專利名稱：用于調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白CD11b/CD18的化合物和方法
用于調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白CD11b/CD18的化合物和方法
背景技術(shù)：
1.技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及用不同的作用劑激活整聯(lián)蛋白CDllb/CD18。本發(fā)明還涉及治療炎性疾病。2.
背景技術(shù)：
整聯(lián)蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞粘附、遷移和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的非共價(jià)連接的α/β異二聚體受體。整聯(lián)蛋白連同其配體在包括發(fā)育、止血、炎癥和免疫在內(nèi)的許多過程中，以及在癌癥侵襲和心血管疾病等病理情況中起重要作用。白細(xì)胞遷移和募集在其對損傷和感染的正常免疫應(yīng)答及在各種炎性病癥和自身免疫性疾病中是必不可少的[I]。白細(xì)胞功能受β 2整聯(lián)蛋白(包括高表達(dá)的整聯(lián)蛋白⑶I Ib/⑶18 (亦稱Mac-1、CR3和0]\^2))調(diào)節(jié)[2]。^1化/^18尤其識(shí)別作為配體的互補(bǔ)片段iC3b、血纖蛋白原和ICAM-1。許多炎性疾病和自身免疫性疾病，例如缺血再灌注損傷(包括急性腎衰竭和動(dòng)脈粥樣硬化)、組織損傷、中風(fēng)、響應(yīng)于血管損傷的新內(nèi)膜增厚和炎癥過程消退[3-7]，都涉及CDllb/CD18。白細(xì)胞β 2整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)腫瘤浸潤。在響應(yīng)損傷或感染時(shí)，白細(xì)胞被募集到它們在其中參與免疫清除的組織中[2]。腫瘤還分泌募集CDllb+骨髓細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子以利于新血管形成[8]。β 2整聯(lián)蛋白，一種具有共同的β-亞基(β2、⑶18)但完全不同的α-亞基(⑶11a、⑶lib、⑶Ilc和⑶Ild [9])的α/β異二聚體整聯(lián)蛋白受體的亞家族，是白細(xì)胞特異性受體[10]。白細(xì)胞中兩種主要β 2整聯(lián)蛋白之一的整聯(lián)蛋白⑶Ilb/⑶18，介導(dǎo)白細(xì)胞與其多種配體(數(shù)目>30)結(jié)合，并介導(dǎo)白細(xì)胞遷移和募集進(jìn)入發(fā)炎組織[1，11]。在癌癥治療期間，受照射治療的腫瘤募集眾多特定的白細(xì)胞、表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(ΜΜΡ-9)的骨髓衍生CDllb+骨髓細(xì)胞，所述基質(zhì)金屬蛋白酶-9恢復(fù)腫瘤血管系統(tǒng)，允許腫瘤再生長和復(fù)發(fā)[12]。最近的研究表明，在小鼠中，用CDllb拮抗劑(抗CDllb抗體)治療降低CDllb+骨髓細(xì)胞浸潤，提高腫瘤對放射的反應(yīng)[12]。炎性白細(xì)胞加重抗GBM腎炎。小鼠實(shí)驗(yàn)性抗GBM腎炎是急進(jìn)性腎小球腎炎的模型，特征在于蛋白尿、白細(xì)胞浸潤和腎小球新月體形成[13，14]。白細(xì)胞在抗GBM腎炎的發(fā)病機(jī)制中起決定性作用，其數(shù)目與新月形腎小球的百分比有關(guān)。CDllb-/-動(dòng)物無蛋白尿(PiOteinurea)，對腎功能具有強(qiáng)大的保護(hù)[15]，表明了靶向這種整聯(lián)蛋白的作用劑具有治療這種疾病的潛力。除了增加細(xì)胞粘附和調(diào)節(jié)遷移以外，CDllb/CD18活化介導(dǎo)許多胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，包括骨髓細(xì)胞中活性氧類別的產(chǎn)生和許多促炎和抗炎基因的調(diào)節(jié)[16-21]。整聯(lián)蛋白活化和配體結(jié)合導(dǎo)致其在細(xì)胞表面聚集，并啟動(dòng)由外到內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括PI3-K/Akt和MAPK/ERK1/2途徑的活化[17，22]，從而在大多數(shù)細(xì)胞中模擬貼壁依賴性促存活信號。⑶Ilb/⑶18的連接和聚集還通過其它受體(例如Toll樣受體(TLR)和細(xì)胞因子受體白介素-1受體(IL-1R)和TNFR)協(xié)同加強(qiáng)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且兩者誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(例如IL-1 β、IL-6、TNF- α )的NF-κ B依賴性表達(dá)以及其它因子(例如組織因子)的釋放。⑶IIb/⑶18缺乏提高TLR4觸發(fā)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這就表明⑶IIb/⑶18可能具有保護(hù)作用，并且可負(fù)調(diào)節(jié)白細(xì)胞的促炎途徑(1-3)。
因此，調(diào)節(jié)⑶llb/⑶18功能的作用劑作為治療各種炎性病況的治療劑有重大潛力。⑶IIb/⑶18在循環(huán)白細(xì)胞中和在許多其它細(xì)胞中以組成型無活性構(gòu)象正常表達(dá)，但被快速激活以介導(dǎo)炎癥部位的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞粘附、遷移和蓄積[23]。CDllb/CD18還在其它細(xì)胞類型和組織上表達(dá)，包括小膠質(zhì)細(xì)胞(miciOgila)、肝細(xì)胞及T細(xì)胞和B細(xì)胞亞型。實(shí)際上，在許多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，用抗體和配體模擬物阻斷CDllb/CD18及其配體(抗粘附療法)[24-26]和⑶Ilb或⑶18的遺傳消除在體內(nèi)降低炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度[27，28]。然而，這類阻滯劑在治療人的炎性疾病/自身免疫性疾病時(shí)很少成功[28，29]，可能是因?yàn)橛捎诖蟮目蓜?dòng)員的胞內(nèi)⑶Ilb/⑶18庫的可得性所致，難以用抗體完全阻斷⑶Ilb/⑶18 [30，31]，或者因?yàn)橛米铚┮种瓢准?xì)胞募集需要占據(jù)活性整聯(lián)蛋白受體的>90% [32]。抗整聯(lián)蛋白β 2抗體還具有意料不到的副作用[33]。此外，正如用活化劑治療所預(yù)期的體內(nèi)部分天然整聯(lián)蛋白受體的短暫活化是否可在生理相關(guān)環(huán)境下具有任何重大的生物作用仍是個(gè)有爭議的問題。因此，需要選擇性調(diào)節(jié)包括整聯(lián)蛋白⑶I Ia/⑶18、⑶I Ib/⑶18和⑶I Ic/⑶18在內(nèi)的β 2整聯(lián)蛋白的配體結(jié)合和功能的新作用劑，例如抗體、蛋白質(zhì)、肽、化合物和小分子。此夕卜，需要通過靶向或結(jié)合整聯(lián)蛋白上的變構(gòu)調(diào)節(jié)部位(例如⑶Ilb/⑶18中的異亮氨酸疏水部位(SILEN)袋(hydroph obic site-for-1 so leucine (SILEN) pocket))而非配體結(jié)合部位，而激活整聯(lián)蛋白的作用劑(激動(dòng)劑)。因此，需要不阻斷整聯(lián)蛋白的配體結(jié)合功能的整聯(lián)蛋白活化劑。此外，十分需要提高或促進(jìn)整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附和細(xì)胞功能的作用劑和方法。然而，有關(guān)鑒定這類激動(dòng)劑的進(jìn)展緩慢，尤其選擇性靶向和激活β2整聯(lián)蛋白(包括⑶Ilb/⑶18)的激動(dòng)劑，只有少數(shù)已報(bào)道的發(fā)現(xiàn)[34，35]。本發(fā)明描述了包括整聯(lián)蛋白CDllb/CD18活化而不是其阻斷的新的方法，作為調(diào)節(jié)CDllb/CD18以及細(xì)胞(例如白細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)的功能(包括其遷移、募集和其它生物功能)的策略。這類生物功能包括效應(yīng)分子例如細(xì)胞因子的產(chǎn)生。制訂了這樣的策略:容易體內(nèi)遞送并且可容易優(yōu)化以用于不同的哺乳動(dòng)物的各種作用劑(例如小分子)，會(huì)是用于激活整聯(lián)蛋白的最佳方法。本文表明，可通過用新的小分子激活⑶Ilb/⑶18而減少炎性疾病(但不限于此疾病)。這就表明了整聯(lián)蛋白活化是治療各種炎性疾病和自身免疫性疾病和病況(但不限于這些疾病)的新的有用的藥理學(xué)上可命中目標(biāo)的方法。本發(fā)明描述了新的策略，作為文獻(xiàn)中目前已實(shí)踐的抗粘附策略的備選方法，用于調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白和表達(dá)整聯(lián)蛋白的細(xì)胞的生物功能。許多不同類型的作用劑可激活整聯(lián)蛋白，例如生物制劑、抗體、抗體片段、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、寡核苷酸和化合物。對調(diào)節(jié)β 2整聯(lián)蛋白(包括⑶IIb/⑶18)有用的激動(dòng)劑和組合組的重要要求是，它們不會(huì)負(fù)面影響細(xì)胞、組織和動(dòng)物存活力。描述這類激動(dòng)劑、組合物和方法是本發(fā)明的一個(gè)目的。另外，本發(fā)明的一個(gè)目的是表明正如用本發(fā)明的激動(dòng)劑和方法治療所預(yù)期的一部分天然受體體內(nèi)的短暫活化在生理學(xué)相關(guān)模型系統(tǒng)中具有生物作用。另外，本發(fā)明提供其它相關(guān)優(yōu)勢。發(fā)明概述
本發(fā)明提供包括有效量的β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑和藥學(xué)上可接受的載體的β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑的藥物制劑。本發(fā)明提供通過使β 2整聯(lián)蛋白與β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑相互作用而激活β 2整聯(lián)蛋白的方法。本發(fā)明還提供通過給予有效量的β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑，并激活β 2整聯(lián)蛋白而治療患者的方法。本發(fā)明提供通過將β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑給予炎癥患者，激活β 2整聯(lián)蛋白并減輕炎癥而治療炎癥的方法。本發(fā)明還提供通過將β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑給予患者，并激活β 2整聯(lián)蛋白而治療和/或預(yù)防腎缺血再灌注(Ι/R)損傷的方法。本發(fā)明提供通過在插入裝置(例如支架)之前給予β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑，并激活β 2整聯(lián)蛋白而減少患者的再狹窄的方法。本發(fā)明提供通過給予用β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑涂覆的裝置(例如支架)，并激活β 2整聯(lián)蛋白而減少患者的再狹窄的方法。本發(fā)明還提供通過鑒定β 2整聯(lián)蛋白中調(diào)節(jié)β 2整聯(lián)蛋白的活性的部位、確定結(jié)合袋的精確三維結(jié)構(gòu)和鑒定可與結(jié)合袋相互作用的小分子而進(jìn)行用于鑒定β 2整聯(lián)蛋白的小分子調(diào)節(jié)劑的測定的方法。本發(fā)明提供通過給予β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑、檢測β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑與β 2整聯(lián)蛋白的結(jié)合和證實(shí)疾病的存在而檢測患者的疾病的方法。本發(fā)明還提供通過給予有效量的β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑，并激活β 2整聯(lián)蛋白而改善患者總體健康狀態(tài)的方法。附圖描述
容易掌握本發(fā)明的其它優(yōu)勢，因?yàn)楫?dāng)結(jié)合附圖考慮時(shí)，通過參考下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它優(yōu)勢變得更好地理解，其 中:


圖1Α-1Ι表示Ieukadherin增加CDllb/CD18依賴性細(xì)胞粘附，IA表示LA1、LA2、LA3和LA-C的化學(xué)結(jié)構(gòu)；1B-1E顯示劑量反應(yīng)曲線，顯示在遞增量的LA1、LA2、LA3和LA-C存在下粘附至固定化Fg的輸入K562⑶Ilb/⑶18 (實(shí)心園)和K562 (空心圓)細(xì)胞的百分比；IF顯示直方圖，顯示在阻斷抗體IB4和44a不存在或存在時(shí)LA1-3誘導(dǎo)的K562⑶I Ib/⑶18與Fg粘附，還顯示了在生理Ca2+和Mg2+離子(Con)存在下和在有已知激動(dòng)劑Mn2+時(shí)的粘附的參照水平。所示數(shù)據(jù)為平均值+SEM ;1G顯示了顯示與粘附的基礎(chǔ)水平(Con)相比，在LA1-3不存在(DMSO)或存在時(shí)WT (⑶Ilb+/+)和⑶Ilb-/-嗜中性粒細(xì)胞與固定化Fg粘附的直方圖，所示數(shù)據(jù)為平均值+SEM ;1H顯示直方圖，顯示在阻斷抗體(IB4，44a)不存在或存在時(shí)LA1-3誘導(dǎo)的K562 E320A細(xì)胞與固定化Fg的結(jié)合，還顯示了在有Ca2+和Mg2+離子(Con)和Mn2+的情況下K562 E320A粘附的參照水平，所示數(shù)據(jù)為平均值+SEM ;II顯示直方圖，顯示在LAl和LA2不存在(DMSO)或存在時(shí)重組GST-a A-結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體與固定化Fg的結(jié)合，還顯示了在任何蛋白質(zhì)不存在時(shí)(-)或僅有GST構(gòu)建體(GST)時(shí)所獲得的背景信號，所示數(shù)據(jù)為平均值+SEM;
圖2Α-2Ι表示Ieukadherin影響細(xì)胞遷移。圖2Α.軌跡圖顯示在響應(yīng)/MLP梯度時(shí)和在化合物L(fēng)A1、LA2和LA3不存在(DMSO)或存在時(shí)，在Zigmond室中遷移性WT嗜中性粒細(xì)胞的分析(>50個(gè)細(xì)胞/條件，來自>3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)/條件)。還顯示了在不同時(shí)間點(diǎn)來自縮時(shí)視像顯微術(shù)的代表性細(xì)胞圖像。比例尺表示25微米(microm) ;2B_2E表示顯示Ieukadherin對細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的作用的平均位移(2B)、平均速度(2C)、方向持續(xù)性(2D)和平均位移平方圖(2E)的定量分析。線條表示平均值土SEM。*** p〈0.0OOl ;2F表示在響應(yīng)/MLP時(shí)和在LAULA2和LA3不存在(DMSO)或存在下趨化性WT嗜中性粒細(xì)胞中的CDllb定位的熒光圖像。顯示了針對CDllb (綠色)和F-肌動(dòng)蛋白(紅色)染色的遷移性嗜中性粒細(xì)胞的代表性共焦相差圖像。比例尺表示5微米；2G-2I表示THP-1細(xì)胞跨越HUVEC層的跨內(nèi)皮遷移。2G.顯示在LAl不存在(DMSO)或存在下在響應(yīng)趨化因子MCP-1梯度時(shí)跨越TNFa刺激的HUVEC層(紅色)遷移的THP-1細(xì)胞(綠色)的代表性共焦圖像(IOX)。2H.顯示粘附至HUVEC的THP-1的定量測定的直方圖。21.顯示遷移的THP-1細(xì)胞的定量測定的直方圖。所示數(shù)據(jù)為平均值+SEM0林* p<0.0001 ；
圖3A-3L表示Ieukadherin體內(nèi)降低白細(xì)胞的炎性募集,且體內(nèi)保護(hù)器官功能。3A-3B是柱狀圖，顯示在腹膜內(nèi)注射巰基乙酸鹽后4小時(shí)來自不同治療組(僅巰基乙酸鹽或在給予溶媒(C)、LAU LA2或LA3后的巰基乙酸鹽注射)的WT (A)或⑶Ilb+⑶小鼠腹膜液中嗜中性粒細(xì)胞的總數(shù)。鹽水注射用作對照(η = 4-9只/組)，所示數(shù)據(jù)為平均值土SEM。*p < 0.05，**ρ < 0.001,#*ρ < 0.0001，ns=不顯著(單因素方差分析)。3C.顯示在 LAl不存在(黑色實(shí)心正方形)或存在(紅色空心圓)下，在巰基乙酸鹽注射后4小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)WT動(dòng)物腹膜液中嗜中性粒細(xì)胞數(shù)的曲線圖。還顯示了無巰基乙酸鹽注射時(shí)的腹膜嗜中性粒細(xì)胞(黑色空心正方形)。**Ρ < 0.001, ***ρ < 0.0001, ns=不顯著。3D.顯示在沒有(-Thio)或有巰基乙酸鹽誘發(fā)性炎癥(+Thio)的WT小鼠(n=3只/組)用DMSO或LAl治療后4小時(shí)在不同器官中檢出的嗜中性粒細(xì)胞比率的柱狀圖。BM表示骨髓；LI，肝；SP,J# ;LU，肺;H，心臟;AM，腹?。籔，胰腺;B0，腸;K，腎。所示數(shù)據(jù)為平均值+SD0 3E-F.用溶媒(DMSO)或LAl治療的大鼠中球囊損傷后21天動(dòng)脈的代表性顯微照片。箭頭表示新內(nèi)膜增厚的位置。3G-H.用DMSO或LAl治療的大鼠中球囊損傷后3天代表性動(dòng)脈的顯微照片。箭頭表示⑶68+巨噬細(xì)胞所處位置。1.顯示通過對DMSO或LAl治療的大鼠(η=7_9只/組)受損動(dòng)脈的形態(tài)測量分析所確定的新內(nèi)膜與中膜之比的柱狀圖。所示數(shù)據(jù)為平均值土SEM。*ρ〈0.05。J.顯示DMSO或LAl治療的大鼠(n=12只/組)的受損動(dòng)脈(損傷后3天)中巨噬細(xì)胞浸潤物的定量測定的柱狀圖。所示數(shù)據(jù)為平均值土SEM。< 0.0001。3K-L.顯示與拮抗劑M1/70相比激動(dòng)劑LAl更好地改善腎損傷的曲線圖。3K.顯示在不同時(shí)間點(diǎn)未治療(鹽水)、拮抗 劑(Μ1/70)治療和LAl治療小鼠的腎小球嗜中性粒細(xì)胞數(shù)的曲線圖(η=3-4只/組，第O天時(shí)間點(diǎn)除外，其中η=2)。所示數(shù)據(jù)為平均值土SEM。*p < 0.05。3K.標(biāo)繪在不同時(shí)間點(diǎn)在未治療(鹽水)、拮抗劑(Μ1/70)治療和LAl治療小鼠中測量的蛋白尿的曲線圖(η=3-8只/組，第O天時(shí)間點(diǎn)除外，其中η=2)。所示數(shù)據(jù)為平均值土SEM。
< 0.05ο圖4A-4F表示炎性嗜中性粒細(xì)胞募集的阻斷可通過除去Ieukadherin而逆轉(zhuǎn)，4Α表示斑馬魚尾鰭損傷模型；4B-4C是在沒有損傷(4B)和有損傷(4C)的情況下3dpf幼體尾的顯微照片(左)和熒光圖像(右)，用溶媒(DMSO)、LA1和LA2治療的斑馬魚的代表性圖像表示嗜中性粒細(xì)胞(綠色)在尾部蓄積；4D是柱狀圖，顯示用溶媒(對照)、LAl和LA2治療的斑馬魚幼體中尾鰭損傷部位附近的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)的定量測定(η = 12-16條斑馬魚幼體/組)，所示數(shù)據(jù)為平均值+SEM。***ρ〈0.0001 (單因素方差分析)；4Ε表示幼體尾的代表性顯微照片(左)和熒光圖像(右)，顯示在除去化合物L(fēng)Al和LA2后4小時(shí)嗜中性粒細(xì)胞(綠色)在尾部的畜積；4F是柱狀圖，顯不在除去LAl和LA2后4小時(shí)尾轄損傷部位附近的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)的定量測定(η = 8-12條幼體/組)。所示數(shù)據(jù)為平均值+SEM。ns=不顯著(單因素方差分析)；
圖5表不Ieukadherin不影響表面CDllb/CD18表達(dá)，F(xiàn)ACS分析使用mAb IB4和44a(黑色)和同種型IgG2a對照mAb (灰色)，顯示在活的K562⑶IIb/⑶18表面上⑶IIb/CD18表達(dá)的水平，所示數(shù)據(jù)為至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)；
圖6表示Ieukadherin不從內(nèi)部貯庫中動(dòng)員⑶Ilb/⑶18，并且不影響人嗜中性粒細(xì)胞上的表面⑶IIb/⑶18表達(dá)。FACS分析使用mAb IB4 (黑色)和同種型IgG2a對照mAb (灰色)，顯示在活的人嗜中性粒細(xì)胞表面上的CDllb/CD18表達(dá)的水平。將嗜中性粒細(xì)胞在溶媒(DMSO)、PMA, LPS或Ieukadherin LA 1-3存在下與抗體一起溫育，并按方法部分中的描述進(jìn)行分析。所示數(shù)據(jù)是2-3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)表明，雖然嗜中性粒細(xì)胞用LPS和PMA活化導(dǎo)致⑶IIb /⑶18的表面表達(dá)有預(yù)期的增加，但是Ieukadherin處理不會(huì)導(dǎo)致⑶IIb/⑶18表面表達(dá)的任何增加；
圖7A-7C表示Ieukadherin是真實(shí)的激動(dòng)劑，并且在激動(dòng)劑Mn2+離子存在下不抑制細(xì)胞粘附。A-C.顯示在激動(dòng)劑Mn2+離子(ImM)存在下且在增量的LAl (A)、LA2 (B)和LA3(C)存在下粘附至固定化Fg的輸入K562⑶Ilb/⑶18細(xì)胞的百分比的劑量反應(yīng)曲線。所示數(shù)據(jù)為3個(gè)獨(dú)立孔的平均值土 SEM，并且是至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)；
圖8A-8C表示Ieukadherin依賴性⑶IIb/⑶18活化不依賴于配體類型。A-C.Leukadherin以劑量依賴性方式提高⑶IIb/⑶18與iC3b的結(jié)合。劑量反應(yīng)曲線顯示在增量的LAl (A)、LA2 (B)和LA3 (C)存在下，粘附至固定化iC3b的輸入K562 CDllb/CD18細(xì)胞的百分比。所示數(shù)據(jù)為6個(gè)獨(dú)立孔的平均值土 SEM，并且是至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)；
圖9表不Ieukadherin依賴性CDllb/CD18活化不依賴于配體類型。Leukadherin提高⑶Ilb/⑶18與ICAM-1的結(jié)合。直方圖顯示在僅緩沖液(含有Ca2+和Mg2+離子各ImM)或leukadherin LAU LA2或LA3存在下粘附至固定化ICAM-1的K562 CDllb/CD18細(xì)胞的相對結(jié)合(表示為輸入細(xì)胞的百分比)。所示數(shù)據(jù)為6-9個(gè)獨(dú)立孔的平均值土 SEM，并且是至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。*** P < 0.0001 ；
圖10A-10C表示leukadherin依賴性⑶IIb/⑶18活化不依賴于細(xì)胞類型。A-C.Leukadherin以劑量依賴性方式提高THP-1細(xì)胞與Fg的結(jié)合。劑量反應(yīng)曲線顯示在增量的LAl (A)、LA2 (B)和LA3 (C)存在下輸入THP-1細(xì)胞粘附至固定化Fg的百分比。所示數(shù)據(jù)為6個(gè)獨(dú)立孔的平均值土 SEM，并且是至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)；
圖11表示leukadherin增加K562細(xì)胞與iC3b調(diào)理的RBC的結(jié)合。直方圖顯示在EDTA(10 mM)、對照(Ca2+ 和 Mg2+ 離子各 ImM)、激活 Mn2+ 離子(ImM)或 leukadherin LA 1-3 存在下iC3b調(diào)理的綿羊紅細(xì)胞(RBC) (EiC3b)與表達(dá)⑶I Ib/⑶18的K562細(xì)胞的相對結(jié)合，其表示為顯示玫瑰花結(jié)(rosette)的總細(xì)胞的百分比。各直方圖表示代表性實(shí)驗(yàn)(所進(jìn)行的三分之一)一式三份測定的平均值土SEM。P < 0.0001。由于⑶llb/⑶18也是已知的吞噬受體，因此這些結(jié)果表明LA1-3還增量調(diào)節(jié)⑶IIb/⑶18的吞噬功能；
圖12A-12E是顯示⑶IIb A結(jié)構(gòu)域的活化敏感區(qū)中LA1-3結(jié)合的計(jì)算模型的動(dòng)畫圖，12A和12C表示呈其開放式構(gòu)象(銅色帶狀物)的a A-結(jié)構(gòu)域的模型，顯示了活化敏感性F-a7區(qū)中LAl (綠色棒狀模型)和LA2 (藍(lán)色棒狀模型)的?？?，MIDAS部位的金屬離子用灰色球體表示；12E表示呈其開放式構(gòu)象(藍(lán)色帶狀物)的αΑ-結(jié)構(gòu)域的模型，顯示了活化敏感性F- α 7區(qū)中的LA3 (黃色棒狀模型)的?？俊Ｅc用LA3樣化合物(12Ε)的研究一致，發(fā)現(xiàn)leukadherin LAl和LA2定向使得其大多數(shù)疏水部分與螺旋α 7和α I與F鏈之間的疏水袋相互作用，形成結(jié)合袋的疏水殘基(突出顯示)包括α 7 Leu305、Ile308和Leu312、α I Phel56、V160、Leul64、F 鏈 Tyr267、Ile269 以及包括 Ile236、Val238、Ilel35、Phel37、Phel71的其它疏水袋殘基,leukadherin化合物的親水羧酸部分遠(yuǎn)離可能與Lysl66和/或Lysl68形成離子相互作用的疏水袋定向；12B表示停靠結(jié)構(gòu)(12A) a A-結(jié)構(gòu)域(銅色帶狀物)的活化敏感性F-a 7區(qū)的放大圖，兩張圖相對彼此旋轉(zhuǎn)90°，活化敏感性疏水區(qū)的相互作用殘基表示為銅色棒狀物并作標(biāo)記，短劃線突出顯示LAl和a A結(jié)構(gòu)域之間可能的氫鍵相互作用；12D表示?？拷Y(jié)構(gòu)(12B) αΑ-結(jié)構(gòu)域(銅色帶狀物)的活化敏感性F_a7區(qū)的放大圖，兩張圖相對彼此旋轉(zhuǎn)90°，活化敏感性疏水區(qū)的相互作用殘基表示為銅色棒狀物并作標(biāo)記，短劃線突出顯示LA2和a A結(jié)構(gòu)域之間可能的氫鍵相互作用；
圖13表示leukadherin激活 活的K562細(xì)胞中的全長整聯(lián)蛋白⑶Ilb/⑶18。FACS分析顯示在不存在(Ca，Mg，暗灰色直方圖)或存在激動(dòng)劑LAl (紅色直方圖)或Mn2+離子(藍(lán)色直方圖)時(shí)活化敏感性抗體mAb 24與細(xì)胞表面表達(dá)的CDllb/CD18的反應(yīng)性。在不存在(Ca，Mg)和存在LAl (黑色直方圖)時(shí)使用mAb IB4對⑶Ilb/⑶18表面表達(dá)的水平進(jìn)行分析，其表明總的⑶Ilb/⑶18表面表達(dá)無差異。還顯示了被同種型對照mAb結(jié)合(淺灰色)。所示數(shù)據(jù)為至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表明在LAl存在下mAb24與CDllb/CD18的反應(yīng)性明顯增加至之前用組成型活性CDllb/CD18觀察到的水平；
圖14表示與MB-10相比leukadherin對⑶IIb/⑶18顯示較高親和力。劑量反應(yīng)曲線顯示在增量的LAl和MB-10 (4)存在下粘附至固定化Fg的輸入K562⑶Ilb/⑶18細(xì)胞的百分比，其中EC5tl值對于LAl為4 mM，對于MB-10則>50 mM。所示數(shù)據(jù)為6個(gè)獨(dú)立孔的平均值土 SEM，并且是至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)；
圖15A-15E表示體外leukadherin不影響3D凝膠中的嗜中性粒細(xì)胞遷移。A.來自對在leukadherin LAl不存在(DMSO)或存在下于3D膠原凝膠中向/MLP梯度遷移的WT B6嗜中性粒細(xì)胞成像的不同縮時(shí)系列的定格圖像。還提供來自各影片的40個(gè)單個(gè)細(xì)胞在45分鐘時(shí)間內(nèi)的遷移軌跡。B-E.還提供了各種條件的至少40個(gè)嗜中性粒細(xì)胞的定量分析，但在45分鐘錄像期的細(xì)胞總位移(B)、遷移速度(C)和曲流指數(shù)(meandring index) (D)未顯示顯著差異。此外，位移平方與時(shí)間的平方根的曲線圖(E)顯示兩種條件下的定向細(xì)胞遷移；
圖16A-16D表示體外leukadherin沒有細(xì)胞毒性，在增量的LAl (16A)、LA2 (16B)、LA3(16C)和LA-C (16D)存在下將K562 CDllb/CD18細(xì)胞在37°C下溫育，24小時(shí)后測定活細(xì)胞數(shù)，所示數(shù)據(jù)為一式三份進(jìn)行的測定的平均值+SEM，并且是至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)；
圖17A-17C表示體外leukadherin對嗜中性粒細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。在增量的LAl (A)、LA2⑶和LA3 (C)存在下將WT B6嗜中性粒細(xì)胞在37°C下溫育，在總共4小時(shí)溫育后，用MTS試劑測定活細(xì)胞數(shù)。所示數(shù)據(jù)為一式三份進(jìn)行的測定的平均值土SEM，并且是至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。結(jié)果清楚表明，這些化合物在高達(dá)50微摩的濃度下對原代嗜中性粒細(xì)胞都無毒性。
圖18A-18B表示⑶Ilb在K562⑶I Ib/⑶18細(xì)胞表面聚集的熒光圖像，表明leukadherin不誘導(dǎo)整聯(lián)蛋白聚集和由外到內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。整聯(lián)蛋白活化和配體結(jié)合導(dǎo)致整聯(lián)蛋白在細(xì)胞表面聚集，并啟動(dòng)由外到內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(5，6)。由于LA1-3結(jié)合并激活CDllb/CD18，所以可以想像僅這類結(jié)合便可引發(fā)整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的由外到內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此模擬細(xì)胞的配體結(jié)合的整聯(lián)蛋白狀態(tài)，這可能對白細(xì)胞壽命和功能具有重大意義。為了測試，我們使用共焦顯微術(shù)用于對細(xì)胞表面的CDllb/CD18聚集進(jìn)行成像(5)。A-B.在配體Fg不存在(A)或存在(B)時(shí)，將細(xì)胞懸液與DMS0、LA1、LA2或LA3溫育。顯示了針對⑶Ilb(綠色)染色的細(xì)胞的代表性熒光和DIC圖像。還顯示了用ImageJ進(jìn)行分析的選定細(xì)胞的CDllb熒光強(qiáng)度的3D圖示。比例尺表示20 mm。細(xì)胞在配體不存在時(shí)顯示無可測出的Q)llb/a)18大量聚集(macro clustering) (A, DMSO),但在加入外源Fg時(shí)顯示高度聚集(B，DMS0)。同樣地，用LA1-3進(jìn)行的處理只在加入外部Fg時(shí)顯示整聯(lián)蛋白大量聚集，這就表明LA1-3不是整聯(lián)蛋白配體模擬物；
圖19表示leukadherin不誘導(dǎo)⑶Ilb/⑶18介導(dǎo)的由外到內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。整聯(lián)蛋白活化和配體結(jié)合還啟動(dòng)由外到內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(包括P38促分裂原活化蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)途徑(5，6)的活化)，從而在大多數(shù)細(xì)胞中模擬貼壁依賴性促存活信號(7)。此外，其在加強(qiáng)促炎NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中與炎性刺激物一起協(xié)同作用(8-10)。另外，雖然已知的CDllb/CD18激動(dòng)劑Mn2+(Il)和激活性mAb (12)及其配體(5)誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化，但來自表達(dá)突變型組成型活性整聯(lián)蛋白的敲入動(dòng)物的細(xì)胞不誘導(dǎo)所述磷酸化(13)。為了檢查LA1-3的作用，我們對LA1-3處理細(xì)胞中的ERK1/2磷酸化進(jìn)行了分析。將K562CD I lb/CD 18細(xì)胞與DMSO (對照)、LAl、LA2、LA3或配體Fg —起溫育，隨后通過ID SDS-PAGE接著針對磷酸化ERK1/2 (pERK)、總ERK1/2和GAPDH的蛋白質(zhì)印跡法對細(xì)胞裂解物進(jìn)行了分析。分析表明與配體Fg或佛波醇酯PMA —起溫育不同，LA1-3處理不誘導(dǎo)所述磷酸化(pERK) (14)。因此，我們得出結(jié)論，在每種情況下在超過基礎(chǔ)水平的配體不存在或存在時(shí)，leukadherin均不誘導(dǎo)導(dǎo)致ERK磷酸化的由外到內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；
圖20A-20B表示在WT大鼠中的球囊損傷時(shí)對照化合物(LA-C)對新內(nèi)膜增厚無作用，9A是用對照化合物L(fēng)A-C治 療的動(dòng)物在球囊損傷后21天的大鼠動(dòng)脈的代表性顯微照片。箭頭表明動(dòng)脈中新內(nèi)膜增厚的位置；9B是柱狀圖，顯示通過對來自DMSO和LA-C治療動(dòng)物(η=7-9只動(dòng)物/組)的受損大鼠動(dòng)脈的形態(tài)測量分析所確定的新內(nèi)膜與中膜之比，所示數(shù)據(jù)為平均值+SEM。ns=不顯著(單因素方差分析)；
圖21A-21D表示在大鼠球囊損傷后leaukadherin LA3顯著減少新內(nèi)膜增厚。A.用溶媒(DMSO)或LA3治療的動(dòng)物在球囊損傷后21天的大鼠動(dòng)脈的代表性顯微照片。箭頭表明新內(nèi)膜增厚的位置。B.用DMSO或LA3治療的大鼠在球囊損傷后3天的代表性動(dòng)脈的顯微照片。箭頭表明CD68+巨噬細(xì)胞的位置。C.顯示通過來自DMSO或LA3治療的大鼠(η =
7-9只/組)的受損動(dòng)脈的形態(tài)測量分析所確定的新內(nèi)膜與中膜之比的柱狀圖。所示數(shù)據(jù)為平均值土 SEM。#p〈(X001。D.顯示DMSO或LA3治療的大鼠(η = 12只/組)的受損動(dòng)脈(損傷后3天)中巨噬細(xì)胞浸潤物的定量測定的柱狀圖。所示數(shù)據(jù)為平均值土SEM。***ρ〈0.0001 ；
圖22A-22D表示leukadherin LA2還防止嗜中性粒細(xì)胞募集到受損組織，且炎性嗜中性粒細(xì)胞募集的這種阻斷還可通過除去LA2而逆轉(zhuǎn)。A-B.與DMSO治療的斑馬魚相比，在用LA2治療的斑馬魚的無損傷(A)和有損傷(B)的3dpf幼體尾的代表性顯微照片(左)和熒光圖像(右)顯示嗜中性粒細(xì)胞(綠色)在尾部蓄積減少(圖4A-B，正文)。C.顯示在除去LA2后4小時(shí)嗜中性粒細(xì)胞(綠色)在尾部蓄積的幼體尾的代表性顯微照片(左)和熒光圖像(右)。D.顯示用溶媒(對照)和LA2治療的斑馬魚幼體中尾鰭損傷部位附近嗜中性粒細(xì)胞數(shù)的定量測定和在除去LA2后4小時(shí)尾鰭損傷部位附近嗜中性粒細(xì)胞數(shù)的定量測定的柱狀圖(η = 12-16條斑馬魚幼體/組)。所示數(shù)據(jù)為平均值土SEM。***ρ〈0.0001,ns=不顯著；
圖23表示斑馬魚幼體中Leukadherin治療不引起嗜中性粒細(xì)胞數(shù)損失,整個(gè)3dpf斑馬魚幼體的代表性熒光圖像(上)和受損魚尾部的顯微照片(下)表示各斑馬魚幼體的嗜中性粒細(xì)胞(綠色)。(η = 12-16條斑馬魚幼體/組)，LA1和LA2治療的斑馬魚顯示由于化合物自身熒光所致在熒光圖像中略為較強(qiáng)的綠色背景；
圖24表示顯示動(dòng)畫圖,其顯示在⑶lib A結(jié)構(gòu)域的活化敏感區(qū)中不同leukadherin結(jié)合的計(jì)算模型的2D投影，leukadherin化合物的親水羧酸部分遠(yuǎn)離可能與Lysl66和/或Lysl68形成離子相互作用的疏水袋定位；
圖25A-25B表示由外到內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析,將K562 CDl lb/CD18細(xì)胞與DMS0、LA1、LA2、LA3或配體Fg —起溫育，隨后針對磷酸化ERK1/2 (pERK)、總的ERK1/2 (12A)和磷酸化AKT(pAKT)、總的AKT和GAPDH (12B)對細(xì)胞裂解物進(jìn)行分析；
圖26A-26D是顯示在LAl不存在和存在下在用LPS (10ng/mL)刺激時(shí)由WT B6巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞分泌的促炎因子的直方 圖27是顯示在LAl不存在(灰色)或存在(紅色線)下在基態(tài)(對照)和在TNFa-活化時(shí)人嗜中性粒細(xì)胞中的ROS水平的曲線圖； 圖28表示MyD88的分析，將人THP-1細(xì)胞與LPS、LPS和LAl或僅LAl —起溫育一段時(shí)間，通過ID-SDS PAGE接著針對MyD88和GAPDH的蛋白質(zhì)印跡法對細(xì)胞裂解物進(jìn)行分析；圖29表示生存曲線，顯示在⑶I Ib/⑶18激動(dòng)劑LAl不存在或存在下在CLP時(shí)WT小鼠的生存；
圖30是顯示在進(jìn)行性抗GBM腎炎開始后8天溶媒治療(對照)和leukadherin治療動(dòng)物的血清suPAR水平的直方圖；和
圖31是顯示在缺血誘導(dǎo)前30分鐘用DMS0、LA1或LA2治療的WT小鼠的腎功能的曲線圖，再灌注24小時(shí)后進(jìn)行sCr測量，***p〈0.0001 (η=5只小鼠/組)。發(fā)明詳述
本發(fā)明總的來說涉及各種作用劑(包括稱為leukadherin的化合物)和用于激活β2整聯(lián)蛋白，尤其是CDllb/CD18的方法。換句話說，本發(fā)明的作用劑起β2整聯(lián)蛋白的激動(dòng)劑而非拮抗劑的作用。所述激動(dòng)劑和方法可用于治療炎性疾病和自身免疫性疾病等疾病。定義
術(shù)語“作用劑”是指化合物、肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、脂質(zhì)、核酸或聚合物。術(shù)語“燒氧基”是指具有與之連接的氧的燒基。代表性燒氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。術(shù)語“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基，可用通式烷基-O-烷基表示。術(shù)語“烷基”是指飽和脂族基團(tuán)，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基(脂環(huán))基團(tuán)、烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈上具有30個(gè)或更少的碳原子(例如直鏈為C1-30、支鏈為C3-30)，更優(yōu)選20或更少。此外，貫穿整個(gè)說明書、實(shí)施例和權(quán)利要求中所用的術(shù)語“烷基”欲包括未取代和取代的烷基，后者是指具有取代基的烷基部分，所述取代基置換烴主鏈的一個(gè)或多個(gè)碳上的氫，包括鹵代烷基例如三氟甲基和2，2，2-三氟乙基等。術(shù)語“Cx-y”當(dāng)與?；ⅤＱ趸?、烷基、烯基、炔基或烷氧基等化學(xué)部分聯(lián)用時(shí)，意指包括在鏈中含有χ-y個(gè)碳的基團(tuán)。CO烷基在該基團(tuán)位于末端位置時(shí)表示氫，如果位于內(nèi)部則表示鍵。例如C1-6烷基在鏈中含有1-6個(gè)碳原子。術(shù)語“胺”和“氨基”是本領(lǐng)域公知的，是指未取代和取代的胺兩者及其鹽，例如可由以下結(jié)構(gòu)表示的部分:
權(quán)利要求
1.一種β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑的藥物制劑，其包含有效量的β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑和藥學(xué)上可接受的載體。
2.權(quán)利要求1的藥物制劑，其中所述β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑為下式(I)的化合物
3.權(quán)利要求1的藥物制劑，其中所述β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑為下式(II)的化合物
4.權(quán)利要求3的藥物制劑，其中所述β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑選自
5.權(quán)利要求1的藥物制劑，其中所述β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑為下式(III)的化合物
6.權(quán)利要求1的藥物制劑，其還包括協(xié)同量的活性劑。
7.權(quán)利要求1的藥物制劑，其還包括協(xié)同量的選自以下的TNF-α阻斷劑:依那西普、英利昔單抗和阿達(dá)木單抗。
8.權(quán)利要求1的藥物制劑，其還包括協(xié)同量的選自以下的抗炎藥物:留體抗炎藥物(NSAIDS)、水楊酸酯、乙酸衍生物、吲哚美辛、丙酸衍生物、布洛芬、奈普生、CoxII抑制劑、塞來考昔和羅非考昔。
9.權(quán)利要求1的藥物制劑，其還包括協(xié)同量的西侖吉肽抗癌化合物。
10.權(quán)利要求1的藥物制劑，其還包括協(xié)同量的選自以下的抗排斥藥物:他克莫司、環(huán)孢菌素和類固醇。
11.權(quán)利要求1的藥物制劑，其還包括協(xié)同量的選自以下的抗凝血藥物:華法林、肝素、阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、雙嘧達(dá)莫和糖蛋白Ilb/IIIa受體激動(dòng)劑。
12.權(quán)利要求1的藥物制劑，其還包括協(xié)同量的選自以下的類固醇:妥布霉素、地塞米松、新霉素、氫化可的松、潑尼松和紅霉素。
13.權(quán)利要求1的藥物制劑，其還包括協(xié)同量的芬戈莫德鞘氨醇-1-磷酸酯受體調(diào)節(jié)劑。
14.權(quán)利要求1的藥物制劑，其還包括藥物洗脫支架介質(zhì)。
15.一種激活β 2整聯(lián)蛋白的方法，所述方法包括使β 2整聯(lián)蛋白與β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑相互作用的步驟。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述相互作用步驟被進(jìn)一步界定為用β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑占據(jù)β 2整聯(lián)蛋白a A-結(jié)構(gòu)域的結(jié)合袋。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述相互作用步驟被進(jìn)一步界定為使β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑的極性端與β2整聯(lián)蛋白的極性殘基相互作用以及使β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑的非極性端與β2整聯(lián)蛋白的疏水袋相互作用。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述相互作用步驟被進(jìn)一步界定為使β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑與由β2整聯(lián)蛋白的殘基L312、I308、L305 ( α 7螺旋)、L164、V160、F156 ( α I螺旋)^PY267、I269、I236、V238、I236、I135 (中央β折疊)界定的疏水袋相互作用。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述相互作用步驟被進(jìn)一步界定為使CDllb/CD18與激動(dòng)劑選擇性相互作用。
20.一種治療患者的方法，所述方法包括以下步驟: 給予有效量的β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑；和 激活β 2整聯(lián)蛋白。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑為下式(I)的化合物
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑為下式(II)的化合物
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑為下式(III)的化合物
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述β2整聯(lián)蛋白是⑶llb/⑶18。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述給予步驟還包括給予協(xié)同量的選自以下的活性劑的步驟:TNF-a阻斷劑、抗炎藥物、抗癌化合物、抗排斥藥物、抗凝血藥物、類固醇、鞘氨醇-1-磷酸酯受體調(diào)節(jié)劑和藥物洗脫支架介質(zhì)。
26.權(quán)利要求20的方法，其中所述激活步驟被進(jìn)一步界定為使β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑與β2整聯(lián)蛋白相互作用。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述相互作用步驟被進(jìn)一步界定為用β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑占據(jù)β 2整聯(lián)蛋白a A-結(jié)構(gòu)域的結(jié)合袋。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述相互作用步驟被進(jìn)一步界定為使β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑的極性端與β2整聯(lián)蛋白的極性殘基相互作用以及使β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑的非極性端與β2整聯(lián)蛋白的疏水袋相互作用。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述相互作用步驟被進(jìn)一步界定為使β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑與由β2整聯(lián)蛋白的殘基L312、I308、L305 ( α 7螺旋)、L164、V160、F156 ( α I螺旋)^PY267、I269、I236、V238、I236、I135 (中央β折疊)界定的疏水袋相互作用。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所述相互作用步驟被進(jìn)一步界定為使CDllb/CD18與激動(dòng)劑選擇性相互作用。
31.權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括調(diào)節(jié)選自構(gòu)象、細(xì)胞中的組構(gòu)和細(xì)胞膜上的組構(gòu)的β2整聯(lián)蛋白的功能的步驟。
32.權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括使β2整聯(lián)蛋白在細(xì)胞表面上聚集和產(chǎn)生β 2整聯(lián)蛋白阻斷的步驟。
33.權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括增加β2整聯(lián)蛋白與選自以下的配體結(jié)合的步驟:ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、iC3b、血纖蛋白原、因子X、血纖蛋白、uPAR和GP Iba。
34.權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括調(diào)節(jié)選自以下的至少一種功能的步驟:血管內(nèi)皮內(nèi)白細(xì)胞的滾動(dòng)、白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的結(jié)合、血管內(nèi)皮內(nèi)白細(xì)胞的爬行、白細(xì)胞通過血管內(nèi)皮的易位、白細(xì)胞浸潤進(jìn)入內(nèi)膜組織、一種或多種可溶性因子從白細(xì)胞中的釋放、趨化因子從白細(xì)胞中的釋放、生長因子從白細(xì)胞中的釋放、趨化因子從組織中的白細(xì)胞結(jié)合相關(guān)釋放、生長因子從組織中的白細(xì)胞結(jié)合相關(guān)釋放、一種或多種可溶性因子從組織中的白細(xì)胞結(jié)合相關(guān)釋放、循環(huán)中的一種或多種可溶性因子的水平變化和一種或多種不溶解因子的水平變化。
35.權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括調(diào)節(jié)選自以下的生物功能的步驟:基因表達(dá)、外遺傳特征、蛋白質(zhì)表達(dá)、蛋白質(zhì)水平、蛋白質(zhì)修飾、翻譯后修飾和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
36.權(quán)利要求20的方法，其中所述激活步驟治療選自以下的疾病:炎癥、慢性炎癥、急性炎癥、炎性皮膚疾病、免疫相關(guān)病癥、自身免疫性疾病、燒傷、免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、髓過氧化物酶缺乏癥、威-奧綜合征、慢性腎病、慢性肉芽腫病、高IgM綜合征、白細(xì)胞粘附缺乏、鐵缺乏癥、切-東綜合征、重癥聯(lián)合免疫缺陷、糖尿病、肥胖癥、高血壓、HIV、傷口愈合、重建、瘢痕形成、纖維變性、干細(xì)胞療法、惡病質(zhì)、腦脊髓炎、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、銀屑病、狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫相關(guān)病癥、放射損傷、移植、細(xì)胞移植、細(xì)胞輸入、器官移植、器官保存、細(xì)胞保存、哮喘、腸易激病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸炎、腸病、癌癥、白血病、缺血再灌注損傷、中風(fēng)、與血管損傷相關(guān)的新內(nèi)膜增厚、大皰性類天皰瘡、新生期梗阻性腎病、家族性高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常、主動(dòng)脈動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈炎；血管閉塞，包括腦動(dòng)脈閉塞；冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)并發(fā)癥；心肌炎，包括慢性自身免疫心肌炎和病毒性心肌炎；心力衰竭，包括慢性心力衰竭(CHF);心力衰竭惡病質(zhì)、心肌梗死、狹窄、心臟手術(shù)后再狹窄、無痛性心肌缺血、左心室輔助裝置移植后并發(fā)癥、血栓性靜脈炎、血管炎、川崎血管炎、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、韋格納肉芽腫病、創(chuàng)傷性頭部損傷、缺血后再灌注損傷、腦缺血后炎癥、心肌梗死后缺血再灌注損傷、腦型瘧和心血管疾病。
37.權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括檢測β2整聯(lián)蛋白活化和證實(shí)患者已經(jīng)得到治療的步驟。
38.一種治療炎癥的方法，所述方法包括以下步驟: 將β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑給予炎癥患者； 激活β 2整聯(lián)蛋白；和 減少炎癥。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述β2整聯(lián)蛋白是⑶Ilb/⑶18。
40.權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括通過使Akt磷酸化阻抑白細(xì)胞中的促炎細(xì)胞因子表達(dá)的步驟。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述阻抑步驟被進(jìn)一步界定為降低IL-6、TNF-a和MCP-1的水平。
42.權(quán)利要求40的方法，所述方法還包括降低TNF-α激活的嗜中性粒細(xì)胞中的活性氧類別水平的步驟。
43.權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括減少嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的可溶性因子分泌和減少炎癥的步驟 。
44.權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括通過增加炎癥部位附近的嗜中性粒細(xì)胞粘附性和減少嗜中性粒細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性而延遲嗜中性粒細(xì)胞募集的步驟。
45.權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括增加白細(xì)胞粘附、降低白細(xì)胞爬行和跨內(nèi)皮遷移和減少至發(fā)炎/受損組織中的募集的步驟。
46.權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括誘導(dǎo)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和為促炎信號和途徑提供負(fù)反饋環(huán)的步驟。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述誘導(dǎo)步驟被進(jìn)一步界定為誘導(dǎo)TLR4、結(jié)合并穩(wěn)定銜接物蛋白質(zhì)MyD88、募集下游激酶和啟動(dòng)Nf-kB介導(dǎo)的促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述提供步驟被進(jìn)一步界定為激活Syk、使MyD88磷酸化和給MyD88加標(biāo)簽用于遍在蛋白介導(dǎo)的破壞。
49.權(quán)利要求38的方法，其中所述炎癥由膿毒癥引起。
50.一種治療和/或預(yù)防腎缺血再灌注(Ι/R)損傷的方法，所述方法包括以下步驟: 將β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑給予患者；和 激活β 2整聯(lián)蛋白。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述給予步驟在選自以下的事件之后進(jìn)行:腎移植、大手術(shù)、創(chuàng)傷、膿毒性休克和出血性休克后的急性腎衰竭。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述給予步驟在手術(shù)前進(jìn)行。
53.權(quán)利要求50的方法，所述方法還包括降低sCr水平和產(chǎn)生腎保護(hù)作用的步驟。
54.一種減少由裝置插入所致的患者的再狹窄的方法，所述方法包括以下步驟: 在插入裝置之前給予β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑；和 激活β 2整聯(lián)蛋白。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述裝置是支架，所述方法還包括減少具有支架的血管損傷部位的白細(xì)胞蓄積和減少新內(nèi)膜增厚的步驟。
56.一種減少患者的再狹窄的方法，所述方法包括以下步驟: 給予用β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑涂覆的裝置；和 激活β 2整聯(lián)蛋白。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述裝置是支架。
58.一種進(jìn)行用于鑒定β 2整聯(lián)蛋白的小分子調(diào)節(jié)劑的測定的方法，所述方法包括以下步驟: 鑒定調(diào)節(jié)β 2整聯(lián)蛋白活性的β 2整聯(lián)蛋白的部位； 確定結(jié)合袋的精確三維結(jié)構(gòu)；和 鑒定可與結(jié)合袋相互作用的小分子。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述β 2整聯(lián)蛋白選自⑶IIb/⑶18、⑶IIc/⑶18、⑶IId/CD18 和 CDlla/CD18。
60.權(quán)利要求58的方法，其中所述確定和鑒定小分子步驟通過選自X-射線晶體學(xué)和核磁共振的方法進(jìn)行。
61.權(quán)利要求60的方法，所述方法還包括進(jìn)行選自以下的方法的步驟:支架跳躍、原子置換、殘基置換、分子置換及其組合。
62.權(quán)利要求58 的方法，其中所述鑒定小分子的步驟被進(jìn)一步界定為進(jìn)行基于細(xì)胞粘附的高通量篩選測定法和鑒定抑制或增加細(xì)胞粘附的小分子。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述進(jìn)行步驟被進(jìn)一步界定為篩選針對β2整聯(lián)蛋白的小分子激動(dòng)劑的文庫、通過倒置測定板經(jīng)由重力除去未貼壁細(xì)胞、對細(xì)胞核染色和成像以定量測定貼壁細(xì)胞的數(shù)目并鑒定β2整聯(lián)蛋白的激動(dòng)劑。
64.一種檢測患者的疾病的方法，所述方法包括以下步驟: 給予β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑； 檢測β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑與β 2整聯(lián)蛋白的結(jié)合；和 證實(shí)疾病的存在。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述檢測步驟被進(jìn)一步界定為從患者中采集樣品并進(jìn)行測定以檢測β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑與β2整聯(lián)蛋白的結(jié)合。
66.一種改善患者總體健康狀態(tài)的方法，所述方法包括以下步驟: 給予有效量的β 2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑；和 激活β 2整聯(lián)蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑的藥物制劑，其包括有效量的β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明公開了一種通過使β2整聯(lián)蛋白與β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑相互作用而激活β2整聯(lián)蛋白的方法。本發(fā)明公開了一種通過給予有效量的β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑并激活β2整聯(lián)蛋白而治療患者的方法。本發(fā)明公開了一種通過將β2整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑給予炎癥患者，激活β2整聯(lián)蛋白并減輕炎癥而治療炎癥的方法。本發(fā)明公開了治療和/或預(yù)防腎缺血再灌注(I/R)損傷、減少患者因支架插入所致的損傷、進(jìn)行用于鑒定β2整聯(lián)蛋白的小分子調(diào)節(jié)劑的測定、檢測患者的疾病和改善患者的總體健康狀態(tài)的方法。
文檔編號C12N5/16GK103189500SQ201180043382
公開日2013年7月3日 申請日期2011年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者V.古普塔 申請人:阿德黑雷制藥公司