專利名稱：具有提高外源基因表達活性的dna元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細胞，其分泌外源蛋白的能力已通過利用具有DNA元件的外源基因表達載體而提高，并涉及利用宿主細胞生產(chǎn)外源蛋白的方法。
背景技術(shù)：
由于遺傳重組技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品例如治療性蛋白和抗體藥物的市場快速增長。特別是抗體藥物具有高特異性，即使將其給予人體也不引起不利的免疫反應(yīng)，因此，一直在對其積極進行開發(fā)?？墒褂梦⑸?、酵母、昆蟲、動物或植物細胞、轉(zhuǎn)基因動物或植物細胞等等，作為在其中產(chǎn)生由抗體藥物代表的蛋白質(zhì)藥物的宿主細胞。為了使蛋白質(zhì)藥物具有生物學(xué)活性或免疫原性，翻譯后修飾例如折疊或糖基化是必要的，因此不能進行復(fù)雜的翻譯后修飾的微生物或具有不同聚糖結(jié)構(gòu)的植物不適合作為以生物反應(yīng)器操作的宿主細胞?？紤]到培養(yǎng)的哺乳動物細胞例如來自于與人親緣很近的物種的CHO細胞具有與人相似的聚糖結(jié)構(gòu)，而且安全，并且可以使用所述細胞進行翻譯后修飾，目前標(biāo)準(zhǔn)是使用這類細胞。在將培養(yǎng)的哺乳動物細胞用作宿主細胞的情況中，與微生物等(見非專利文件I)相比存在生長率低、生產(chǎn)率低、成本高等問題。此外，為了在臨床試驗中使用蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品，有必要給予大量產(chǎn)品。因此，其生產(chǎn)能力的缺乏也是世界性難題。因此，為了提高外源基因在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中的生產(chǎn)率，迄今已進行了啟動子、增強子、藥物選擇標(biāo)記、基因擴增和培養(yǎng)工程技術(shù)等等的大量研究。然而，目前的情形是尚未建立能始終如一地提高基因表達的系統(tǒng)。作為外源蛋白低生產(chǎn)率的的原因之一，考慮到“位置效應(yīng)”(見非專利文件2)。當(dāng)將外源基因引入宿主細胞時，其被隨機地整合到宿主染色體基因組，并且外源基因的轉(zhuǎn)錄受到外源基因整合區(qū)域周圍DNA的很大影響。然而，位置效應(yīng)受到例如外源基因的插入位點、拷貝數(shù)、結(jié)構(gòu)等因素的影響，非常難以控制染色體中的插入位點。為了解決所述問題，業(yè)已鑒別了調(diào)控多核苷酸序列(也叫DNA元件)，例如基因座控制區(qū)(LCR)、支架/基質(zhì)附著區(qū)(S/MAR)、絕緣子、遍在染色質(zhì)開放元件(UCOE)和抗阻遏物(STAR元件)等(見非專利文件3-6)。LCR不需要在內(nèi)源基因的基因座打開染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。然而，LCR是轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其具有打開外源基因被整合位點的DNA周圍染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力及當(dāng)其與外源基因表達單元一起使用時重塑大范圍染色質(zhì)的能力，并且認為其需要富含AT的區(qū)域(見非專利文件7)。常將LCR代表的上述DNA元件與啟動子聯(lián)合使用，已知與只用啟動子的情況相比，在DNA元件與啟動子聯(lián)合使用的情況中，外源基因表達水平增加。然而，至今報道了極少DNA元件類型，并且促進外源基因表達增強的各種機制也相互不同。另外，即使DNA元件和啟動子聯(lián)合使用，在DNA元件和啟動子控制下也不能生產(chǎn)足量的治療性蛋白。因此，不能說已獲得能增加外源蛋白生產(chǎn)率的DNA元件的充足知識。因此，本發(fā)明目標(biāo)是提供增加在蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品中待用的外源蛋白產(chǎn)量的方法，所述方法使用具有在宿主細胞例如培養(yǎng)的哺乳動物細胞中提高外源基因表達的高活性的DNA元件。引文列表
非專利文獻
NPL1: Florian M.Wurm.(2004) Production of recombinant proteintherapeutics in cultivated mammalian cells (在培養(yǎng)哺乳動物細胞中生產(chǎn)重組蛋白治療藥物).Nat.Biotechnol.22(11): 1393-1398
NPL 2: Ted H.J.Kwaks 和 Arie P.0tte.(2006) Employing epigenetics toaugment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells (米用表觀遺傳學(xué)來增加哺乳動物細胞中治療性蛋白的表達).TRENDSinBiotechnol.24(3): 137-142NPL 3: Pierre-Alain Girodj Duc-Quang Nguyen.等(2007) Genome-wideprediction of matrix attachment regions that increase gene expression inmammalian cells (在哺乳動物細胞中增加基因表達的基質(zhì)附著區(qū)的基因組范圍預(yù)測).Nat.Methods.4(9): 747-753
NPL 4: Adam C.Bell，Adam G.West, Gary Felsenfeld (2001) Insulators andBoundaries: Versatile Regulatory elements in the Eukaryotic Genome (絕緣子和邊界:真核基因組中多用途調(diào)控元件)，Science 291: 447-450
NPL 5: Steven Williams, Tracey Mustoe.等(2005) CpG-1sland fragmentsfrom the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgeneexpression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells (來自 HNRPA2B1/CBX3基因組位點的CpG-島片段在哺乳動物細胞中降低沉默并提高自hCMV啟動子/增強子的轉(zhuǎn)基因表達).BMC Biotechnol.5(17): 1-9
NPL 6: Arie P.0ttej Ted H.J.Kwaks.等(2007) VariousExpression-Augmenting DNA elements Benefit from STAR-Selectj a Novel HighStringency Selection System for Protein Expression (各種增強表達的DNA兀件受益于STAR-Select這種用于蛋白質(zhì)表達的新型高嚴(yán)格性選擇系統(tǒng)).Biotechnol.Prog.23:801-807
NPL 7: Qiliang Li， Kenneth R.Peterson, Xiangdong Fang 和 GeorgeStamatoyannopoulosj (2002) Locus control regions (基因座控制區(qū))，Blood 100(9):3077-3086發(fā)明概述技術(shù)問題
如上所述，仍然沒有許多類型的作為調(diào)控多核苷酸序列的DNA元件，另外，其中只有極少DNA兀件在提1 外源基因表達中1 度有效。本發(fā)明的目標(biāo)是提供利用DNA兀件在哺乳動物細胞中穩(wěn)定實現(xiàn)高表達的方法等等，所述DNA元件通過伴隨其中已引入外源基因表達單元的基因座周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化來提高轉(zhuǎn)錄激活。問題的解決方案
本發(fā)明人為了解決上述問題進行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)待表達的外源蛋白在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中的生產(chǎn)率和分泌可通過使用一種或多種特定類型的DNA元件來提高，由此完成了本發(fā)明。
換句話說，本發(fā)明包括以下發(fā)明。(I)由序列表中的SEQ ID NO:1代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。(2)由序列表中的SEQ ID NO: 2代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。(3)由序列表中的SEQ ID NO: 3代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。(4)由序列表中的SEQ ID NO: 4代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。(5)由序列表中的SEQ ID NO: 5代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。(6)包含序列表中的SEQ ID NO: 1_5中任一個所代表的多核苷酸序列的至少3000個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。(7)包含序列表中的SEQ ID NO: 1_5中任一個所代表的多核苷酸序列的至少2000個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。(8)包含序列表中的SEQ ID NO: 1_5中任一個所代表的多核苷酸序列的至少1500個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。(9)由與(1)-(8)中任一項的多核苷酸的多核苷酸序列具有95%或更高同源性的多核苷酸序列組成的多核苷酸。(10)由與(1)-(8)中任一項的多核苷酸的多核苷酸序列具有99%或更高同源性的多核苷酸序列組成的多核苷酸。(11)由多核苷酸序列組成的多核苷酸，所述多核苷酸序列含有(I)-(IO)中任一項的多核苷酸的多核苷酸序列的兩種或多種序列。(12)由兩種或多種類型的選自(I)-(IO)中任一項的多核苷酸的多核苷酸組成的多核苷酸。(13)包含(1)-(12)中任一項的多核苷酸的多核苷酸序列的外源基因表達載體。(14) (13)的外源基因表達載體，其中由外源基因編碼的蛋白是多聚體蛋白。(15) (14)的外源基因表達載體，其中外源基因編碼的蛋白是異多聚體蛋白。(16) (15)的外源基因表達載體，其中外源基因編碼的蛋白是抗體或其功能片段。(17)轉(zhuǎn)化細胞，其中已引入(13)-(16)中任一項的外源基因表達載體。(18) (17)的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述細胞是源自哺乳動物的培養(yǎng)細胞。(19) (18)的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述源自哺乳動物的培養(yǎng)細胞為選自C0S-1細胞、293細胞和CHO細胞的細胞。(20) (17)-(18)中任一項的轉(zhuǎn)化細胞，其中由外源基因編碼的蛋白為多聚體蛋白。(21) (20)的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述外源基因編碼的蛋白為異多聚體蛋白。

(22) (21)的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述外源基因編碼的蛋白為抗體或其功能片段。(23)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法特征在于包括培養(yǎng)(17)-(22)任一項的轉(zhuǎn)化細胞并從得到的培養(yǎng)產(chǎn)物中獲得由外源基因編碼的蛋白。(24)在已引入外源基因或外源基因表達載體的轉(zhuǎn)化細胞中提高外源基因表達的方法，所述方法特征在于使用(1)-(12)中任一項的多核苷酸或(13)-(16)中任一項的外源基因表達載體。(25) (1)-(12)中任一項的多核苷酸用于在轉(zhuǎn)化細胞中提高外源基因表達的用途。
發(fā)明的有利作用
根據(jù)本發(fā)明，通過使用DNA元件將外源基因表達載體引入到哺乳動物宿主細胞，可顯著提高治療性蛋白、抗體等的外源基因的表達。附圖簡述


圖1顯示通過擴增GADPH區(qū)域來證實對其進行ChlP-on-chip的樣品是用抗乙?；M蛋白H3抗體經(jīng)特異性染色質(zhì)免疫沉淀的圖表。圖2為已插入DNA元件的SEAP表達載體的示意圖。圖3為顯示在不含DNA元件或含DNA元件A2、A7、A18、B5或C14的穩(wěn)定表達的CHO細胞系中，在CMV啟動子控制下SEAP表達的圖表。證實了 0嫩元件4237、418、85和(:14對提聞表達的作用。

圖4包含兩個圖表，顯示在不含DNA元件或含DNA元件A2或A7的穩(wěn)定表達的CHO細胞系中，在EF-1a或SV40啟動子控制下的SEAP表達。證實了 DNA元件A2和A7對提高表達的作用。圖5是已插入DNA元件的抗體表達(抗體基因X重鏈和輕鏈共表達)載體的示意圖。圖6包含兩個圖表，顯示在不含DNA元件或含DNA元件A7的穩(wěn)定表達的CHO細胞系中，在CMV或EF-1 a啟動子控制下的抗體分泌水平(通過ELISA法測量)。證實了 DNA兀件A7提聞表達的作用。圖7是顯不DNA兀件A2和相關(guān)序列的序列長度的表格。圖8包含兩個圖表，顯示在不含DNA元件或含DNA元件A2或相關(guān)序列的穩(wěn)定表達的CHO細胞系中的SEAP表達。證實了 DNA元件A2和相關(guān)序列提高表達的作用。圖9是顯示DNA元件A7和相關(guān)序列的序列長度的表格。圖10包含三個圖表,顯不在不含DNA兀件或含DNA兀件A7或相關(guān)序列的穩(wěn)定表達的CHO細胞系中的SEAP表達。證實了 DNA元件A7和相關(guān)序列提高表達的作用。圖11為顯示DNA元件A18和相關(guān)序列的序列長度的表格。圖12是顯示在不含DNA元件或含DNA元件A18或相關(guān)序列的穩(wěn)定表達的CHO細胞系中SEAP表達的圖表。證實了 DNA元件A18和相關(guān)序列提高表達的作用。圖13是顯不DNA兀件B5和相關(guān)序列的序列長度的表格。圖14是顯示在不含DNA元件或含DNA元件B5或相關(guān)序列的穩(wěn)定表達的CHO細胞系中SEAP表達的圖表。證實了 DNA元件B5和相關(guān)序列提高表達的作用。圖15是顯示DNA元件C14和相關(guān)序列的序列長度的表格。圖16包含三個圖表，顯示在不含DNA元件或含DNA元件C14或相關(guān)序列的穩(wěn)定表達的CHO細胞系中的SEAP表達。證實了 DNA元件C14和相關(guān)序列提高表達的作用。圖17是顯示在不含DNA元件或含DNA元件A2、A7、A18、B5或C14的穩(wěn)定表達的HEK293細胞系中SEAP表達的圖表。證實了 DNA元件A2、A7、A18、B5和C14在HEK293細胞中提高表達的作用。圖18是顯示基于DNA元件A2、A7或A18全長序列的起點和終點的核苷酸的視圖。圖19是顯示基于DNA元件B5或C14全長序列的起點和終點的核苷酸的視圖。實施方案說明本發(fā)明在下文中將參考實施例進行具體描述。然而，這些實施例不限制本發(fā)明的技術(shù)范圍。將在發(fā)明實施例中使用的質(zhì)粒、限制酶、DNA修飾酶等為市售產(chǎn)品，并可按照通用程序使用。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員亦熟知或可從文獻中獲得用于以下方面的程序:DNA克隆、多核苷酸序列測定、宿主細胞的轉(zhuǎn)化、經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞的培養(yǎng)、從獲得的培養(yǎng)液中分離抗體、抗體的純化等等。本文所用術(shù)語“基因”不僅包括DNA，也包括其mRNA、cDNA及其RNA。本文所用術(shù)語“多核苷酸”亦以與核酸相同的意思使用，并亦包括DNA、RNA、探針、寡核苷酸和引物。本文所用術(shù)語“多肽”和“蛋白”無差別地使用。本文所用術(shù)語“基因表達”指從基因轉(zhuǎn)錄mRNA的現(xiàn)象和/或從mRNA翻譯蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。本文所用術(shù)語“外源基因”指人工引入宿主細胞的基因。本文所用術(shù)語“外源蛋白”指由外源基因編碼的蛋白。本文所用術(shù)語“基因表達單元”指在轉(zhuǎn)錄閱讀框方向具有至少啟動子區(qū)域、外源基因和轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域(多聚(A)添加信號)的多核苷酸。本文所用術(shù)語“提高外源基 因表達的活性”，指通過創(chuàng)造對含有外源基因的基因表達單兀周圍的DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯有利的環(huán)境，并顯者提聞轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，來提聞宿主細胞中外源蛋白的產(chǎn)量。本文所用術(shù)語“DNA元件”指具有提高外源基因表達活性的多核苷酸，其中所述多核苷酸位于基因表達單元附近或在含有基因表達單元的外源基因表達載體中。本文所用術(shù)語“抗體功能片段”，指具有抗原結(jié)合活性的部分抗體片段，其包括Fab、F(ab’)2等。然而，所述術(shù)語不限于這些分子，只要片段對抗原具有結(jié)合親和力即可。1.用于提聞外源基因表達的DNA兀件
如實施例1所示，可通過利用乙?；M蛋白H3和基因組DNA的相互作用來獲得本發(fā)明的DNA元件。一般而言，認為組蛋白(H3和H4)的乙?；c轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，并且一直在提倡兩種主要理論。一種理論是組蛋白乙酰化與核小體構(gòu)象改變有關(guān)，以此方式使得組蛋白尾部乙酰化,從而成為電中和的，導(dǎo)致DNA組蛋白相互作用減弱(Mellor J.(2006) Dynamicnucleosomes and gene transcription (動態(tài)核小體和基因轉(zhuǎn)錄).Trends Genet.22(6): 320-329)。另一個理論是組蛋白乙?；c各種轉(zhuǎn)錄因子的募集相關(guān)(Nakatani Y.(2001) Histone acetylases - versatile players (組蛋白乙酸基轉(zhuǎn)移酶-多面手).Genes Cells.6(2): 79_86)。在任何一個理論中,有高可能性的是,組蛋白乙?；c轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，并且通過用抗乙酰化組蛋白H3抗體實施染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)，可能濃縮與乙?；M蛋白H3相互作用的DNA元件。在本發(fā)明中，A2是用于提高外源基因表達的DNA元件的實例。A2位于人15號染色體的80966429-80974878區(qū)域，為具有62.2% AT含量的8450 bp的多核苷酸序列。A2的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO:1代表。A7、A18、B5和C14是相似的DNA元件的實例。A7位于人11號染色體的88992123-89000542區(qū)域，為具有64.52% AT含量的8420 bp的多核苷酸序列。A7的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 2代表。
A18位于人4號染色體的111275976-111284450區(qū)域，為具有62.54% AT含量的8475 bp的多核苷酸序列。A18的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 3代表。B5位于人I號染色體的143034684-143043084區(qū)域，為具有66.37% AT含量的8401 bp的多核苷酸序列。B5的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 4代表。最后，C14位于人11號染色體的46089056-46097482區(qū)域，為具有63.81% AT含量的8427 bp的多核苷酸序列。C14的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 5代表。在本發(fā)明中，可通過使用由報告基因例如SEAP編碼的蛋白活性作為指標(biāo)來測定DNA元件提高外源基因表達的活性。與不存在DNA元件的情況相比，在存在DNA元件的情況中，當(dāng)報告蛋白活性增加時(優(yōu)選2倍或更高，更優(yōu)選4倍或更高，再優(yōu)選5倍或更高)，可確定DNA元件具有提高外源基因表達的活性。甚至在活性增加2倍或更多的情況中，也預(yù)期這將會降低細胞培養(yǎng)規(guī)模和細胞培養(yǎng)時間，因此可能增加產(chǎn)量和降低細胞培養(yǎng)成本。如果產(chǎn)量增加，那么可能穩(wěn)定提供外源蛋白用作藥物。此外，如果細胞培養(yǎng)成本降低，則外源蛋白用作藥物的成本降低，并且待給予外源蛋白的患者的財務(wù)負擔(dān)也會降低。在本發(fā)明中，以上任何一種DNA元件可以單獨使用，也可使用一種類型的DNA元件的2個或多個拷貝。或者，也可以聯(lián)合使用2種或多種不同類型的上述DNA元件。A2、A7、A18、B5和C14為本發(fā)明使用的DNA元件的優(yōu)選實例。將用于本發(fā)明的D·NA元件可以是這樣的多核苷酸序列，其包含與由SEQ ID NO:1-5代表的任何一個多核苷酸序列具有80%或更高同源性的多核苷酸序列，并具有提高外源基因表達的活性。80%或更高的同源性優(yōu)選為90%或更高的同源性，更優(yōu)選95%或更高的同源性，最優(yōu)選99%或更高的同源性?？梢杂美鏔ASTA或BLAST程序在例如日本DNA數(shù)據(jù)庫等中檢索多核苷酸序列的同源性。將用于本發(fā)明的DNA元件可以是這樣的DNA元件，其在嚴(yán)格條件下與這樣的由多核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，并具有提高外源基因表達的活性:所述多核苷酸與由選自SEQ ID NO: 1-5代表的多核苷酸序列的多核苷酸序列組成的多核苷酸互補。本文所用術(shù)語“嚴(yán)格條件”指其中形成所謂的特異雜交物(hybrid)但不形成非特異雜交物的條件。例如，例示性嚴(yán)格條件為這樣的條件，在此條件下由具有高同源性的多核苷酸序列組成的核酸互補鏈雜交，包含具有較低同源性的多核苷酸序列的核酸的互補鏈不雜交，所述具有高同源性的多核苷酸序列即與選自SEQ ID NO: 1-5代表的多核苷酸序列的多核苷酸序列具有80%或更高、優(yōu)選90%或更高、更優(yōu)選95%或更高、最優(yōu)選99%或更高同源性的多核苷酸序列。更具體的是，可例示的條件為這樣的條件，在此條件下，鈉鹽濃度為15-750禮、優(yōu)選50-750禮、更優(yōu)選300-750禮，溫度為25_70°C、優(yōu)選50_70°C、更優(yōu)選55-65°C,甲酰胺濃度為0-50%、優(yōu)選20-50%、更優(yōu)選35-45%。另外，作為嚴(yán)格條件，可例示在雜交后洗滌濾紙的條件，其中鈉鹽濃度通常為15-600 mM、優(yōu)選50-600 mM、更優(yōu)選300-600禮，溫度為50-70°C、優(yōu)選55-70°C、更優(yōu)選60-65°C。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考分子克隆(Molecular Cloning) (Sambrook, J.等，Molecular Cloning: a Laboratory Manual 第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989))等容易地獲得這樣的同源基因。另外,可以通過FASTA搜索或BLAST搜索以相同方式確定上述多核苷酸序列的同源性。可通過本技術(shù)領(lǐng)域已知方法引入突變(缺失、取代和/或添加)到上述多核苷酸序列，所述方法例如Kunkel法或缺口雙鏈法或基于該方法。例如，可以使用利用定點誘變法的突變導(dǎo)入試劑盒(例如，Mutant-K (由TaKaRa Bio, Inc.制造)、Mutant_G (由TaKaRaBio, Inc.制造)或體外LA PCR誘變系列試劑盒(由TaKaRa Bio, Inc.制造))等。這樣的突變多核苷酸也可作為本發(fā)明的DNA元件使用?？梢允褂冒尚蛄斜碇蠸EQ ID NO: 1_5任一個所代表的多核苷酸序列的至少3000或至少2000個連續(xù)核苷酸的部分片段作為本發(fā)明DNA元件。所述部分片段的實例包括:A2的部分片段A2-1到A2-17，A7的部分片段A7-1到A7-18，A18的部分片段A18-1到A18-4，B5的部分片段B5-1到B5-6，以及C14的部分片段C14-1到C14-14。然而，DNA元件不限于這些部分片段，只要其具有提高外源基因表達的活性即可。在本發(fā)明中，可以單獨使用上述任何一個部分片段，也可以使用一種類型部分片段的2個或多個拷貝?；蛘撸陕?lián)合使用2種或多種不同類型的部分片段。另外，可以聯(lián)合使用上述任何DNA元件的全長序列和部分片段。在以上聯(lián)合中，全長序列和部分片段可以源自相同DNA元件或源自不同DNA元件。關(guān)于A2的各個片段的多核苷酸序列:A2-1對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的1-3000位核苷酸的多核苷酸序列；A2-2對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的2801-5800位核苷酸的多核苷酸序列；A2-3對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的5401-8450位核苷酸的多核苷酸序列；A2-4對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的701-2700位核苷酸的多核苷酸序列；A2_5對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的701-2200位核苷酸的多核苷酸序列；A2_6對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的701-3700位核苷酸的多核苷酸序列；A2-7對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的2001-5000位核苷酸的多核苷酸序列；A2-8對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的4001-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A2-9對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的1-3700位核苷酸的多核苷酸序列；A2-10對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的2001-5800位核苷酸的多核苷酸序列；A2-11對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的2801-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A2_12對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的701-5800位核苷酸位核苷酸的多核苷酸序列；A2-13對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的2001-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A2_14對應(yīng)于序列表中SEQID NO:1的2801-8450位核苷酸的多核苷酸序列；A2-15對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的1-5800位核苷酸的多核苷酸序列；A2-16對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的701-7000位核苷酸的多核苷酸序列；和A2-17對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO:1的2001-8450位核苷酸的多核苷酸序列。關(guān)于A7的各個片段的多核苷酸序列:A7-1對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的601-3600位核苷酸的多核苷酸序列；A7-2對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的3601-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7-3對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的5401-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7-4對應(yīng)于序列表中 SEQ ID NO: 2的3401-6400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-5對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的1501-4500位核苷酸的多核苷酸序列；A7-6對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的4401-7400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-7對應(yīng)于序列表中SEQID NO: 2的2401-5400位核苷酸的多核苷酸序列；A7_8對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的1-3600位核苷酸的多核苷酸序列；A7-9對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的1501-5400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-10對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的2401-6400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-11對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的3401-7400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-12對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的4401-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7_13對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的1-5400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-14對應(yīng)于序列表中SEQID NO: 2的1501-6400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-15對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的2401-7400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-16對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的3401-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7-17對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的1-6400位核苷酸的多核苷酸序列，和A7-18對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 2的1501-7400位核苷酸的多核苷酸序列。關(guān)于A18的各個片段的多核苷酸序列:A18_1對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 3的1-5040位核苷酸的多核苷酸序列；A18-2對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 3的1001-6002位核苷酸的多核苷酸序列；A18-3對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 3的2001-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A18-4對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 3的3000-7000位核苷酸的多核苷酸序列。A2、A7和A18的各個片段的起點和終點示于圖18中。關(guān)于B5的各個片段的多核苷酸序列:B5-1對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 4的1-4001位核苷酸的多核苷酸序列；B5-2對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 4的1-3200位核苷酸的多核苷酸序列；B5-3對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 4的2491-5601位核苷酸的多核苷酸序列；B5-4對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 4的5373-8401位核苷酸的多核苷酸序列；B5-5對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 4的901-4001位核苷酸的多核苷酸序列；和B5-6對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 4的4001-7000位核苷酸的多核苷酸序列。關(guān)于C14的各個片段的多核苷酸序列:C14_1對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的960-4015位核苷酸的多核苷酸序列；C14-2對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的1987-5014位核苷酸的多核苷酸序列；C14-3對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的4020-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-4對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的960-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14-5對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的960-6011位核苷酸的多核苷酸序列；C14-6對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的4939-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14-7對應(yīng)于序列表中SEQID NO: 5的960-5014位核苷酸的多核苷酸序列；C14_8對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的2994-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-9對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的4020-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14_10對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的1-5014位核苷酸的多核苷酸序列；C14-11對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的1987-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-12對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的2994-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14-13對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的960-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-14對應(yīng)于序列表中SEQ ID NO: 5的1987-8141位核苷酸的多核苷酸序列。B5和C14各個片段的起點和終點亦示于圖19中。2.多核苷酸的獲取
在本發(fā)明中，可通過如下所述通用程序獲得含有外源基因的多核苷酸，所述外源基因編碼其產(chǎn)量將會增加的外源蛋白，這一點在后面闡述。例如，可使用基于外源基因片段合成的DNA探針，通過篩選源自表達外源基因的細胞或組織的cDNA文庫，來分離所述多核苷酸。mRNA可以通過本技術(shù)領(lǐng)域常用 的方法來制備。例如，用胍試劑、酚試劑等處理細胞或組織，從而獲得總RNA,此后通過使用寡聚(dT)纖維素柱或含有Sepharose 2B作為載體的聚U-Sepharose柱等等的親和柱法,或通過分批處理法,獲得多聚(A)+RNA (mRNA)。同樣，多聚(A)+RNA可以通過蔗糖密度梯度離心法等進一步分級分離。然后，用由此獲得的mRNA作為模板，同時亦使用寡聚dT引物和逆轉(zhuǎn)錄酶，合成單鏈cDNA。從由此獲得的單鏈cDNA，用DNA聚合酶1、DNA連接酶、RNA酶H等合成雙鏈cDNA。用T4DNA聚合酶使由此合成的雙鏈cDNA具有平端，接著與銜接子(例如EcoI銜接子)連接，進行磷酸化等，將所得DNA摻入到諸如Agtll等λ噬菌體中以實現(xiàn)體內(nèi)包裝，藉此可制備cDNA文庫。也可使用λ噬菌體以外的質(zhì)粒載體來制備cDNA文庫。此后，可自cDNA文庫選擇含有靶DNA的克隆(陽性克隆)。在待用于增加蛋白產(chǎn)量或增加含有外源基因的多核苷酸產(chǎn)量的上述DNA元件分離自基因組DNA情況下，或在含有啟動子和終止子區(qū)域的多核苷酸分離自基因組DNA的情況下，參照通用程序(Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)自待用作收集源的生物細胞系提取基因組DNA，選擇并分離多核苷酸?？梢詤⒄绽鏑ryer等的方法(Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975))或 P.Philippsen 等的方法(Methods Enzymo1., 194，169-182 (1991))進行基因組 DNA 的提取。也可以通過例如PCR 法(PCR Technology.Henry A.Erlich, Atockton press(1989))獲得靶DNA元件或含有外源基因的多核苷酸。在用PCR法擴增多核苷酸時，使用20-到30-聚體的合成的單鏈DNA作為引物，并用基因組DNA作為模板。在確認基因的多核苷酸序列后使用擴增的基因?？梢允褂没蚪MDNA文庫例如細菌人工染色體(BAC)作為PCR模板。

在另一方面，可以通過以下方法獲得含有其序列未知的外源基因的多核苷酸:(a)按照通用程序制備基因文庫；和(b)從制備好的基因文庫中選擇所期需多核苷酸并擴增所述多核苷酸?；蛭膸炜扇缦轮苽?通過用合適的限制酶將染色體DNA部分消化，以使染色體DNA片段化，讓所獲得的片段與合適的載體連接，并將載體引入到合適的宿主，所述染色體DNA通過通用程序自用作采集源的生物細胞系獲得?；蛭膸煲嗫扇缦轮苽?從細胞提取mRNA,從mRNA合成cDNA,讓cDNA與合適的載體連接,將載體引入到合適的宿主。亦可使用用于基因文庫制備的通常稱作載體的質(zhì)粒、噬菌體載體、粘粒等，作為在所述制備中使用的載體?？墒褂眠m于上述載體類型的宿主，作為待轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主。用含有對外源基因特異的序列的標(biāo)記探針，通過菌落雜交法、噬菌斑雜交法等，從上述基因文庫選擇含有外源基因的多核苷酸。另外，也可以通過完全化學(xué)合成生產(chǎn)含有外源基因的多核苷酸。例如，可通過以下方法來合成基因:制備兩對互補寡聚核苷酸并退火的方法；由DNA連接酶連接幾種退火的DNA鏈的方法；制備幾種部分配對的多核苷酸并且由PCR填充空隙的方法；等等。可通過常規(guī)技術(shù)例如雙脫氧法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sc1., USA, 74,5463-5467，(1977))等進行多核苷酸序列的測定。另外，也可以用市購序列測定試劑盒等容易地進行上述多核苷酸序列的測定。3.外源基因表達載體，元件載體
提供以下載體作為本發(fā)明的外源基因表達載體:含有一種類型的上述DNA元件，一種類型的上述DNA元件的兩個或多個拷貝，或兩個或多個不同類型的上述DNA元件的組合，并進一步含有外源基因表達單元的載體。當(dāng)用上述外源基因表達載體在宿主細胞中表達外源基因時，DNA元件可緊鄰基因表達單元的上游或下游，或可位于遠離基因表達單元的位置。另外，可以使用一種含有多個所述DNA元件的外源基因表達載體。附帶說一下，DNA元件可以以相對于基因表達單元的正向或反向插入。另外，亦包括以下載體作為待用于本發(fā)明的載體:含有一種類型的上述DNA元件，一種類型的上述DNA元件的兩個或多個拷貝，或兩種或多種不同類型的上述DNA元件組合，并且不含有基因表達單元(下文中也稱作“元件載體”)的載體。所述元件載體可以與上述含有DNA元件的外源基因表達載體或不含DNA元件而僅包含外源基因表達單元的外源基因表達載體組合使用。與單獨使用外源基因表達載體的情形相比，通過讓元件載體與外源基因表達載體共存，外源基因的表達增強，因此，上述載體組合也包括在本發(fā)明的外源基因表達載體中。編碼外源蛋白的基因不受特別限制，然而，其實例包括:報告基因，例如分泌性堿性磷酸酶(SEAP)、綠色熒光蛋白(GFP)和熒光素酶；各種酶基因，例如α-淀粉酶基因和α-半乳糖苷酶基因；各種干擾素基因，其為藥學(xué)上有用并有生理活性的蛋白，例如α干擾素和Y干擾素基因；各種白細胞介素例如IL-1和IL-2基因；各種細胞因子基因，例如紅細胞生成素(EPO)基因和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)基因；生長因子基因；和抗體基因?？梢酝ㄟ^任何方法獲得這些基因。

本發(fā)明在有關(guān)高度疏水蛋白和由于復(fù)合構(gòu)成而難于分泌和生產(chǎn)的蛋白上特別有效。因此，上述外源蛋白包括多聚體蛋白，例如作為抗體或其功能片段的異多聚體?！翱贵w功能片段”指具有抗原結(jié)合活性的抗體的部分片段，包括Fab、F(ab’)2、Fv, scFv、雙抗體、線性抗體、自抗體片段形成的多特異性抗體等。抗體的功能片段還包括Fab’，其為通過在還原條件下處理F(ab’)2獲得的抗體可變區(qū)中的單價片段。然而，這些功能片段不限于這些分子，只要所述片段對抗原具有結(jié)合親和力即可。另外，這些功能片段不僅包括通過用合適的酶處理抗體蛋白全長分子獲得的片段，還包括在合適的宿主細胞中使用遺傳修飾的抗體基因生廣的蛋白?；虮磉_單元在轉(zhuǎn)錄閱讀框方向具有至少啟動子區(qū)域、外源基因和轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域(多聚(A)添加信號)。本文可使用的啟動子可以是組成型表達啟動子或誘導(dǎo)型表達啟動子。組成型表達啟動子的實例包括各種天然啟動子，例如SV40早期啟動子、腺病毒ElA啟動子、CMV (巨細胞病毒)啟動子、EF-1 α (人延伸因子-1 α )啟動子、HSP70啟動子、MT啟動子、RSV啟動子、UBC啟動子和肌動蛋白啟動子；和人工(融合)啟動子，例如SRa啟動子和CAG啟動子。另外，多聚(A)添加序列可以是具有引起從啟動子轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止的活性的序列，可以是與啟動子相同或不同的基因的序列。需要使用強啟動子來提高外源蛋白的生產(chǎn)。然而，當(dāng)試圖使用高活性啟動子生產(chǎn)難以折疊的蛋白或難以分泌的蛋白時，所述蛋白反而可能不能分泌。這是因為當(dāng)以超過進行翻譯的核糖體和進行折疊和分泌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量的量生產(chǎn)時，過量生產(chǎn)的蛋白在細胞內(nèi)變性、積累和泛素化，然后由蛋白體降解。因此，優(yōu)選適當(dāng)?shù)剡x擇這樣的啟動子，其可以達到這樣程度的表達水平:得到的蛋白不變性或聚集，或得到的蛋白量不超過分泌容量?；蛘撸ㄟ^調(diào)節(jié)(例如降低)啟動子活性來使用啟動子。在多聚體蛋白中，形成異多聚體的分子易受上述效應(yīng)的影響，特別是諸如為異四聚體的抗體等分子?？贵w具有相互締合的兩條重鏈分子和兩條輕鏈分子，因此，為了恰當(dāng)?shù)鼐喓纤龇肿?，其表達水平是重要因素。另外，本發(fā)明的外源基因表達載體和元件載體可以各自含有選擇標(biāo)記用于選擇轉(zhuǎn)化體。通過使用例如賦予對藥物抗性的抗藥標(biāo)記，可以選擇轉(zhuǎn)化體，所述藥物例如淺藍菌素(cerulenin)、金擔(dān)子素(aureobasidin)、Zeocin、刀豆氨酸(canavanine)、放線菌酮(cycloheximide)、潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、殺稻痕素(blasticidin)、四環(huán)素(tetracycline)、卡那霉素(kanamycin)、氨節(jié)西林(ampicillin)或新霉素(neomycin)。另外，當(dāng)使用以下基因作為標(biāo)記時,亦可選擇轉(zhuǎn)化子:賦予對例如乙醇等溶劑抗性、對甘油、鹽等的滲透壓抗性、對諸如銅離子等金屬離子抗性的基因等等。本發(fā)明的外源基因表達載體和元件載體各自可以是不摻入到染色體DNA的載體。一般而言，將外源基因表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞，此后隨機摻入到染色體中。然而，通過使用源于哺乳動物病毒例如猿猴病毒40 (SV40)、乳頭瘤病毒(BPV、HPV)或EBV的組成型成分，載體可作為在轉(zhuǎn)染宿主細胞中自主復(fù)制的游離型載體使用。例如，可以使用含有SV-40來源的復(fù)制起點(oriP)及編碼為反式作用因子的SV40大T抗原的序列的載體、含有EBV來源的oriP和編碼EBNA-1的序列的載體等等?？梢酝ㄟ^提高外源基因表達的活性來表示DNA元件的作用，而與載體類型或其到染色體中的摻入存在或不存在情況無關(guān)。4.轉(zhuǎn)化細胞
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞是已經(jīng)引入含有上文條目“I”所述的DNA元件的上文條目“3”所述的外源基因表達載體的轉(zhuǎn)化細胞。作為外源基因表達載體，可以引入僅含有DNA元件的外源基因表達載體(A)，或可以聯(lián)合引入含有DNA元件的外源基因表達載體以及在上文條目“3”所述的元件載體(B)。或者，可以聯(lián)合引入不含有DNA元件的外源基因表達載體和元件載體(C)?？梢园凑绽缫韵路椒▉韺嵤┰谑褂靡陨息腔?C)組合的宿主細胞中的外源基因的表達:Girod 等的方法(Biotechnology and Bioengineering, 91, 2-11 (2005))和Otte 等的方法(Biotechnol.Prog., 2007，23，801-807 (2007))。
待轉(zhuǎn)化的宿主細胞的實例包括真核細胞，其優(yōu)選實例包括哺乳動物細胞，更優(yōu)選的實例包含源自人、小鼠、大鼠、倉鼠、猴或牛的細胞。所述哺乳動物細胞實例包括cos-ι細胞、293細胞和CHO細胞(CH0-K1、DG44、CH0 dhfr-、CH0-S)，然而，宿主細胞不限于這些。在本發(fā)明中，可以使用任何方法來將表達載體引入到宿主細胞中，只要所述方法允許引入的基因穩(wěn)定存在于宿主細胞并且在其中適當(dāng)?shù)乇磉_。通常使用的方法實例包括磷酸隹丐法(Ito 等，c (1984) Agric.Biol.Chem., 48, 341)、電穿孔法(Becker, D.Μ.等，1990; Methods.Enzymo1., 194, 182-187)、原生質(zhì)球法(Creggh 等，Mol.Cell.Biol.,5，3376 (1985))、乙酸鋰法(Itoh, H.(1983) J.Bacteriol.153，163-168)和脂轉(zhuǎn)染法。5.生產(chǎn)外源蛋白的方法
在本發(fā)明中，可通過以下方法來生產(chǎn)外源蛋白:培養(yǎng)上文條目“4”所述的轉(zhuǎn)化細胞，其中已經(jīng)通過已知方法使用上文條目“3”所述的載體引入編碼外源蛋白的基因；從所得培養(yǎng)產(chǎn)物中收集蛋白質(zhì)，接著純化蛋白。本文所用術(shù)語“培養(yǎng)產(chǎn)物”指除培養(yǎng)物上清液外還有培養(yǎng)細胞或細胞勻漿。附帶說一下，不僅可以選擇單體蛋白，還可以選擇多聚體蛋白作為可以使用上文條目“4”所述的轉(zhuǎn)化細胞生產(chǎn)的外源蛋白。在其中生產(chǎn)由多個不同亞基形成的異多聚體蛋白的情況中，必需分別將多個編碼這些亞基的基因引入到上文條目“4”所述的宿主細胞中。
可以按照培養(yǎng)宿主細胞的常規(guī)方法來實施培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞的方法。在其中轉(zhuǎn)化細胞為哺乳動物細胞的情況中，細胞在例如37°C和5%或8% CO2培養(yǎng)時間約24-1000小時的條件下培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)等在靜置、振搖、攪拌或通氣條件下進行培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^SDS-PSGE、Western分析、ELISA等從上述培養(yǎng)產(chǎn)物(培養(yǎng)液)中進行編碼外源蛋白的基因表達產(chǎn)物的確認。為了分離和純化生產(chǎn)的蛋白，可以使用常規(guī)蛋白分離和純化方法。在完成培養(yǎng)后，在細胞中生產(chǎn)靶蛋白的情況下，使用超聲勻漿器、弗氏壓碎器、Manton-Gaulin勻衆(zhòng)器、Dinomil等使細胞勻衆(zhòng)化，由此獲得祀蛋白。另外，在細胞外生產(chǎn)靶蛋白的情況下，使用培養(yǎng)液本身，或通過離心等方法去掉細胞。此后，用有機溶劑萃取等收集靶蛋白，然后可以通過使用以下技術(shù)來分離和純化收集的靶蛋白:例如各種色譜技術(shù)(疏水色譜法、反相色譜法、親和色譜法、離子交換色譜法等)、使用分子篩的凝膠過濾和使用聚丙烯酰胺凝膠電泳等等，它們可按照需要單獨或組合使用。上述培養(yǎng)方法和純化方法僅僅是實例，所述方法不限于此。可以通過已知的氨基酸分析技術(shù)例如使用Edman降解法的自動氨基酸序列測定,來確認純化的基因產(chǎn)物的氨基酸序列。6.生產(chǎn)抗體蛋白的方法
作為將使用上文條目“5”所述的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的異多聚體蛋白，可例示抗體蛋白?？贵w蛋白是包含兩個重鏈多肽分子和兩個輕鏈多肽分子的四聚體蛋白。因此，為了獲得保持抗原結(jié)合親和力狀態(tài)下的所述抗體蛋白，必需將重鏈和輕鏈基因兩者引入到上文條目“4”所述的轉(zhuǎn)化細胞。在這種情況下，重鏈和輕鏈基因表達單元可以存在于同一個表達載體或不同表達載體上。作為將在發(fā)明中生產(chǎn)的抗體，可例示通過用所期需抗原免疫諸如兔、小鼠或大鼠等實驗動物而制備的抗體。另外，亦可例示通過使用上述抗體作為起始材料獲得的嵌合抗體和人源化抗體作為本發(fā)明中將生產(chǎn)的抗體。另外，使用遺傳修飾動物或噬菌體展示方法獲得的人抗體也包括在本發(fā)明將生產(chǎn)的抗體中。將用于抗體生產(chǎn)的抗體基因不限于具有特異性多核苷酸序列的抗體基因，只要待從抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的重鏈多肽和輕鏈多肽的組合具有結(jié)合給定抗原蛋白的活性即可。另外，不必要的是，抗體基因編碼抗體全長分子，而可以使用編碼抗體功能片段的基因。所述編碼其功能片段的基因可以通過遺傳修飾編碼抗體蛋白全長分子的基因獲得。7.其它外源蛋白的生產(chǎn)方法
除上述抗體外，將使用本發(fā)明生產(chǎn)方法生產(chǎn)的外源蛋白的實例還包括:各種源于人或非人的蛋白、其功能片段及其修飾產(chǎn)物。所述蛋白等等的實例包括肽激素，例如心房鈉尿肽(ANP)、腦鈉素(BNP)、C型利鈉肽(CNP)、加壓素、生長抑素、生長激素(GH)、胰島素、催產(chǎn)素、生長素釋放肽、瘦蛋白、脂連蛋白、腎素、降鈣素、骨保護素和胰島素樣生長因子(IGF)；細胞因子類，例如白介素、趨化因子、干擾素、腫瘤壞死因子(例如TNF-α ,TNF-β和TNF超家族)、神經(jīng)生長因子類(例如NGF)、細胞生長因子類(例如EGF、FGF、PDGF, HGF和TGF)、造血生長因子類(例如CSF、G-CSF和紅細胞生成素)和脂肪因子(adipokine);受體，例如TNF受體；酶，例如溶菌酶、蛋白酶、蛋白水解酶和肽酶；其功能片段(具有原始蛋白部分或全部生物學(xué)功能的片段)；和包含這些蛋白中任何一種的融合蛋白。然而，所述蛋白不限于此。
實施例本發(fā)明在下文中將參考實施例進行具體描述。然而，這些實施例不限制本發(fā)明的技術(shù)范圍。本發(fā)明實施例中待使用的質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶、DNA修飾酶等等為市購產(chǎn)品，并且可以按照通用程序使用。另外，用于DNA克隆、多核苷酸序列測定、宿主細胞轉(zhuǎn)化、經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞的培養(yǎng)、從得到的培養(yǎng)產(chǎn)物中收集蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)純化等等的程序亦為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，或可參見文獻。實施例1 提取DNA元件
(1-1)使用抗-乙酰化組蛋白H3抗體的染色質(zhì)免疫沉淀
用EZ ChIP (Upstate)按照以下程序?qū)嵤┦褂每?乙?；M蛋白抗體的ChIP。順便說一下，除非另外指出，否則使用Upstate產(chǎn)品作為在以下程序中使用的抗體、緩沖液等等。首先，使用GIBCO (注冊商標(biāo))FreeStyleTM 293 培養(yǎng)基(Invitrogen)在 37°C和8% CO2條件下培養(yǎng)293F細胞(Invitrogen)，接著離心(1000 rpm, 5分鐘，室溫)，藉此收集生長期細胞。在含有1%甲醛的培養(yǎng)基中固定2 X IO7細胞10分鐘后，將IOx甘氨酸加入其中，接著室溫孵育5分鐘?！るx心(3000 rpm, 5分鐘，4°C)后，移除上清，加入PBS至細胞沉淀中以懸浮細胞。然后，再次離心細胞懸液以移除PBS，此后將SDS裂解緩沖液加入至細胞沉淀中以懸浮和裂解細胞。在超聲勻漿器(BRANSON)中對每個通過細胞裂解獲得的樣品進行DNA片段化，同時用冰水冷卻樣品，向其中加入含有蛋白酶抑制劑混合物和蛋白G-固定的瓊脂糖的稀釋緩沖液。在4°C讓得到的混合物旋轉(zhuǎn)I小時，接著離心，然后收集上清液。隨后，向其中加入10 μ g標(biāo)準(zhǔn)兔IgG或α -乙酰組蛋白Η3抗體，接著4°C旋轉(zhuǎn)過夜。向得到的溶液中加入G蛋白-固定的瓊脂糖，并且在4°C旋轉(zhuǎn)所得混合物I小時，接著離心，然后收集沉淀。用低鹽免疫復(fù)合洗漆緩沖液(Low Salt Immune Complex Wash Buffer)對由此獲得的沉淀洗滌兩次，用高鹽免疫復(fù)合洗滌緩沖液洗滌兩次，用LiCl免疫復(fù)合洗滌緩沖液洗滌兩次，最后用TE緩沖液洗滌4次。然后向其中加入洗脫緩沖液(含有20 μ I I M碳酸氫鈉、10 μ I SDS和170 μ I無菌水)。30分鐘后，離心混合物，收集上清液。隨后，將5 M氯化鈉加入上清液中，在65°C將所得混合物加熱過夜。然后向其中加入RNA酶A，37°C孵育所得混合物30分鐘。然后向其中加入0.5 M EDTAU M Tris-HCl和蛋白酶K，在45°C讓所得混合物孵育2小時。最后，向其中加入通過用蛋白酶K處理獲得的溶液的5倍量的試劑A、B和C，接著用旋轉(zhuǎn)過濾器(Spin filter)離心(10000 rpm, 30秒,室溫)，藉此純化染色質(zhì)-免疫沉淀的 DNA。(1-2)微陣列分析
通過使用GenomePlex全基因組擴增(WGA)試劑盒(Sigma),擴增在(1_1)中獲得的每個ChIP樣品。程序按照試劑盒附帶的Sigma方案進行。為了證實ChIP，通過使用320 ng由WGA擴增的每一種DNA作為模板，亦使用以下引物和 SYBR (注冊商標(biāo))預(yù)混 Ex Taq (Perfect Real Time) (TAKARA)，通過 PCR 方法擴增甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內(nèi)部基因(95°C 5秒和60°C 20秒x 45個循環(huán))。附帶說一下，GAPDH是待用作確定通過ChIP是否富集DNA元件的陽性對照的管家基因，并且用連接到EZ ChIP (Upstate)的引物來實施PCR方法。
5#-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’
S#-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3,如圖1所示，確定了 GAPDH在用抗-乙?；M蛋白H3抗體進行免疫沉淀的樣品中特異性擴增。對每個通過WGA擴增的DNA樣品進行微列陣分析(NimbleGen)以實施染色質(zhì)免疫沉淀芯片(ChlP-on-chip) </‘ΟιΙΡ-0η-(Λ ρ”是用于通過對在(1_丨)中富集的每個DNA進行微陣列分析來鑒別每個DNA元件的技術(shù)。(1-3)提取 DNA 元件
基于在(1-2)中獲得的ChlP-on-chip分析的結(jié)果，提取5個具有62%或更多AT含量的序列。A2:染色體 I5 (80966429-80974878)
A7:染色體 11 (88992123-89000542)
A18:染色體 4 (111275976-111284450)
B5:染色體 I (143034684-143043084)
C14:染色體 11 (46089056-46097482)
實施例2
用分泌性堿性磷酸酶(SEAP)表達作為DNA元件表達效果的指標(biāo) (2-1)構(gòu)建SEAP表達載體
通過使用PSEAP2-對照(Clontech)作為模板，由PCR方法(94°C 30秒和68°C 2分鐘X 40個循環(huán))使用以下引物和KOD-plus- (Τ0Υ0Β0)來擴增SEAP基因。
5r^AAAGCTAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC-3r
5r-AAAAGATCTTCATGTCTGCTCGAAGC GGCCGGCCGC-3,隨后通過瓊脂糖凝膠電泳分離擴增的SEAP片段并從凝膠切割，接著用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。將由此獲得的DNA片段用作插入片段。用限制性內(nèi)切酶NheI和BglII消化該插入片段，并且用限制性內(nèi)切酶NheI和BamHI消化載體pIRES hyg3(Clontech)。分別對得到的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳來分離靶片段，并且從凝膠切割靶片段，接著純化。然后，進行連接反應(yīng)和轉(zhuǎn)化。用LigaFast快速DNA連接體系(Promega)實施連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化如下進行。首先，解凍冷凍的感受態(tài)細胞JM109 (TAKARA)，并且將連接反應(yīng)后獲得的10 μ I溶液加入至解凍的細胞溶液，讓得到的混合物置于冰上30分鐘。此后，向混合物施用熱激(42°C，45秒)，讓混合物在冰上冷卻5分鐘。向該細胞懸液中加入Iml LB培養(yǎng)基，讓得到的混合物在37°C振搖I小時。然后，將混合物鋪板在含有0.1 mg/ml氨芐青霉素的LB平板上，讓該平板在37°C孵育14-16小時。此后，通過堿裂解，從LB平板培養(yǎng)的菌落收集靶質(zhì)粒。最后，測定通過堿裂解獲得的質(zhì)粒中的SEAP的多核苷酸序列，藉此構(gòu)建 pCMV/SEAP ires Hygro (2-2)克隆 DNA 元件
隨后，用來自含有對應(yīng)于各DNA元件的多核苷酸序列的細菌人造染色體(BAC)的BAC亞克隆試劑盒(Gene Bridges)，將在實施例1中提取的各DNA元件克隆至(2_1)中獲得的SEAP表達載體。首先，用限制性內(nèi)切酶SpeI消化(2-1)中獲得的pCMV/SEAP ires Hygro數(shù)小時，接著乙醇沉淀，用無菌水溶解沉淀。通過使用經(jīng)SpeI消化的載體作為模板，使用以下引物和 KOD-plus- (TOYOBO)實施 PCR 方法(94°C 15 秒、55°C 30 秒和 68°C 10 分鐘 x 30 個循環(huán))。
權(quán)利要求
1.由序列表中的SEQID NO:1代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。
2.由序列表中的SEQID NO: 2代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。
3.由序列表中的SEQID N0:3代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。
4.由序列表中的SEQID NO: 4代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。
5.由序列表中的SEQID NO: 5代表的多核苷酸序列組成的多核苷酸。
6.包含由序列表中的SEQID NO: 1-5中任一個所代表的多核苷酸序列的至少3000個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
7.包含由序列表中的SEQID NO: 1-5中任一個所代表的多核苷酸序列的至少2000個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
8.包含由序列表中的SEQID NO: 1-5中任一個所代表的多核苷酸序列的至少1500個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
9.由與權(quán)利要求1-8中任一項的多核苷酸的多核苷酸序列具有95%或更高同源性的多核苷酸序列組成的多核苷酸。
10.由與權(quán)利要求1-8中任一項的多核苷酸的多核苷酸序列具有99%或更高同源性的多核苷酸序列組成的多核苷酸。
11.由多核苷酸序列組成的多核苷酸，所述多核苷酸序列含有權(quán)利要求1-10中任一項的多核苷酸的多核苷酸序 列的兩種或多種序列。
12.由兩種或多種類型的選自權(quán)利要求1-10中任一項的多核苷酸的多核苷酸組成的多核苷酸。
13.包含權(quán)利要求1-12中任一項的多核苷酸的多核苷酸序列的外源基因表達載體。
14.權(quán)利要求13的外源基因表達載體，其中由所述外源基因編碼的蛋白是多聚體蛋白。
15.權(quán)利要求13的外源基因表達載體，其中由所述外源基因編碼的蛋白是異多聚體蛋白。
16.權(quán)利要求15的外源基因表達載體，其中由所述外源基因編碼的蛋白是抗體或其功能片段。
17.轉(zhuǎn)化細胞，其中已引入權(quán)利要求13-16中任一項的外源基因表達載體。
18.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述細胞為源自哺乳動物的培養(yǎng)細胞。
19.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述源自哺乳動物的培養(yǎng)細胞為選自COS-1細胞、293細胞和CHO細胞的細胞。
20.權(quán)利要求17-19中任一項的轉(zhuǎn)化細胞，其中由所述外源基因編碼的蛋白是多聚體蛋白。
21.權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)化細胞，其中由所述外源基因編碼的蛋白是異多聚體蛋白。
22.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)化細胞，其中由所述外源基因編碼的蛋白是抗體或其功能片段。
23.用于生產(chǎn)蛋白的方法，所述方法特征在于包括培養(yǎng)權(quán)利要求17-22中任一項的轉(zhuǎn)化細胞，并從得到的培養(yǎng)產(chǎn)物中獲得由所述外源基因編碼的蛋白。
24.用于在已引入外源基因或外源基因表達載體的轉(zhuǎn)化細胞中提高外源基因表達的方法，所述方法特征在于使用權(quán)利要求1-12中任一項的多核苷酸或權(quán)利要求13-16中任一項的外源基因表達載體。
25.權(quán)利要求1-12中任一項的多核苷酸用于在轉(zhuǎn)化細胞中提高外源基因表達的用 途。
全文摘要
公開了使用新穎的DNA元件在哺乳動物細胞中穩(wěn)定獲得外源基因的高表達的方法。更特別地，公開了通過改變已引入外源基因表達單元的基因位點周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來增強轉(zhuǎn)錄激活的DNA元件。
文檔編號C12N15/85GK103080321SQ201180043099
公開日2013年5月1日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者西宮大祐, 井上龍也 申請人:第一三共株式會社