單元用于將緩沖液供給所述酶免疫層析檢測試紙條;所述酶免疫層析 檢測試紙條包括硝酸纖維素膜（1)，所述酶免疫層析檢測試紙條在縱向上依次包括底物供 應(yīng)區(qū)、樣品供應(yīng)區(qū)、檢測區(qū)；所述底物供應(yīng)區(qū)包括底物墊(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所 述底物墊(3)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述酶底物溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜（1)上 向距所述緩沖液供應(yīng)單元的遠(yuǎn)端迀移;所述樣品供應(yīng)區(qū)包括酶標(biāo)墊(2)，其上吸附有酶標(biāo)記 的所述單克隆抗體PEDV-McAB2,所述酶底物能與所述單克隆抗體PEDV-McAB2上標(biāo)記的酶產(chǎn) 生顯色反應(yīng)，所述酶標(biāo)墊（2)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述單克隆抗體PEDV-McAB2溶于緩 沖液中并在硝酸纖維素膜（1)上向距所述緩沖液供應(yīng)單元的遠(yuǎn)端迀移；以及所述檢測區(qū)固 定化有所述單克隆抗體PEDV-McABl;其中，所述緩沖液供應(yīng)單元包括展開液墊(5)、底物緩 沖液槽(8)、底物緩沖液(9)和緩沖液按鈕，所述底物緩沖液(9)放置于底物緩沖液槽(8)中， 所述緩沖液按鈕位于底物緩沖液槽(8)的上方，按下可將所述展開液墊(5)浸入緩沖液(9) 中；所述檢測區(qū)包括檢測線(6)、質(zhì)控線(7)，其中，所述質(zhì)控線(7)較檢測線(6)更遠(yuǎn)離所述 樣品供應(yīng)區(qū)，在所述檢測線(6)上固定化有所述單克隆抗體PEDV-McABl，在所述質(zhì)控線(7) 上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，且吸附在酶標(biāo)墊(2)上的酶標(biāo)記的所述單克隆抗體 PEDV-McAB2對于固定在檢測線(6)上的所述單克隆抗體PEDV-McAB1而言是過量的；所述硝 酸纖維素膜(1)全段粘附在所述支撐物（10)上，支撐物（10)連接所述緩沖液供應(yīng)單元，底物 供應(yīng)區(qū)，樣品供應(yīng)區(qū)，檢測區(qū)以及吸水墊(4)，所述吸水墊(4)在距所述緩沖液供應(yīng)單元的最 遠(yuǎn)端；以及檢測樣品（11)加入的位置為所述酶標(biāo)墊(2)的位置。
[0015] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括包被所述單克隆抗體PEDV-McABl的ELISA板、含酶標(biāo)記所述單克隆抗體PEDV-McAB2的反應(yīng)液、對豬流行性腹瀉病毒進(jìn) 行抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測的檢測試劑、陰性對照、陽性對照。
[0016] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括包被豬流行性腹瀉病毒抗原的 ELISA板、含所述單克隆抗體的反應(yīng)液、洗滌液、稀釋液、底物顯色液、終止液、陰性對照、陽 性對照;其中，含所述單克隆抗體的反應(yīng)液為含所述單克隆抗體PEDV-McAB1的反應(yīng)液、或含 所述單克隆抗體PEDV-McAB2的反應(yīng)液、或含所述單克隆抗體PEDV-McABl與所述單克隆抗體 PEDV-McAB2的混合反應(yīng)液。
[0017] 本發(fā)明還涉及所述試劑盒在用于非診斷目的的豬流行性腹瀉病毒檢測中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的有益效果:含本發(fā)明抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的試劑盒可用于非 診斷目的的豬流行性腹瀉病毒檢測中的應(yīng)用或者表位鑒定研究;含本發(fā)明抗豬流行性腹瀉 病毒單克隆抗體的藥物組合物可解決現(xiàn)有疫苗、母源抗體不足時所引發(fā)的仔豬豬流行性腹 瀉病毒感染的問題。
【附圖說明】
[0019] 圖1為SDS-PAGE凝膠電泳鑒定單克隆抗體PEDV-McABl和單克隆抗體PEDV-MCAB2的 純度，其中泳道1為蛋白Marker;泳道2為單克隆抗體PEDV-McABl，包括上端的重鏈和下端的 輕鏈，泳道3為單克隆抗體PEDV-McAB2，包括上端的重鏈和下端的輕鏈。
[0020] 圖2為酶免疫層析檢測試紙條的側(cè)向示意圖，圖中：（1)硝酸纖維素膜，（2)酶標(biāo)墊， (3)底物墊，（4)吸水墊，（5)展開液墊，（6)檢測線，（7)質(zhì)控線，（8)底物緩沖液槽，（9)底物緩 沖液，（1 〇)支撐物，（11)檢測樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下，對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。
[0022] 本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合豬流行性腹瀉病毒的鼠單克隆抗體PEDV-McABl的可 變區(qū)序列，其中，1)重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)過 一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守性變異體;2)輕鏈可變區(qū) 氨基酸序列為SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)過一個或多個氨基酸添加、刪除、 替換或修飾保守性突變獲得的保守性變異體。
[0023] 術(shù)語"豬流行性腹瀉病毒"（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)屬于冠狀 病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，為單股正鏈RNA病毒，易引起以嘔吐、 腹瀉、脫水、高死亡為特征的豬流行性腹瀉疾病。
[0024] 術(shù)語"單克隆抗體"是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組成該群體的抗體個 體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。因此，修飾語"單克隆"是指該抗體的性質(zhì)不 是離散抗體的混合物。優(yōu)選地，所述單克隆抗體包括單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合 抗體、人源化抗體以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。抗體為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因 子，因而，這個術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的。抗體 的實(shí)例是免疫球蛋白亞型（如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亞型亞類;也可以是包含抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1 ;和雙鏈抗體((1丨3130(1丨68)。融合至另一多肽的、包 含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達(dá)在 EP.A. 0120694和EP.A. 0125023中描述?？贵w可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn) 生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋 白可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū)（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)， 參見EP.A. 184187，GB2188638A或EP.A. 239400。還可以對雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì) 胞進(jìn)行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。用于本發(fā) 明的"單克隆抗體"也可用雜交瘤方法制得，因?yàn)榫幋a本發(fā)明鼠源化抗體的DNA序列可用本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用 PCR法擴(kuò)增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入合適 的表達(dá)載體中。最后，在適合本發(fā)明抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然后本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體?？贵w包含通過 二硫橋連接在一起的多肽鏈幾何體，稱為輕鏈和重鏈的兩條多肽主鏈構(gòu)成抗體的所有主要 結(jié)構(gòu)類別（同型物）。重鏈和輕鏈都進(jìn)一步可分為稱作可變區(qū)和恒定區(qū)的一些亞區(qū)。重鏈包 括單個的可變區(qū)和三個不同的恒定區(qū)，輕鏈則包括單個可變區(qū)（不同于