專利名稱：棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體及使用該轉(zhuǎn)化體的苯酚的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及苯酚生產(chǎn)技木。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及為了賦予苯酚生產(chǎn)功能而實(shí)施了特定基因操作的棒狀細(xì)菌的轉(zhuǎn)化體及使用該轉(zhuǎn)化體的高效的苯酚的制造方法。
背景技術(shù)：
在全球變暖和化石資源枯竭問題的背景下，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到以可再生資源為原料的化學(xué)品制造與生物燃料制造并列地作為新產(chǎn)業(yè)生物煉制而成為實(shí)現(xiàn)低碳社會(huì)的重要策略，并聚焦了廣泛的關(guān)注。但是，對(duì)于以可再生資源為原料的生物苯酚生產(chǎn)而言，與乳酸、こ醇的生產(chǎn)相比，從作為原料的糖類開始的代謝反應(yīng)階段非常多，因此生產(chǎn)率低，并且作為產(chǎn)物的苯酚會(huì)使細(xì)菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚產(chǎn)生的細(xì)胞毒性等，基于上述理由，目前還不能進(jìn)行エ業(yè)性的生產(chǎn)。作為苯酚的重要用途，可以列舉酚醛樹脂。酚醛樹脂是由苯酚與醛類的加成縮合反應(yīng)生成且在塑料中具有最古老歷史的樹脂，由于其優(yōu)良的耐熱性、耐久性等優(yōu)點(diǎn)，目前仍被用于汽車用金屬替代材料、半導(dǎo)體密封材料、電路基板等各種用途。另外，對(duì)于迄今為止的酚醛樹脂而言，由于原料苯酚與醛類的反應(yīng)性極高，所得到的高分子形成復(fù)雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此，難以實(shí)現(xiàn)聚合物的精密結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和在納米材料中的發(fā)展，從而認(rèn)為難以應(yīng)用于高附加價(jià)值的用途。但是近年來，隨著高分子的物性理論和仿真技術(shù)的快速發(fā)展，只要使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)精密化則能夠由酚醛樹脂創(chuàng)制高功能性材料。在這樣的背景下，日本的酚醛樹脂生產(chǎn)量正在逐年増加。目前的苯酚的エ業(yè)生產(chǎn)法(異丙苯法)是以石油來源的苯和丙烯作為原料、需要大量的溶劑類和大量的熱能的 、典型的化學(xué)エ業(yè)的高能耗型エ藝。因此，從保護(hù)地球環(huán)境和減少溫室效應(yīng)氣體的觀點(diǎn)出發(fā)，當(dāng)務(wù)之急是開發(fā)ニ氧化碳排放少的節(jié)能型的、能夠由可再生資源制造的、廢棄物排放低的環(huán)境和諧型エ藝，即建立生物苯酚制造技木。迄今為止尚未報(bào)道過自然界中的苯酚生產(chǎn)菌。作為利用基因重組菌的苯酚生產(chǎn)技術(shù)，可以列舉非專利文獻(xiàn)I。非專利文獻(xiàn)I的方法中，公開了下述技術(shù):制作向耐溶劑性菌惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)S12株中導(dǎo)入成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)來源的編碼酪氨酸酹解酶的tpl基因而得到的菌株和向惡臭假單胞菌S12株中導(dǎo)入惡臭假單胞菌S12株來源的編碼DAHP合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate(DAHP) synthase,3_ 脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合成酶)的aroF-1基因而得到的菌株來使用。另外，從向惡臭假單胞菌S12株中導(dǎo)入惡臭假單胞菌S12株來源的編碼DAHP合成酶的aroF-1基因而得到的菌株中獲取對(duì)苯丙氨酸和酪氨酸的類似物(代謝拮抗物質(zhì))即間氟-DL-苯丙氨酸(m-fluoro-DL-phenylalanine)具有抗性的菌株來使用。進(jìn)而，從該菌株中獲取對(duì)間氟-L-酪氨酸(m-fluoro-L-tyrosine)具有抗性的菌株來使用。然后，將這些菌株供于以葡萄糖為唯一碳源的需氧條件下的補(bǔ)料分批培養(yǎng)而生產(chǎn)苯酚。
但是，非專利文獻(xiàn)I的方法中，苯酚的生產(chǎn)率在實(shí)用上不充分?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I:Applied and Environmental Microbiolology, Vol.71, 2005, 8221-8227.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的課題在于提供能夠以糖類為原料高效地制造苯酚的微生物及使用該微生物、能夠以糖類為原料高效地制造苯酚的方法。用于解決問題的手段為了解決上述問題，本發(fā)明人反復(fù)進(jìn)行了研究，得到下述發(fā)現(xiàn)。(i)棒狀細(xì)菌對(duì)苯酚具有高耐性。(ii)向棒狀細(xì)菌中導(dǎo)入酪氨酸酚解酶基因而得到的轉(zhuǎn)化體高效地生產(chǎn)苯酚。(iii)該轉(zhuǎn)化體中，存在于宿主棒狀細(xì)菌的染色體上的預(yù)苯酸脫水酶基因和/或苯酚2-單加氧酶基因被破壞或發(fā)生缺陷吋，能夠更高效地生產(chǎn)苯酚。(iv)該轉(zhuǎn)化體中，DAHP合成酶基因和/或分支酸變位酶基因以比轉(zhuǎn)化前的宿主基因的表達(dá)水平高的水平進(jìn)行表達(dá)時(shí)，能夠更高效地生產(chǎn)苯酚。(V)該轉(zhuǎn)化體在還原條件下的反應(yīng)液中實(shí)質(zhì)上不增殖的狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，苯酚生產(chǎn)效率比在需氧性的反應(yīng)液中增殖并反應(yīng)時(shí)高。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的，其提供下述轉(zhuǎn)化體及苯酚的制造方法。第I項(xiàng).ー種具有苯酚生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體，其通過將編碼具有酪氨酸酚解酶(tyrosine phenol-lyase)活性的酶的基因?qū)胨拗靼魻罴?xì)菌而得到。第2項(xiàng).如第I項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因?yàn)槌蓤F(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)來源的基因、布氏朽1檬酸桿菌(Citrobacter braakii)來源的基因、哥本哈根脫亞硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)來源的基因、橙色綠屈接菌(Chloroflexus aurantiacus)來源的基因、點(diǎn)型念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc punctiforme)來源的基因或齒垢密螺旋體(Treponema denticola)來源的基因。第3項(xiàng).如第I項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因?yàn)橄率?a)或(b)的DNA，(a)由序列號(hào)36的堿基序列構(gòu)成的DNA、由序列號(hào)39的堿基序列構(gòu)成的DNA、由序列號(hào)42的堿基序列構(gòu)成的DNA、由序列號(hào)45的堿基序列構(gòu)成的DNA、由序列號(hào)48的堿基序列構(gòu)成的DNA或由序列號(hào)51的堿基序列構(gòu)成的DNA，(b)在嚴(yán)格的條件下與由(a)中任一個(gè)堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA雜交且編碼具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。

第4項(xiàng).如第I 3項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主棒狀細(xì)菌為存在于其染色體上的下述(c)和/或(d)的基因被破壞或發(fā)生缺陷的棒狀細(xì)菌，(c)編碼具有預(yù)苯酸脫水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因，(d)編碼具有苯酹2-單加氧酶(phenol2_monooxygenase)活性的酶的基因。
第5項(xiàng).如第I 4項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主棒狀細(xì)菌的下述(e)和/或(f)的代謝基因在宿主中高表達(dá)，(e)編碼具有 DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase，3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合成酶)活性的酶的基因，(f)編碼具有分支酸變位酶(chorismate mutase)活性的酶的基因。第6項(xiàng).如第I 5項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主棒狀細(xì)菌為谷氨酸棒桿菌。第7項(xiàng).如第6項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主谷氨酸棒桿菌為谷氨酸棒桿菌R(FERMP-18976)、ATCC13032 或 ATCC13869。第8項(xiàng).如第6項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主谷氨酸棒桿菌為存在于谷氨酸棒桿菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色體上的下述(c)和/或(d)的基因被破壞或發(fā)生缺陷的谷氨酸棒桿菌，(c)編碼具有預(yù)苯酸脫水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因，(d)編碼具有苯酹2-單加氧酶(phenol2_monooxygenase)活性的酶的基因。第9項(xiàng).如第6或8項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主谷氨酸棒桿菌為谷氨酸棒桿菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869中下述(e)和/或(f)的代謝基因高表達(dá)的谷氨酸棒桿菌，(e)編碼具有 DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase)活性的酶的基因，(f)編碼具有分支酸變位酶(chorismate mutase)活性的酶的基因。第10項(xiàng).谷氨酸棒桿菌PHE7 (保藏編號(hào):NITE BP-976)轉(zhuǎn)化體。第11項(xiàng).一種苯酚的制造方法，其中，包括如下步驟:使第I 10項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體在還原條件下、在含有糖類的反應(yīng)液中反應(yīng)；以及回收反應(yīng)液中的苯酹。第12項(xiàng).如第11項(xiàng)所述的苯酚的制造方法，其中，在反應(yīng)步驟中，轉(zhuǎn)化體實(shí)質(zhì)上不增殖。第13項(xiàng).如第11或12項(xiàng)所述的苯酚的制造方法，其中，還原條件下的反應(yīng)液的氧化還原電位為-200 -500毫伏。第14項(xiàng).如第11 13項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的苯酚的制造方法，其中，糖類為選自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、海藻糖和甘露糖醇組成的組中的糖。發(fā)明效果通過使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，與現(xiàn)有公知的轉(zhuǎn)化體相比，能夠由糖類高效率地制造苯酚。一般而言，微生物的增殖會(huì)因苯酚這樣的溶劑的細(xì)胞毒性而受到抑制，因此，難以使用微生物來制造苯酚，但根據(jù)本發(fā)明方法，能夠使用微生物以實(shí)用上足夠良好的效率來制造苯酹。


圖1是表示苯酚對(duì)各種微生物在需氧條件下的增殖的影響的圖。
圖2是表示苯酚對(duì)棒狀桿菌在還原條件下的糖消耗的影響的圖。圖3是實(shí)施例中使用的各種質(zhì)粒的構(gòu)建圖。圖4是實(shí)施例中使用的各種質(zhì)粒的構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。(I)具有苯酚生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體本發(fā)明的具有苯酚生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體為將編碼具有酪氨酸酚解酶(tyrosinephenol-lyase)活性的酶的基因?qū)胨拗靼魻罴?xì)菌而得到的轉(zhuǎn)化體。宿豐棒狀細(xì)菌是BargeysManual of Determinative Bacteriology(伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè))，Vol.8，599 (1974)中定義的一組微生物，只要是在通常的需氧條件下增殖的棒狀細(xì)菌則沒有特別限定。如果列舉具體例，可以列舉棒狀桿菌屬菌、短桿菌屬菌、節(jié)桿菌屬菌、分枝桿菌屬菌、微球菌屬菌等。棒狀細(xì)菌中，優(yōu)選棒狀桿菌屬菌。作為棒狀桿菌屬菌，可以列舉谷氨酸棒桿菌、有效棒桿菌(Corynebacteriumefficiens)> 產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐鹽棒桿菌(Corynebacterium halotolerance)、角軍燒棒桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。其中，從安全且苯酚生產(chǎn)率高的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌。作為優(yōu)選的菌株，可以列舉:谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) R 株(FERM P-18976)、ATCC13032 株、ATCC13869 株、ATCC13058 株、ATCC13059 株、ATCC13060 株、ATCC13232 株、ATCC13286 株、ATCC13287 株、ATCC13655 株、ATCC13745 株、ATCC13746 株、ATCC13761 株、ATCC14020 株、ATCC31831 株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)等。其中，優(yōu)選 R 株(FERM P-18976) ,ATCC13032 株、ATCC13869 株。 另外,根據(jù)分子生物學(xué)的分類,黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短桿菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒桿菌(Corynebacterium lilium)等棒狀細(xì)菌的菌名也統(tǒng)一在谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl, ff.et al.,Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T, “Brevibacterium flavum” DSM20411，“Brevibacteriumlactofermentum，，DSM20412and DSM1412, and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.1nt J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，駒形和男等，棒狀細(xì)菌的分類，發(fā)酵與工業(yè)，45:944-963 (1987)]。舊分類的乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC13869株、黃色短桿菌的MJ-233株(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41株(FERM BP-1498)等也是優(yōu)選的谷氨酸棒桿菌。作為短桿菌屬菌，可以列舉產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872 株)等。作為節(jié)桿菌屬菌，可以列舉球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010 株、ATCC4336 株、ATCC21056 株、ATCC31250 株、ATCC31738 株、ATCC35698 株)等。作為分枝桿菌屬菌，可以列舉牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210 株、ATCC27289 株)等。
作為微球菌屬菌，可以列舉弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如 N0.239 株(FERM P-13221))、藤黃微球菌(Micrococcus Ieuteus)(例如 N0.240 株(FERM P-13222))、服微球菌(Micrococcus ureae)(例如 IAM1010 株)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(例如 IF03764 株)等。另外，除了野生株以外，棒狀細(xì)菌也可以是其突變株或人工的基因重組體。可以列舉例如乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、蘋果酸脫氧酶(malate dehydrogenase)等的基因的破壞株。通過使用這種基因破壞株作為宿主，能夠提高苯酚的生產(chǎn)率或抑制副產(chǎn)物的生成。其中，優(yōu)選乳酸脫氫酶基因的破壞株。該基因破壞株中，乳酸脫氫酶基因被破壞，由此使丙酮酸至乳酸的代謝途徑被阻斷。其中，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌的乳酸脫氫酶基因的破壞株，特別是谷氨酸棒桿菌R(FERM P-18976)株的乳酸脫氫酶基因的破壞株。這種基因破壞株可以通過基因工程的方法按照常規(guī)方法來制作。例如，W02005/010182A1中記載了乳酸脫氫酶破壞株及其制作方法。酪氨酸酚解酶基因(tpl)酪氨酸酚解酶為催化下述兩個(gè)反應(yīng)的酶。酪氨酸+H2Oe苯酚+丙酮酸+NH3
兒茶酚 + 丙酮酸 +NH3 — L-D0PA+H20編碼具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因的來源沒有特別限定，優(yōu)選成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)來源的基因、布氏朽1檬酸桿菌(Citrobacter braakii)來源的基因、哥本哈根脫亞硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)來源的基因、橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurantiacus)來源的基因、點(diǎn)型念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc punctiforme)來源的基因、齒垢密螺旋體(Trep onema denticola)來源的基因。其中，優(yōu)選成團(tuán)泛菌來源的基因、布氏檸檬酸桿菌來源的基因或哥本哈根脫亞硫酸菌來源的基因，更優(yōu)選布氏檸檬酸桿菌來源的基因。作為成團(tuán)泛菌來源的酪氨酸酚解酶基因，可以列舉由序列號(hào)36的堿基序列構(gòu)成的DNA，作為布氏檸檬酸桿菌來源的酪氨酸酚解酶基因，可以列舉由序列號(hào)39的堿基序列構(gòu)成的DNA，作為哥本哈根脫亞硫酸菌來源的酪氨酸酚解酶基因，可以列舉由序列號(hào)42的堿基序列構(gòu)成的DNA，作為橙色綠屈撓菌來源的酪氨酸酚解酶基因，可以列舉由序列號(hào)45的堿基序列構(gòu)成的DNA，作為點(diǎn)型念珠藍(lán)細(xì)菌來源的酪氨酸酚解酶基因，可以列舉由序列號(hào)48的堿基序列構(gòu)成的DNA，作為齒垢密螺旋體來源的酪氨酸酚解酶基因，可以列舉由序列號(hào)51的堿基序列構(gòu)成的DNA。另外，本發(fā)明中，也可以使用在嚴(yán)格的條件下與由序列號(hào)36、39、42、45、48或51的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA雜交且編碼具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。本發(fā)明中，“嚴(yán)格的條件”是指一般的條件、例如Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)，第二版，1989，Vol2, pll.45中記載的條件。具體而言,是指在比完全雜交的解鏈溫度(Tm)低5 10°C的溫度下發(fā)生雜交的情況。酪氨酸酚解酶活性可以利用后述的實(shí)施例3中記載的方法測(cè)定。另外，本發(fā)明中，也可以使用由與序列號(hào)36、39、42、45、48或51的堿基序列具有90%以上的同一性、優(yōu)選具有95%以上的同一性、更優(yōu)選具有98%以上的同一性的堿基序列構(gòu)成且編碼具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。堿基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式會(huì)社七^ r ^ ^ ^制造)算出的值。由序列號(hào)36、39、42、45、48或51的堿基序列構(gòu)成的DNA的同源物可以通過例如使用基于這些堿基序列按照常規(guī)方法設(shè)計(jì)的引物或探針的PCR或雜交由其他生物種的DNA文庫中選擇，由此以高概率得到編碼具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。用于轉(zhuǎn)化的載體的構(gòu)建將通過PCR擴(kuò)增得到的編碼酪氨酸酚解酶的DNA克隆到能夠在宿主中擴(kuò)增的適當(dāng)?shù)妮d體中即可。作為質(zhì)粒載體，只要是包含在棒狀細(xì)菌內(nèi)擔(dān)負(fù)自主復(fù)制功能的基因的質(zhì)粒載體即可。作為其具體例，可以列舉:乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum) 2256來源的 pAM330[日本特開昭 58-67699]、[Miwaj K.et al.,Cryptic plasmids inglutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和[Yamaguchi，R.et al.，Determination of the complete nucleotide sequence ofthe Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330and the analysis of itsgenetic information.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267(1985)]、谷氨酸棒桿菌 ATCC13058 來源的 pHM1519[Miwa，K.et al.,Cryptic plasmids in glutamicacid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和pCRY30 [Kurusu，Y.et al.，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.App1.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒桿菌 T250 來源的 pCG4[日本特開昭 57-1837 99]、[Katsumata, R.et al., Protoplast transformation ofglutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAGl、pAG3、pAG14、pAG50 [日本特開昭 62-166890]、pEKO、pEC5、pEKExl [Eikmanns，B.J.etal., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors forcloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene, 102:93-98(1991)]
坐寸ο作為優(yōu)選的啟動(dòng)子，可以列舉谷氨酸棒桿菌R來源的甘油醛-3-磷酸脫氫酶A基因(gapA)的啟動(dòng)子PgapA、蘋果酸脫氫酶基因(mdh)的啟動(dòng)子Pmdh、乳酸脫氫酶A基因(IdhA)的啟動(dòng)子PldhA等,其中，優(yōu)選PgapA。作為優(yōu)選的終止子，可以列舉大腸桿菌rRNA操縱子的rrnB T1T2終止子、大腸桿菌的trpA終止子、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp終止子等，其中，優(yōu)選rrnB TIT2終止子。MiL轉(zhuǎn)化方法可以沒有限制地使用公知的方法。作為這樣的公知的方法，可以列舉例如氯化鈣/氯化銣法、磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔法等。其中，對(duì)于棒狀細(xì)菌優(yōu)選電脈沖法，電 脈沖法可以通過公知的方法[Kurusu, Y.et al.，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447 (1990)]和[Vertes A.A.etal., Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]進(jìn)行。轉(zhuǎn)化體使用微生物的培養(yǎng)中通常使用的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)即可。作為該培養(yǎng)基，通常可以使用含有碳源、氮源、無機(jī)鹽類及其他營養(yǎng)物質(zhì)等的天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基等。作為碳源，可以列舉:葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖質(zhì)或糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來酸或葡糖酸等有機(jī)酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，還可以根據(jù)期望使用正鏈烷烴等烴等。碳源可以單獨(dú)使用一種或者兩種以上混合使用。培養(yǎng)基中的這些碳源的濃度通常設(shè)定為約0.1 約10 (w/v%)即可。作為氮源，可以列舉:氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨等無機(jī)銨化合物或有機(jī)銨化合物、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸鉀等。另外，也可以使用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解物、氨基酸等含氮有機(jī)化合物等。氮源可以單獨(dú)使用一種或者兩種以上混合使用。培養(yǎng)基中的氮源濃度因使用的氮化合物而異，通常設(shè)定為約0.1 約10(w/v%)即可。作為無機(jī)鹽類，可以列舉例如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷或碳酸鈣等。這些無機(jī)鹽可以單獨(dú)使用一種或者兩種以上混合使用。培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽類濃度因使用的無機(jī)鹽而異，通常設(shè)定為約0.01 約I (w/v%)即可。作為營養(yǎng)物質(zhì)，可以列舉例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸水解物或者動(dòng)植物或微生物菌體的提取物或它們的分解物等。營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基濃度因使用的營養(yǎng)物質(zhì)而異，通常設(shè)定為約0.1 約10(w/v%)即可。另外，還可以根據(jù)需要添加維生素類。作為維生素類，可以列舉例如生物素、硫胺素(維生素BI)、吡哆醇(維生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選約5 約8。作為優(yōu)選的微生物培養(yǎng)培養(yǎng)基，可以列舉A培養(yǎng)基[Inui, M.et al., Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培養(yǎng)基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutami cum glyceraldehyde — 3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite, ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]
坐寸ο培養(yǎng)溫度設(shè)定為約15°C 約45°C即可，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為約I天 約7天即可。宿主染色體基因的破壞或缺失宿主棒狀細(xì)菌中，優(yōu)選存在于其染色體上的編碼具有預(yù)苯酸脫水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因(pheA)和/或編碼具有苯酹2_單加氧酶(phenol2-monooxygenase)活性的酶的基因(poxF)被破壞或發(fā)生缺失，由此能夠更高效地制造苯酹。更優(yōu)選pheA和poxF均被破壞或均發(fā)生缺失。制作以使基因的部分序列缺失而不產(chǎn)生正常發(fā)揮功能的酶蛋白的方式進(jìn)行改變后的缺失型基因，利用包含該基因的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，在缺失型基因與染色體上的基因之間引起同源重組，由此能夠?qū)⑷旧w上的基 因置換成缺失型或破壞型的基因。由缺失型或破壞型的基因編碼的酶蛋白即使生成也具有與野生型酶蛋白不同的立體結(jié)構(gòu)，功能降低或消失。由這種利用同源重組的基因置換所致的基因缺失或破壞方法已經(jīng)確立，有:使用包含溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒、能夠進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法；利用在宿主內(nèi)不具有復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體的方法等(美國專利第6303383號(hào)、日本特開平05-007491號(hào))。具體而言，通過實(shí)施例2的項(xiàng)目中記載的方法，能夠得到預(yù)苯酸脫水酶基因、苯酚2-單加氧酶基因被破壞或缺失的棒狀細(xì)菌。代謝基因的_表達(dá)宿主棒狀細(xì)菌中，優(yōu)選DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase)基因(aroG)和 / 或分支酸變位酶(chorismate mutase)基因(csm)以比宿主本來的水平、即野生型宿主的水平高的水平進(jìn)行表達(dá)。該高表達(dá)通過增加利用轉(zhuǎn)化的基因?qū)牖蛩拗魅旧w上的基因的拷貝數(shù)來實(shí)現(xiàn)。更優(yōu)選aroG和csm均進(jìn)行高表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行說明，導(dǎo)入的DAHP合成酶基因和分支酸變位酶基因可以是與宿主的基因相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的DAHP合成酶基因和分支酸變位酶基因，也可以是其他的DAHP合成酶基因和分支酸變位酶基因。優(yōu)選導(dǎo)入與宿主的基因相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的DAHP合成酶基因和/或分支酸變位酶基因。例如，作為谷氨酸棒桿菌來源的DAHP合成酶基因，可以列舉由序列號(hào)30的堿基序列構(gòu)成的DNA，作為谷氨酸棒桿菌來源的分支酸變位酶基因，可以列舉由序列號(hào)31的堿基序列構(gòu)成的DNA。作為其他的棒狀細(xì)菌的DHAP合成酶基因，有:有效棒桿菌(Corynebacteriumefficiens)來源的基因(序列號(hào)62，日本DNA數(shù)據(jù)庫:CE2073)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)來源的基因(序列號(hào)63,日本DNA數(shù)據(jù)庫:MSMEG_4244)、混池紅球菌(Rhodococcus opacus)來源的基因(序列號(hào)64,日本DNA數(shù)據(jù)庫:R0P_08400)等，作為分支酸變位酶基因，有:有效棒桿菌來源的基因(序列號(hào)65，日本DNA數(shù)據(jù)庫:CE0929)、恥垢分枝桿菌來源的基因(序列號(hào)66，日本DNA數(shù)據(jù)庫:MSMEG_5536)、混濁紅球菌來源的基因(序列號(hào)67，日本DNA數(shù)據(jù)庫:R0P_56380)等。另外，關(guān)于DAHP合成酶基因或分支酸變位酶基因，“實(shí)質(zhì)上相同的基因”可以列舉編碼與該基因所編碼的多肽的氨基酸序列具有90%以上的同一性、優(yōu)選具有95%以上的同一性、更優(yōu)選具有98%以上的同一性且具有DAHP合成酶活性或分支酸變位酶活性的多肽的DNA。另外，關(guān)于DAHP合成酶基因或分支酸變位酶基因，“實(shí)質(zhì)上相同的基因”可以列舉與該基因具有90%以上的同一性、優(yōu)選具有95%以上的同一性、更優(yōu)選具有98%以上的同一性且編碼具有DAHP合成酶活性或分支酸變位酶活性的多肽的DNA。
DAHP合成酶活性的有無可以通過以磷酸烯醇式丙酮酸和赤藻糖-4-磷酸為底物進(jìn)行反應(yīng)并利用使用硫代巴比妥酸的顯色法對(duì)生成的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)進(jìn)行定量(Appl.Environ.Microbiol., 74:5497-5503 (2008).)來檢測(cè)。另外，對(duì)于分支酸變位酶活性的有無，可以在以分支酸為底物進(jìn)行反應(yīng)后，利用終濃度為0.67Ν的鹽酸將生成的預(yù)苯酸(prephenate)轉(zhuǎn)換為苯丙酮酸(phenylpyruvate)(溫育約10分鐘)，然后基于320nm的吸光度增加(苯丙酮酸的生成)進(jìn)行檢測(cè)(Microbiology.，155，3382-3391 (2009).)。對(duì)提高宿主染色體上的DAHP合成酶基因或分支酸變位酶基因的拷貝數(shù)的方法進(jìn)行說明，只要以多拷貝在棒狀細(xì)菌的染色體DNA上導(dǎo)入這些基因即可。為了在微生物的染色體DNA上以多拷貝導(dǎo)入基因，可以利用以多拷貝存在于染色體DNA上的序列作為標(biāo)靶，并利用同源重組法(Experiments in Molecular Genetics (分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn))，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1972))進(jìn)行。作為以多拷貝存在于染色體DNA上的序列，可以利用重復(fù)DNA、存在于轉(zhuǎn)移因子的端部的反向重復(fù)序列。另外，也可以如日本特開平2-109985號(hào)公報(bào)中公開的那樣，使目的基因與轉(zhuǎn)座子一同發(fā)生轉(zhuǎn)移而以多拷貝導(dǎo)入到染色體DNA上。此外，還可以通過使用Mu噬菌體的方法(日本特開平2-109985號(hào))將目的基因重組到宿主染色體中。另外，也可以通過將棒狀細(xì)菌的染色體上的DAHP合成酶基因和/或分支酸變位酶基因的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)換成更強(qiáng)的表達(dá)調(diào)節(jié)序列來提聞這些基因的表達(dá)。例如，作為強(qiáng)啟動(dòng)子，已知tac啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子等。另外，也可以如國際公開W000/18935中公開的那樣，向基因的啟動(dòng)子區(qū)導(dǎo)入數(shù)個(gè)堿基的堿基置換而將其改變成更強(qiáng)的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子強(qiáng)度的評(píng)價(jià)方法和強(qiáng)啟動(dòng)子的例子記載在Goldstein等的論文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev., 1995, I, 105-128)等中。表達(dá)調(diào)節(jié)序列的置換例如可以與使用溫度敏感性質(zhì)粒的基因置換同樣地進(jìn)行。此外，已知核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)與起始密碼子之間的間隔區(qū)、特別是緊靠起始密碼子的上游的序列中的數(shù)個(gè)核苷酸的置換會(huì)給mRNA的翻譯效率帶來非常大的影響，通過改變這些序列，也能夠提高翻譯量。作為進(jìn)行上述基因置換的方法，例如有使用包含溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒、能夠進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法；利用在宿主內(nèi)不具有復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體的方法等(美國專利第6303383號(hào)說明書或日本特開平05-007491號(hào)公報(bào))。(II)苯酷的制造方 法可以通過包括使上述說明過的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體在還原條件下、在含有糖類的反應(yīng)液中反應(yīng)的步驟以及回收反應(yīng)液中的苯酚的步驟的方法來制造苯酚。微牛物的增葙在反應(yīng)之前，優(yōu)選將轉(zhuǎn)化體在需氧條件下在約25°C 約38°C的溫度下培養(yǎng)約12小時(shí) 約48小時(shí)而使其增殖。培養(yǎng)用培養(yǎng)基反應(yīng)之前的轉(zhuǎn)化體的需氧培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基可以使用含有碳源、氮源、無機(jī)鹽類及其他營養(yǎng)物質(zhì)等的天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基。作為碳源，也可以使用:糖類(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等單糖；蔗糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等);甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來酸、葡糖酸等有機(jī)酸；乙醇、丙醇等醇；正鏈烷烴等烴等。碳源可以單獨(dú)使用一種或者兩種以上混合使用。作為氮源，可以使用氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨等無機(jī)銨或有機(jī)銨化合物、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸鉀等。另外，也可以使用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解物、氨基酸等含氮有機(jī)化合物等。氮源可以單獨(dú)使用一種或者兩種以上混合使用。氮源在培養(yǎng)基中的濃度因使用的氮化合物而異，通常設(shè)定為約0.1 約10(w/v%)即可。作為無機(jī)鹽類，可以列舉磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷、碳酸鈣等。無機(jī)鹽可以單獨(dú)使用一種或者兩種以上混合使用。無機(jī)鹽類在培養(yǎng)基中的濃度因使用的無機(jī)鹽而異，通常設(shè)定為約0.0l 約I (w/v%)即可。作為營養(yǎng)物質(zhì)，可以列舉肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸水解物、動(dòng)植物或微生物菌體的提取物或它們的分解物等。營養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度因使用的營養(yǎng)物質(zhì)而異，通常設(shè)定為約0.1 約10(w/v%)即可。還可以根據(jù)需要進(jìn)一步添加維生素類。作為維生素類，可以列舉生物素、硫胺素(維生素BI)、吡哆醇(維生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選約6 約8。作為具體的優(yōu)選的棒狀細(xì)菌用培養(yǎng)基，可以列舉A培養(yǎng)基[Inui，M.etal.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate andsuccinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培養(yǎng)基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。這些培養(yǎng)基中，使糖類濃度在上述范圍內(nèi)來使用即可。反應(yīng)液作為反應(yīng)液，可以使用含有碳源、氮源、無機(jī)鹽類及其他營養(yǎng)物質(zhì)等的天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基。作為碳源，使用糖類。作為糖類，可以列舉葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等單糖；蔗糖、麥芽 糖、乳糖、纖維二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等。其中，優(yōu)選單糖，更優(yōu)選葡萄糖。作為碳源，除了可以使用糖類以外，也可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來酸、葡糖酸等有機(jī)酸；乙醇、丙醇等醇；正鏈烷烴
寸工寸ο碳源可以單獨(dú)使用一種或者兩種以上混合使用。反應(yīng)液中的糖類的濃度優(yōu)選約I 約20 (w/v%),更優(yōu)選約2 約10 (w/v%),進(jìn)一步優(yōu)選約2 約5 (w/v%)。另外，包括糖類在內(nèi)的全部碳源在反應(yīng)液中的濃度通常設(shè)定為約2 約5(w/v%)即可。作為氮源，可以使用氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨等無機(jī)銨或有機(jī)銨化合物、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸鉀等。另外，也可以使用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解物、氨基酸等含氮有機(jī)化合物等。氮源可以單獨(dú)使用一種或者兩種以上混合使用。氮源在反應(yīng)液中的濃度因使用的氮化合物而異，通常設(shè)定為約0.1 約10(w/v%)即可。作為無機(jī)鹽類，可以列舉磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷、碳酸鈣等。無機(jī)鹽可以單獨(dú)使用一種或者兩種以上混合使用。無機(jī)鹽類在反應(yīng)液中的濃度因使用的無機(jī)鹽而異，通常設(shè)定為約0.01 約l(w/v%)即可。作為營養(yǎng)物質(zhì)，可以列舉肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸水解物、動(dòng)植物或微生物菌體的提取物或它們的分解物等。營養(yǎng)物質(zhì)在反應(yīng)液中的濃度因使用的營養(yǎng)物質(zhì)而異，通常設(shè)定為約0.1 約10(w/v%)即可。還可以根據(jù)需要進(jìn)一步添加維生素類。作為維生素類，可以列舉生物素、硫胺素(維生素BI)、吡哆醇(維生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。反應(yīng)液的pH優(yōu)選約6 約8。作為具體的優(yōu)選的棒狀細(xì)菌用培養(yǎng)基，可以列舉前述的A培養(yǎng)基、BT培養(yǎng)基等。這些培養(yǎng)基中，使糖類濃度在上述范圍內(nèi)來使用即可。反應(yīng)條件反應(yīng)溫度即轉(zhuǎn)化體的存活溫度優(yōu)選約20°C 約50°C，更優(yōu)選約25°C 約47°C。如果為上述溫度范圍，則能夠高效地制造苯酚。另外，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選約I天 約7天，更優(yōu)選約I天 約3天。培養(yǎng)可以是分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)中的任何一種。其中，優(yōu)選分批培養(yǎng)。反應(yīng)可以在需氧條件下進(jìn)行，也可以在還原條件下進(jìn)行。<還原備件>在還原條件下，棒狀細(xì)菌實(shí)質(zhì)上不增殖，因而能夠更高效地生產(chǎn)苯酚。還原條件由反應(yīng)液的氧化還原電位規(guī)定。反應(yīng)液的氧化還原電位優(yōu)選約-200mV 約-500mV，更優(yōu)選約_250mV 約_500mV。反應(yīng)液的還原狀態(tài)可以利用刃天青指示劑(在還原狀態(tài)下由藍(lán)色脫色為無色)簡單地推測(cè)，使用氧化還原電位差計(jì)(例如，BROADLEY JAMES公司制造，ORP電極)可以準(zhǔn)確地測(cè)定。處于還原條件下的反應(yīng)液的制備方法可以沒有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反應(yīng)液用水溶液代替蒸餾水等作為反應(yīng)液的液體介質(zhì)，反應(yīng)液用水溶液的制備方法參考例如硫酸還原微生物等絕對(duì)厭氧性微生物用的培養(yǎng)液制備方法(Pfennig, Net.al.(1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, AHandbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed.by Starr, M.P.et.al.p.926-940, Berlin, Springer Verlag.)或“農(nóng)藝化學(xué)實(shí)驗(yàn)書第三卷、京都大學(xué)農(nóng)學(xué)部農(nóng)藝化學(xué)教室編、1990年第26次印刷、產(chǎn)業(yè)圖書株式會(huì)社出版”等，能夠得到期望的還原條件下的水溶液。具體而言，可以通過對(duì)蒸餾水等進(jìn)行加熱處理或減壓處理將溶解氣體除去而得到還原條件的反應(yīng)液用水溶液。在這種情況下，可以通過在約IOmmHg以下、優(yōu)選約5mmHg以下、更優(yōu)選約3mmHg以下的減壓條件下將蒸懼水等處理約I分鐘 約60分鐘、優(yōu)選約5分鐘 約40分鐘來將溶解氣體、特別是溶解氧除去而得到還原條件下的反應(yīng)液用水溶液。另外，也可以添加適當(dāng)?shù)倪€原劑(例如，硫代乙醇酸、抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、巰基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化鈉等)來制備還原條件的反應(yīng)液用水溶液。將上述方法適當(dāng)組合而成的方法也是有效的還原條件的反應(yīng)液用水溶液的制備方法。反應(yīng)中也優(yōu)選將反應(yīng)液維持 于還原條件。為了維持反應(yīng)過程中的還原條件，優(yōu)選盡可能地防止從反應(yīng)體系外混入氧，具體而言，可以列舉將反應(yīng)體系封入氮?dú)獾榷栊詺怏w或二氧化碳等中的方法。作為更有效地防止氧混入的方法，為了在反應(yīng)過程中使本發(fā)明的需氧性細(xì)菌的菌體內(nèi)的代謝功能高效地發(fā)揮作用，有時(shí)也需要添加維持反應(yīng)體系的PH的調(diào)節(jié)液或適當(dāng)添加各種營養(yǎng)素溶解液，在這種情況下，預(yù)先從添加溶液中除去氧是有效的。苯酚的回收通過以上述方式進(jìn)行培養(yǎng)，在反應(yīng)液中生產(chǎn)出苯酚?？梢酝ㄟ^回收反應(yīng)液來回收苯酚，也可以進(jìn)一步利用公知的方法從反應(yīng)液中分離出苯酚。作為這種公知的方法，可以列舉蒸餾法、膜透過法、有機(jī)溶劑提取法等。實(shí)施例以下，利用實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。實(shí)施例1作為苯酚生產(chǎn)用宿主的適性試驗(yàn):苯酚對(duì)谷氨酸棒桿菌及其他種類菌體的影響(I)苯酚對(duì)需氧增殖的影響對(duì)谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和惡臭假單胞菌進(jìn)行需氧培養(yǎng)中的苯酚的生長抑制試驗(yàn)。另外，本試驗(yàn)中使用的惡臭假單胞菌S12作為耐溶劑性菌進(jìn)行了報(bào)道，并公開了迄今為止唯一作為苯酚生產(chǎn)的宿主使用的技術(shù)。將谷氨酸棒桿菌R涂布在A瓊脂培養(yǎng)基[將(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2P040.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042% (w/v) MnSO4.2H201ml、0.02% (w/v)生物素溶液Iml、0.01% (w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、維生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、瓊脂15g懸濁于IL蒸餾水中]上，在33°C下于暗處靜置15小時(shí)。將一鉬環(huán)的上述培養(yǎng)皿中生長的谷氨酸棒桿菌R接種到裝有IOmlA液體培養(yǎng)基[將(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v)Fe2SO4.7H20+0.042%(w/v) MnSO4.2H201ml、0.02%(w/v)生物素溶液 lml,0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、維生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g溶解于IL蒸餾水中]的試管中，在33°C下在需氧條件下進(jìn)行13小時(shí)的振蕩培養(yǎng)。將上述條件下生長的谷氨酸棒桿菌R接種到100ml A液體培養(yǎng)基中以使初始菌體濃度OD61tl為0.05，同時(shí)添加苯酚使終濃度為OmM、0.16mM、0.2mM、0.24mM、0.32mM，并在33°C下在需氧條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。菌體的生長通過測(cè)定OD61tl的吸光度來進(jìn)行。將大腸桿菌JM109涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉和1.5%瓊脂]上，在37°C下于暗處靜置15小時(shí)。將一鉬環(huán)的上述培養(yǎng)皿中生長的大腸桿菌JM109接種到裝有IOmlLB液體培養(yǎng)基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%氯化鈉]的試管中，在37°C下在需氧條件下進(jìn)行13小時(shí)的振蕩培養(yǎng)。將上述條件下生長的大腸桿菌JM109接種到IOOml LB液體培養(yǎng)基中以使初始菌體濃度OD61tl為0.05，同時(shí)添加苯酚使苯酚的終濃度為0mM、0.16mM、0.20mM,并在37°C下在需氧條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。菌體的生長通過測(cè)定OD61tl的吸光度來進(jìn)行。將惡臭假單胞菌Fl和S12涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉和1.5%瓊脂]上，在30°C下于暗處靜置15小時(shí)。將一鉬環(huán)的上述培養(yǎng)皿中生長的惡臭假單胞菌Fl和S12接種到裝有IOml LB (+葡萄糖)液體培養(yǎng)基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉和0.4%葡萄糖]的試管中，在30°C下在需氧條件下進(jìn)行13小時(shí)的振蕩培養(yǎng)。將上述條件下生長的惡臭假單胞菌Fl和S12株接種到IOOml LB (+葡萄糖)液體培養(yǎng)基中以使初始菌體濃度OD61tl為0.05，同時(shí)添加苯酚使苯酚的終濃度為0mM、0.1OmM,0.20mM,并在30°C下在需氧條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。菌體的生長通過測(cè)定OD61tl的吸光度來進(jìn)行。向培養(yǎng)基中添加苯酚對(duì)需氧增殖的影響的分析結(jié)果示于圖1中。圖1的縱軸為od61(i。對(duì)于大腸桿菌而言，在0.16%的苯酚存在下增殖顯著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。惡臭假單胞菌Fl和作為耐溶劑性菌被報(bào)道的惡臭假單胞菌S12顯示出基本相同的傾向，在0.10%的苯酚存在下增殖顯著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。與此相對(duì)，谷氨酸棒桿菌即使在使大腸桿菌的增殖受到顯著抑制的0.16%的苯酚存在下對(duì)增殖也幾乎沒有影響，即使在使大腸桿菌和惡臭假單胞菌的增殖完全被抑制的0.20%的苯酚存在下也顯示出良好的生長。而且在0.24%的苯酚存在下能夠增殖。由此表明，谷氨酸棒桿菌與大腸桿菌和惡臭假單胞菌相比對(duì)苯酚具有高耐性，作為苯酚生產(chǎn)的宿主具有高適性。(2)苯酚對(duì)還原條件下的糖代謝的影響將谷氨酸棒桿菌R涂布在A瓊脂培養(yǎng)基上，在33°C下于暗處靜置20小時(shí)。將一鉬環(huán)的上述培養(yǎng)皿中生長的谷氨酸棒桿菌R接種到裝有IOmlA液體培養(yǎng)基的試管中，在33°C下在需氧條件下進(jìn)行15小時(shí)的振蕩培養(yǎng)。將上述條件下生長的谷氨酸棒桿菌R接種到裝有500ml A液體培養(yǎng)基的容量為2L的三角燒瓶中，在33°C下在需氧條件下進(jìn)行15小時(shí)的振蕩培養(yǎng)。通過離心分離(4°C、5000g、15分鐘)回收以上述方式培養(yǎng)增殖的菌體。將所得到的菌體以10w/v%懸濁于BT (-尿素)液體培養(yǎng)基
中。將60ml的該各菌體懸濁液裝入容量為IOOml的培養(yǎng)瓶中，在還原條件下(氧化還原電位:-450mV)添加8%的葡萄糖,并添加苯酹使苯酚濃度為0mM、0.24mM、0.38mM、0.46mM，在保持于33°C的水浴中邊攪拌邊反應(yīng)。此時(shí)，在使用2.5N的氨水并利用pH控制器(工4 O株式會(huì)社制造，型號(hào):DT-1023)進(jìn)行控制以使反應(yīng)液的PH不低于7.0的同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。將苯酚對(duì)谷氨酸棒桿菌R在還原條件下的糖代謝的影響的研究結(jié)果示于圖2中。在還原條件下，即使是在需氧培養(yǎng)中觀察到增殖抑制的0.24%的苯酚存在下也完全未觀察到苯酚的影響，顯示出與未添加苯酚時(shí)同等的糖消耗。而且，即使在0.38%的苯酚存在下也觀察到糖消耗，即使在0.46%的苯酚存在下也顯示出少量的糖消耗。由此表明，與需氧培養(yǎng)相比，谷氨酸棒桿菌R在還原條件下對(duì)苯酚顯示出高耐性，還原條件下的以谷氨酸棒桿菌為宿主的苯酚生產(chǎn)比需氧條件下的生產(chǎn)更優(yōu)越。實(shí)施例2苯酚生產(chǎn)基因的克隆與表達(dá)(I)從微牛物中提取染色體DNA從谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum) R(FERM P-18976)中提取染色體 DNA 的操作如下進(jìn)行:向 A 培養(yǎng)基[ 將(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042% (w/v) MnSO4.2H201ml、0.02% (w/v)生物素溶液1ml、0.01% (w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、維生素分析酪蛋白水解物7g溶解于IL蒸餾水中]中添加最終濃度為4%的50%(w/v)葡萄糖溶液作為碳源，使用鉬環(huán)接種后，在33°C下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名:GenomicPrep細(xì)胞和組織DNA分離試劑盒,安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)NBRC12686中提取染色體DNA的操作如下進(jìn)行:使用鉬環(huán)接種到NBRC Medium N0.802培養(yǎng)基[將多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸餾水中]中后，在30°C下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名=GenomicPrep細(xì)胞和組織DNA分離試劑盒,安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從布氏朽1檬酸桿菌(Citrobacter braakii)ATCC6750中提取染色體DNA的操作如下進(jìn)行:使用鉬環(huán)接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(BD公司制造的BD234000)中后，在37°C下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名KenomicPriip細(xì)胞和組織DNA分離試劑盒，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從哥本哈根脫亞硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense) Y51中提取染色體DNA的操作如下進(jìn)行:使用鉬環(huán)接種到MMYP培養(yǎng)基[將K2HP047.8g、KH2P04l.2g、檸檬酸鈉0.5g、MgSO4.7H200.lg、酵母提取物2.0g、丙酮酸鈉5.5g、刃天青鈉鹽1.0mg溶解于IL蒸懼水中并調(diào)節(jié)PH至7.2]中后，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名:GenomicPrep細(xì)胞和組織DNA分離試劑盒,安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從澄色綠屈接菌(Chloroflexusaurantiacus J-10-fl) ATCC29366 中提取染色體DNA的操作如下進(jìn)行:使用鉬環(huán)接種到綠屈撓菌培養(yǎng)基[次氮基三乙酸0.lg、微量營養(yǎng)素溶液 1.0ml、FeCl3 溶液 1.0m UCaSO4.2H200.06g、MgSO4.7Η200.lg、NaC10.008g、KNO30.103g、NaNO30.689g、Na2HP040.1llg^NH4Cl0.2g、酵母提取物 0.5g、甘氨酰甘氨酸 0.5g 溶解于 IL 蒸餾水中；微量營養(yǎng)素溶液:將 H2SO40.5ml、MnSO4.7Η202.28g、ZnSO4.7Η200.5g、H3BO30.5g、CuSO4.2H200.025g、Na2MoO4.2H200.025g、CoCl2.6H200.045g 溶解于 IL 蒸餾水中；FeCl3 溶液JfFeCl30.2905g溶解于IL蒸餾水中)]中后，進(jìn)行鎢燈照射并在50°C下振蕩培養(yǎng)，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名AenomicPr印細(xì)胞和組織DNA分離試劑盒，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從哥本哈根脫亞硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense) Y51中提取染色體DNA的操作如下進(jìn)行:使用鉬環(huán)接種到MMYP培養(yǎng)基[將K2HP047.8g、KH2P04l.2g、檸檬酸鈉0.5g、MgSO4.7H200.lg、酵母提取物2.0g、丙酮酸鈉5.5g、刃天青鈉鹽1.0mg溶解于IL蒸懼水中并調(diào)節(jié)PH至7.2]中后，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名:GenomicPrep細(xì)胞和組織DNA分離試劑盒,安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從點(diǎn)型念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc punctiforme)ATCC29133中提取染色體DNA的操作如下進(jìn)行:使用鉬環(huán)接種到固氮藍(lán)藻(Blue-green nitrogen-fixing)培養(yǎng)基[將K2HPO40.04g、MgSO4.7Η200.075g、CaCl2.2Η200.036g、檸檬酸 6.0mg、檸檬酸鐵銨 6.0mg、EDTA1.0mg^Na2CO30.02g、痕量金屬混合物A51.0ml溶解于IL蒸餾水中并調(diào)節(jié)pH至7.1 ;痕量金屬混合物 A5 JfH3B032.86g、MnCl2.4Η201.81g、ZnS04.7Η200.222g,Na2MoO4.2Η200.39g、CuSO4.5Η200.079g、Co (NO3)2.6Η2049.4mg溶解于IL蒸餾水中]中后，進(jìn)行光照射(2000 3000勒克斯)并在26 °C下培養(yǎng)，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名:GenomicPrep細(xì)胞和組織DNA分離試劑盒,安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。齒垢密螺旋體(Tr印onema denticola) JCM8153 的染色體 DNA (目錄號(hào) RDB6217)從獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所獲得。
_1] (2)克隆載體的構(gòu)建克降載體DCRB22的構(gòu)律通過以下的PCR法對(duì)分別包含乳酪棒桿菌JCMl2072來源的質(zhì)粒pCASEl的DNA復(fù)制起點(diǎn)(以下記作pCASEl-ori)序列和克隆載體pHSG298 (寶生物株式會(huì)社制造)的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)行PCR時(shí)，為了分別將pCASEl-ori序列、克隆載體pHSG298克隆化，基于序列號(hào)I (pCASEl-ori序列)、序列號(hào)2 (克隆載體-pHSG298)分別合成下述一對(duì)引物來使用。pCASEl-ori序列擴(kuò)增用引物(a-1):5，-AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3，(序列號(hào) 3)(b-Ι):5’ -AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列號(hào) 4)另外，引物(a-Ι)和(b-Ι)上附加有BglII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

克隆載體pHSG298擴(kuò)增用引物(a-2):5，-AT AGATCT AGGITTCCCGACTGGAAAG-3’(序列號(hào) 5)(b-2):5，-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列號(hào) 6)另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)獲得的乳酪棒桿菌JCM12072的總DNA和克隆載體pHSG298 (寶生物株式會(huì)社制造)。實(shí)際的PCR中，使用熱循環(huán)儀GeneAmp PCR系統(tǒng)9700 (應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(寶生物株式會(huì)社制造)作為反應(yīng)試劑在下述的條件下進(jìn)行。反應(yīng)液:
權(quán)利要求
1.一種具有苯酚生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體，其通過將編碼具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因?qū)胨拗靼魻罴?xì)菌而得到。
2.按權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因?yàn)槌蓤F(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)來源的基因、布氏朽1樣酸桿菌(Citrobacter braakii)來源的基因、哥本哈根脫亞硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)來源的基因、橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurantiacus)來源的基因、點(diǎn)型念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc punctiforme)來源的基因或齒垢密螺旋體(Treponema denticola)來源的基因。
3.按權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因?yàn)橄率?a)或(b)的 DNA， (a)由序列號(hào)36的堿基序列構(gòu)成的DNA、由序列號(hào)39的堿基序列構(gòu)成的DNA、由序列號(hào)42的堿基序列構(gòu)成的DNA、由序列號(hào)45的堿基序列構(gòu)成的DNA、由序列號(hào)48的堿基序列構(gòu)成的DNA或由序列號(hào)51的堿基序列構(gòu)成的DNA， (b)在嚴(yán)格的條件下與由(a)中任一個(gè)堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA雜交且編碼具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。
4.按權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主棒狀細(xì)菌為存在于其染色體上的下述(c)和/或(d)的基因被破壞或發(fā)生缺陷的棒狀細(xì)菌， (c)編碼具有預(yù)苯酸脫水酶活性的酶的基因， (d)編碼具有苯酚2-單加氧酶活性的酶的基因。
5.按權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主棒狀細(xì)菌的下述(e)和/或(f)的代謝基因在宿主中高表達(dá)， (e)編碼具有DAHP合成酶即3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶活性的酶的基因， (f)編碼具有分支酸變位酶活性的酶的基因。
6.按權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主棒狀細(xì)菌為谷氨酸棒桿菌。
7.按權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主谷氨酸棒桿菌是保藏編號(hào)為FERMP-18976的谷氨酸棒桿菌R、ATCC13032或ATCC13869。
8.按權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主谷氨酸棒桿菌是存在于保藏編號(hào)為FERMP-18976的谷氨酸棒桿菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色體上的下述(c)和/或(d)的基因被破壞或發(fā)生缺陷的谷氨酸棒桿菌， (c)編碼具有預(yù)苯酸脫水酶活性的酶的基因， (d)編碼具有苯酚2-單加氧酶活性的酶的基因。
9.按權(quán)利要求6或8所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主谷氨酸棒桿菌是保藏編號(hào)為FERMP-18976的谷氨酸棒桿菌R、ATCC13032或ATCC13869中下述(e)和/或(f)的代謝基因高表達(dá)的谷氨酸棒桿菌， (e)編碼具有DAHP合成酶活性的酶的基因， (f)編碼具有分支酸變位酶活性的酶的基因。
10.氨酸棒桿菌PHE7轉(zhuǎn)化體，其保藏編號(hào)為NITEBP-976。
11.一種苯酚的制造方法，其中，包括如下步驟:使權(quán)利要求1 10中任ー項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體在還原條件下、在含有糖類的反應(yīng)液中反應(yīng)；以及回收反應(yīng)液中的苯酹。
12.按權(quán)利要求11所述的苯酚的制造方法，其中，在反應(yīng)步驟中，轉(zhuǎn)化體實(shí)質(zhì)上不增殖。
13.按權(quán)利要求11或12所述的苯酚的制造方法，其中，還原條件下的反應(yīng)液的氧化還原電位為-200 -500毫伏。
14.按權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的苯酹的制造方法,其中,糖類為選自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、纖維ニ糖、海藻糖和甘露糖醇組成的組中的糖。
全文摘要
將編碼具有酪氨酸酚解酶(tyrosine phenol-lyase)活性的酶的基因?qū)胨拗鞴劝彼岚魲U菌(Corynebacterium glutamicum)而得到的、具有苯酚生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體能夠以糖類為原料高效地制造苯酚。具體而言，優(yōu)選包括下述步驟的方法使該轉(zhuǎn)化體在還原條件下、在含有糖類的反應(yīng)液中反應(yīng)；以及回收反應(yīng)液中的苯酚。
文檔編號(hào)C12N15/09GK103097530SQ20118004342
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者湯川英明, 乾將行 申請(qǐng)人:綠色苯酚·高機(jī)能苯酚樹脂制造技術(shù)研究組合