專利名稱：雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多價(jià)和多特異性結(jié)合蛋白、制備方法、和具體而言涉及其在診斷、預(yù)防 和/或治療急性和慢性炎性疾病、癌癥及其他疾病中的用途。
背景技術(shù)：
工程改造的蛋白，例如能夠結(jié)合2種或更多抗原的多特異性抗體是本領(lǐng)域已知 的。此種多特異性結(jié)合蛋白可以使用細(xì)胞融合、化學(xué)綴合、或重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生?；?種不同雜交瘤細(xì)胞系的體細(xì)胞融合，已使用四源雜交瘤(quadroma)技術(shù) (參見 Milstein，C.和 Α. C. Cuello (1983)Nature，305 (5934)第 537-40 頁)生產(chǎn)了雙特異 性抗體，所述雜交瘤細(xì)胞系表達(dá)具有雙特異性抗體的所需特異性的鼠單克隆抗體(mAbs)。 因?yàn)?種不同免疫球蛋白(Ig)重和輕鏈在所得到的雜種_雜交瘤(或四源雜交瘤)細(xì)胞 系內(nèi)隨機(jī)配對(duì)，所以產(chǎn)生最高達(dá)10種不同Ig種類，其中只有一種是功能性雙特異性抗體。 錯(cuò)配對(duì)副產(chǎn)品的存在和顯著減少的生產(chǎn)得率意味著需要復(fù)雜的純化程序。雙特異性抗體也可以通過2種不同mAbs的化學(xué)綴合來生產(chǎn)(參見，Staerz，U.D.， 等人(1985), Nature 314(6012)第628-31頁)。這種方法不產(chǎn)生均質(zhì)制劑。其他方法已 使用2種不同mAbs或較小抗體片段的化學(xué)綴合(參見Brennan，Μ.，等人(1985)，Science 229(4708)第 81-3 頁)。用于產(chǎn)生雙特異性抗體的另一種方法是用異雙功能交聯(lián)劑偶聯(lián)2種親本抗體，但 所得到的雙特異性抗體經(jīng)受顯著的分子異質(zhì)性，因?yàn)榻宦?lián)劑與親本抗體的反應(yīng)不是定點(diǎn) 的。為了獲得更均質(zhì)的雙特異性抗體制劑，2種不同F(xiàn)ab片段已以定點(diǎn)方式在其鉸鏈半胱氨 酸殘基上進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)(參見Glermie，M. J.，等人(1987)，J Immunol 139(7)第2367-75 頁)。但這種方法產(chǎn)生Fab’ 2片段，而不是全I(xiàn)gG分子。已開發(fā)了廣泛多樣的其他重組雙特異性抗體形式(參見Kriangkum，J.，等 人(2001)，Biomol Eng 18 (2)第31-40頁)。在它們當(dāng)中，串聯(lián)單鏈Fv分子和雙抗體 (diabody)、及其各種衍生物是最廣泛使用的。常規(guī)地，這些分子的構(gòu)建從識(shí)別不同抗原的2 個(gè)單鏈 Fv(scFv)片段開始(參見 Economides，A.N.，等人(2003)，Nat Med 9(1)第 47-52 頁)。串聯(lián)scFv分子(taFv)代表用另外的肽接頭簡(jiǎn)單連接2個(gè)scFv分子的簡(jiǎn)單形式。這 些串聯(lián)scFv分子中存在的2個(gè)scFv片段形成分開的折疊實(shí)體。各種接頭可以用于連接2 個(gè)scFv片段和接頭具有最高達(dá)63個(gè)殘基的長(zhǎng)度(參見Nakanishi，K.，等人(2001)，Annu Rev Immunol 19 第423-74頁)。盡管親本scFv片段可以以可溶形式在細(xì)菌中正常表達(dá)， 然而，常常觀察到串聯(lián)scFv分子在細(xì)菌中形成不溶性聚集體。因此，重折疊規(guī)程或哺乳動(dòng) 物表達(dá)系統(tǒng)的使用常規(guī)應(yīng)用于生產(chǎn)可溶性串聯(lián)scFv分子。在近期研究中，報(bào)道了通過轉(zhuǎn)基因兔和牛體內(nèi)表達(dá)針對(duì)⑶28的串聯(lián)scFv和黑素瘤相關(guān)蛋白聚糖(參見Gracie，J. Α.，等人 (1999)，J Clin Invest. 104(10)第 1393-401 頁)。在這個(gè)構(gòu)建體中，2 個(gè) scFv 分子通過 CHl接頭進(jìn)行連接，且得到最高達(dá)100mg/L的雙特異性抗體血清濃度。使用各種策略包括 結(jié)構(gòu)域順序變化或使用具有變化長(zhǎng)度或柔性的中間接頭，以允許在細(xì)菌中可溶性表達(dá)。少 數(shù)研究現(xiàn)在已報(bào)道了使用非常短的Ala3接頭或長(zhǎng)的富甘氨酸/絲氨酸接頭，在細(xì)菌中表達(dá) 可溶性串聯(lián) scFv 分子(參見 Leung, B. P.，等人(2000)，J Immunol 164(12)第 6495-502 頁；Ito，A.，等人(2003)，J Immunol 170 (9)第 4802-9 頁；Karni，A.，等人(2002)，J Neuroimmunol 125(1-2)第134-40頁)。在另一個(gè)近期研究中，包含長(zhǎng)度為3或6個(gè)殘基 的隨機(jī)化中間接頭的串聯(lián)scFv譜(repertoire)噬菌體展示，用于富集以可溶和活性形式 在細(xì)菌中生產(chǎn)的那些分子。這種方法導(dǎo)致分離具有6個(gè)氨基酸殘基接頭的串聯(lián)scFv分子 (參見 Arndt，M.和 J. Krauss (2003) ,Methods Mol Biol 207 第 305-21 頁)。這種接頭序 列是否代表串聯(lián)scFv分子可溶性表達(dá)的一般解決方案仍不清楚。然而，這項(xiàng)研究證明串聯(lián) scFv分子的噬菌體展示與定向誘變組合是富集這些分子的有力工具，所述分子可以以活性 形式在細(xì)菌中表達(dá)。雙特異性雙抗體(Db)利用雙抗體形式用于進(jìn)行表達(dá)。通過使連接VH和VL 結(jié)構(gòu)域的接頭長(zhǎng)度減少至約5個(gè)殘基，由scFv片段生產(chǎn)雙抗體(參見Peipp，Μ.和 Τ. Valerius (2002), Biochem Soc Trans 30(4)第 507-11 頁)。接頭尺寸的這種減少通過 使VH和VL結(jié)構(gòu)域交叉配對(duì)促進(jìn)2條多肽鏈的二聚化。雙特異性雙抗體通過在相同細(xì)胞 內(nèi)表達(dá)2條多肽鏈來生產(chǎn)，所述2條多肽鏈具有結(jié)構(gòu)VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL構(gòu)型)、或 VLA-VHB和VLB-VHA (VL-VH構(gòu)型)。在過去已生產(chǎn)了大量品種繁多的不同雙特異性雙抗體， 并且它們中的大多數(shù)以可溶形式在細(xì)菌中表達(dá)。然而，近期的比較研究證明可變結(jié)構(gòu)域的 方向可以影響活性結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)和形成(參見Mack，Μ.，等人(1995)，Proc Natl Acad Sci U S A 92(15)第7021-5頁)。然而，在細(xì)菌中的可溶性表達(dá)代表超過串聯(lián)scFv分子 的重要優(yōu)點(diǎn)。然而，因?yàn)?條不同多肽鏈在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所以可以生產(chǎn)無活性同二聚體 連同活性異二聚體。這使另外純化步驟的執(zhí)行成為必需，以獲得雙特異性雙抗體的均質(zhì)制 劑。促使雙特異性雙抗體產(chǎn)生的一種方法是結(jié)進(jìn)孔(knob-into-hole)雙抗體的生產(chǎn)(參 見 Holliger，P.，T. Prospero 和 G. Winter (1993)，Proc Natl Acad Sci U S A 90(14)第 6444-8. 18頁)。該方法對(duì)于針對(duì)HER2和⑶3的雙特異性雙抗體進(jìn)行了證明。通過用Phe 交換Val37和用Trp交換Leu45將大結(jié)引入VH結(jié)構(gòu)域內(nèi)，且在抗HER2或抗CD3可變結(jié)構(gòu) 域中，通過使Phe98突變?yōu)镸et和使Tyr87突變?yōu)锳la在VL結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生互補(bǔ)孔。通過使 用這種方法，雙特異性雙抗體的生產(chǎn)可以從經(jīng)由親本雙抗體的72%增至經(jīng)由結(jié)進(jìn)孔雙抗體 的超過90%。重要的是，作為這些突變的結(jié)果生產(chǎn)得率只有輕微減少。然而，對(duì)于幾種構(gòu)建 體觀察到抗原結(jié)合活性的減少。因此，這種相當(dāng)精細(xì)的方法需要分析各種構(gòu)建體，以鑒定產(chǎn) 生具有不變結(jié)合活性的異二聚分子的那些突變。此外，此種方法需要免疫球蛋白序列在恒 定區(qū)的突變修飾，因此生成非天然和非自然形式的抗體序列，這可以導(dǎo)致免疫原性增加、體 內(nèi)穩(wěn)定性差、以及不希望有的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。單鏈雙抗體(SCDb)代表改善雙特異性雙抗體樣分子形成的可替代策略(參見 Holliger, P.禾口 G. Winter (1997)，Cancer Immunol Immunother 45(3—4)第 128—30 頁； ffu, Α. M.，等人(1"6)，Immunotechnology 2(1)第21_36頁)。雙特異性單鏈雙抗體通過用另外的中間接頭連接2條雙抗體形成多肽鏈來產(chǎn)生，所述另外的中間接頭長(zhǎng)度為約 15個(gè)氨基酸殘基。因此，分子量對(duì)應(yīng)于單體單鏈雙抗體(50-60kDa)的所有分子都是雙 特異性的。幾項(xiàng)研究已證明雙特異性單鏈雙抗體在細(xì)菌中以可溶和活性形式表達(dá)，其中 大多數(shù)純化的分子呈現(xiàn)為單體(參見Holliger，P.和G. Winter (1997)，Cancer Immunol Immunother 45(3-4)第 128-30 頁；ffu, A.M.，等人(1996) Immunotechnol. 2 (1)第 21-36 頁；Pluckthun, A.禾口 P. Pack (1997) Immunotechno 1. 3 (2)第 83—105 頁；Ridgway, J. B.，等 人(1996)，Protein Engin. 9 (7)第617-21頁)。因此，單鏈雙抗體組合了串聯(lián)scFvs (所 有單體都是雙特異性的)和雙抗體(在細(xì)菌中可溶性表達(dá))的優(yōu)點(diǎn)。更近地，雙抗體已與Fc融合以產(chǎn)生更Ig樣的分子，稱為雙-雙抗體 (di-diabodies)(參見 Lu，D.，等人(2004)，J Biol Chem 279(4)第 2856-65 頁)。此外， 已描述了在IgG重鏈中包含2個(gè)Fab重復(fù)且能夠結(jié)合4個(gè)抗原分子的多價(jià)抗體構(gòu)建體(參 見 WO 0177342A1，和 Miller，K.，等人(2003)，J Immunol 170(9)第 4854-61 頁)。本領(lǐng)域需要能夠結(jié)合2種或更多抗原的改良的多價(jià)結(jié)合蛋白。美國專利申請(qǐng)系列 號(hào)11/507，050提供了能夠以高親和力結(jié)合2種或更多抗原的結(jié)合蛋白新家族，其被稱為雙 重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白(DVD-Ig )。本發(fā)明提供能夠結(jié)合2種或更多抗原的另外的新結(jié) 合蛋白ο發(fā)明概述本發(fā)明涉及能夠結(jié)合2種或更多抗原的多價(jià)結(jié)合蛋白。本發(fā)明提供了能夠以高親 和力結(jié)合2種或更多抗原的結(jié)合蛋白新家族。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中多肽鏈包含 VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，C是恒 定結(jié)構(gòu)域，Xl代表氨基酸或多肽，X2代表Fc區(qū)和η是O或1。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白 中的VDl和VD2是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域選自鼠重鏈可變 結(jié)構(gòu)域、人重鏈可變結(jié)構(gòu)域、CDR嫁接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域、和人源化重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，VDl和VD2能夠結(jié)合相同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，VDl和VD2能夠結(jié)合不 同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。例如，Xl是接頭，條件是Xl不是CH1。 例如，Xl 是選自下述的接頭AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO 1) ；AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO 2) ；AKTTPKLGG(SEQ ID NO 3) ；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO 4) ；SAKTTP(SEQ ID N0: 5) ；RADAAP(SEQ ID NO 6) ；RADAAPTVS(SEQ ID NO 7) ；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO 8)； RADAAAA (G4S) 4 (SEQ ID NO 9) ； SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID N0:10) ；ADAAP (SEQ ID NO: 11) ；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO 12) ； TVAAP (SEQ ID NO 13) ；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14) ；QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) ；AKTTPP(SEQ ID NO: 17)； AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18) ；AKTTAP(SEQ ID NO 19) ；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO 20) ；ASTKGP(SEQ ID NO 21) ；ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO :22)，GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO 23) ；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO 24) ；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO 25)；以及 GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO :26)。在一個(gè)實(shí)施方案中，X2是Fc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中， X2是變體Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，此處公開的結(jié)合蛋白包含多肽鏈，其中多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CHl，且X2是Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白中的VDl和VD2是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方 案中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域選自鼠輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、CDR嫁接的輕鏈可變結(jié) 構(gòu)域、和人源化輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，VDl和VD2能夠結(jié)合相同抗原。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，VDl和VD2能夠結(jié)合不同抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，C是輕鏈恒定結(jié) 構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Xl是接頭，條件是Xl不是CLl。在一個(gè)實(shí)施方案中，Xl是選 自下述的接頭AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO 1) ；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO 2)； AKTTPKLGG(SEQ ID NO 3) ；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO 4) ；SAKTTP(SEQ ID NO 5) ；RADAAP(SEQ ID NO 6) ；RADMPTVS(SEQ ID NO 7) ；RADAMAGGPGS (SEQ ID NO 8) ；RADAMA (G4S)4 (SEQ ID NO 9) ； SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10) ；ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12) ； TVAAP (SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO 14) ； QPKAAP (SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO 16) ；AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18) ；AKTTAP(SEQ ID NO 19) ；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO 20) ；ASTKGP(SEQ ID NO 21)； ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO 22) ；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO 23) ；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO 24) ；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO 25)；以及GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO :26)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白不包含X2。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈和可變輕鏈均包含相同接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 可變重鏈和可變輕鏈包含不同接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈和可變輕鏈均包含短 (約6個(gè)氨基酸)接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈和可變輕鏈均包含長(zhǎng)(多于6個(gè)氨 基酸)接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈包含短接頭而可變輕鏈包含長(zhǎng)接頭。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈包含長(zhǎng)接頭而可變輕鏈包含短接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，此處公開的結(jié)合蛋白包含多肽鏈，其中所述多肽鏈包含 VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域，C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2不包含F(xiàn)c區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含2條多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中所述第一 條多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個(gè) 重鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CHl，且X2是Fc區(qū)；且所 述第二條多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是 第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2不包含 Fc區(qū)。在具體實(shí)施方案中，雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)結(jié)合蛋白包含4條多肽鏈，其中首先2條 多肽鏈分別包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二 個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CHl，且X2是Fc區(qū)；且 其次2條多肽鏈分別包含VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，VD2 是第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2不包 含F(xiàn)c區(qū)。此種雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)蛋白具有4個(gè)抗原結(jié)合部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此處公開的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合一種或多種靶。在一個(gè)實(shí)施 方案中，靶選自細(xì)胞因子、細(xì)胞表面蛋白、酶和受體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白能夠調(diào) 節(jié)一種或多種靶的生物學(xué)功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白能夠中和一種或多種靶。 本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自淋巴因子、單核因子、多肽激素、受體或腫瘤標(biāo)記的細(xì)胞因子。例如，本發(fā)明的DVD-Ig能夠結(jié)合下述的兩種或更多種腫瘤壞死因子(TNF)、核因子 κ B受體激活物配體(RANKL)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、硬化蛋白 (Sclerostin) (SOST)、Dickkopf■相關(guān)蛋白(DKK)、CD-20、α νβ 3、白細(xì)胞介素 13(IL_13)、 白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素9(IL-9)、白細(xì)胞介素17A(IL_17A)、白細(xì)胞介素 la (IL-la)、白細(xì)胞介素1β (IL_1 β )、白細(xì)胞介素23，亞基pl9 (IL_23pl9)、白細(xì)胞介素 6 (IL-6)、免疫球蛋白E (IgE)、白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)和白細(xì)胞介素9 (IL-9)。(也見表 2)。在具體實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自下述的靶對(duì)TNF和IL-17A ；TNF和RANKL ； TNF 禾口 VEGF ；TNF 禾口 SOST (seq. 1) ；TNF 禾口 DKK ；TNF 禾口 a VB3 ；TNF 禾口 NGF ；TNF 禾口 IL_23pl9 ； TNF 和 IL-6 ；TNF 和 SOST (seq. 2) ；TNF 和 IL-6R ；TNF 和 CD-20 ；IgE 和 IL_13(seq. 1)； IL-13(seq. 1)和 IL_23pl9 ；IgE 和 IL-4 ；IgE 和 IL_9(seq. 1) ；IgE 和 IL_9(seq. 2) ；IgE 和 IL_13(seq. 2) ；IL-13 (seq. 1)和 IL_9(seq. 1) ；IL-13 (seq. 1)和 IL-4 ;IL_13 (seq. 1) 和 IL-9 (seq. 2) ； IL-13 (seq. 2)和 IL-9 (seq. 1) ； IL-13 (seq. 2)和 IL-4 ； IL-13 (seq. 2) 和 IL-23p 19 ； IL-13 (seq. 2)和 IL-9 (seq. 2) ； IL-6R 和 VEGF ； IL-6R 和 IL-17A ； IL-6R 和 RANKL ； IL-17A 禾口 IL—1 β (seq. 1) ； IL-I β (seq. 1)禾口 RANKL ； IL-I β (seq. 1)禾口 VEGF ；RANKL 和 CD-20 ； IL-I α 和 IL-I β (seq. 1) ； IL-I α 和 IL-I β (seq. 2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和IL-17A的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO 76 和SEQ ID NO 78的DVD重鏈氨基酸序列；以及選自SEQ ID NO 77和SEQ ID NO 79的DVD 輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和IL-17A的結(jié)合蛋白包含SEQ ID NO 76的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO 77的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 能夠結(jié)合TNF和IL-17A的結(jié)合蛋白具有反向方向(reverse orientation)，并包含SEQ ID NO 78的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO 79的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和RANKL的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0:80和 SEQ ID NO 82的DVD重鏈氨基酸序列；以及選自SEQ ID NO 81和SEQ ID NO 83的DVD輕 鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和RANKL的結(jié)合蛋白包含SEQ ID NO 80 的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO 81的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能 夠結(jié)合TNF和RANKL的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO 82的DVD重鏈氨基酸序 列和SEQ ID NO 83的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和VEGF的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO :84和 SEQ ID NO 86的DVD重鏈氨基酸序列；以及選自SEQ ID NO 85和SEQ ID NO 87的DVD輕 鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和VEGF的結(jié)合蛋白包含SEQ ID NO 84 的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO 85的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能 夠結(jié)合TNF和VEGF的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO 86的DVD重鏈氨基酸序 列和SEQ ID NO 87的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和S0ST(seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO 88和SEQ ID NO 90的DVD重鏈氨基酸序歹丨J ；以及選自SEQ ID NO 89和SEQ ID NO 91 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和SOST(seq. 1)的結(jié)合蛋白包 含SEQ ID NO 88的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO 89的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和SOST (seq. 1)的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO 90的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO 91的DVD輕鏈氨基酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和DKK的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO :92和 SEQ ID NO 94的DVD重鏈氨基酸序列；以及選自SEQ ID NO 93和SEQ ID NO 95的DVD輕 鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和DKK的結(jié)合蛋白包含SEQ ID NO :92的 DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO 93的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠 結(jié)合TNF和DKK的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO :94的DVD重鏈氨基酸序列和 SEQ ID NO 95的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和α νβ 3的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO 96 和SEQ ID NO 98的DVD重鏈氨基酸序列；以及選自SEQ ID NO 97和SEQ ID NO 99的DVD 輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和α νβ 3的結(jié)合蛋白包含SEQ ID NO 96的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO 97的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 能夠結(jié)合TNF和α νβ 3的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO 98的DVD重鏈氨基 酸序列和SEQ ID NO 99的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和NGF的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO. 100和 SEQ ID NO. 102的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID NO. 101和SEQ ID NO. 103的DVD輕 鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和NGF的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 100 的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 101的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 能夠結(jié)合TNF和NGF的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 102的DVD重鏈氨基酸 序列和SEQ ID N0. 103的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和IL_23pl9的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 104 和 SEQ ID N0. 106 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 105 和 SEQ ID N0. 107 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和IL-23p 19的結(jié)合蛋白包含 SEQ ID N0. 104的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 105的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和IL-23p 19的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 106 的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 107的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和IL-6的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 108和 SEQ ID N0. 110的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 109和SEQ ID NO. Ill的DVD輕 鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和IL-6的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 108 的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 109的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 能夠結(jié)合TNF和IL-6的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 110的DVD重鏈氨基酸 序列和SEQ ID NO. Ill的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和S0ST(seq. 2)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 112 和 SEQ ID N0. 114 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 113 和 SEQ ID N0. 115 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和SOST (seq. 2)的結(jié)合蛋白包 含SEQ ID N0. 112的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 113的DVD輕鏈氨基酸序列。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和SOST(seq. 2)的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 114的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 115的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和IL-6R的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 116和 SEQ ID N0. 118的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 117和SEQ ID N0. 119的DVD輕 鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和IL-6R的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 116的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 117的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 能夠結(jié)合TNF和IL-6R的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO. 118的DVD重鏈氨基 酸序列和SEQ ID NO. 119的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和⑶-20的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO. 120和 SEQ ID NO. 122的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 121禾口 SEQ ID N0. 123的DVD輕 鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合TNF和⑶-20的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 120 的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 121的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 能夠結(jié)合TNF和⑶-20的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 122的DVD重鏈氨基 酸序列和SEQ ID N0. 123的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-13(seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 124 和 SEQ ID N0. 126 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 125 和 SEQ ID N0. 127 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-13(seq. 1)的結(jié)合蛋白包 含SEQ ID N0. 124的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 125的DVD輕鏈氨基酸序列。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-13(seq. 1)的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 126的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 127的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 1)和IL23pl9的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 128和SEQ ID N0. 130的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 129和SEQ ID N0. 131的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 1)和IL23pl9的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 128的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 129的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 1)和IL23pl9的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID N0. 130的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 131的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-4的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 132和 SEQ ID N0. 134的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 133和SEQ ID N0. 135的DVD輕 鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-4的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 132 的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 133的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 能夠結(jié)合IgE和IL-4的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 134的DVD重鏈氨基酸 序列和SEQ ID N0. 135的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-9(seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 136 和 SEQ ID N0. 138 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 137 和 SEQ ID N0. 139 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-9(seq. 1)的結(jié)合蛋白包 含SEQ ID N0. 136的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 137的DVD輕鏈氨基酸序列。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-9(seq. 1)的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 138的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 139的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-9(seq. 2)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 140 和 SEQ ID N0. 142 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 141 禾口 SEQ ID N0. 143 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-9(seq.2)的結(jié)合蛋白包 含SEQ ID N0. 140的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 141的DVD輕鏈氨基酸序列。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-9(seq.2)的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 142的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 143的DVD輕鏈氨基酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-13(seq. 2)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO. 144 和 SEQ ID NO. 146 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID NO. 145 和 SEQ ID NO. 147 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-13(seq.2)的結(jié)合蛋白包 含SEQ ID NO. 144的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 145的DVD輕鏈氨基酸序列。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IgE和IL-13(seq.2)的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO. 146的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 147的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 1)和IL_9(Seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選 自SEQ ID N0. 148和SEQ ID N0. 150的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 149和 SEQ ID N0. 151的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13 (seq. 1)和 IL-9(seq. 1)的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 148的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 149的 DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 1)和IL_9(Seq. 1)的結(jié) 合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 150的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 151的 DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-3(seq. 1)和IL-4的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 152 和 SEQ ID N0. 154 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 153 和 SEQ ID N0. 155 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-3 (seq. 1)和IL_4的結(jié)合蛋白包 含SEQ ID N0. 152的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 153的DVD輕鏈氨基酸序列。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-3 (seq. 1)和IL_4的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 154的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 155的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 1)和IL_9(Seq. 2)的結(jié)合蛋白包含選 自SEQ ID N0. 156和SEQ ID N0. 158的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 157和 SEQ ID N0. 159的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 1)和 IL-9(seq. 2)的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 156的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 157的 DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 1)和IL_9(Seq. 2)的結(jié) 合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 158的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 159的 DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 2)和IL_9(Seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選 自SEQ ID N0. 160和SEQ ID N0. 162的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 161和 SEQ ID N0. 163的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13 (seq. 2)和 IL-9(seq. 1)的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 160的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 161的 DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 2)和IL_9(Seq. 1)的結(jié) 合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 162的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 163的 DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 2)和IL-4的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 164 和 SEQ ID N0. 166 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 165 和 SEQ ID N0. 167 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13 (seq. 2)和IL_4的結(jié)合蛋白 包含SEQ ID N0. 164的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 165的DVD輕鏈氨基酸序列。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13 (seq. 2)和IL_4的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 166的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 167的DVD輕鏈氨基酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13 (seq. 2)和IL_23pl9的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO. 168和SEQ ID NO. 170的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID NO. 169和SEQ ID NO. 171的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 2)和IL_23pl9 的結(jié)合蛋白包含SEQ ID NO. 168的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 169的DVD輕鏈氨基 酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13 (seq. 2)和IL_23pl9的結(jié)合蛋白具有反向 方向，并包含SEQ ID NO. 170的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 171的DVD輕鏈氨基酸 序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 2)和IL_9(Seq. 2)的結(jié)合蛋白包含選 自SEQ ID N0. 172和SEQ ID N0. 174的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 173和 SEQ ID N0. 175的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13 (seq. 2)和 IL-9(seq. 2)的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 172的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 173的 DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-13(seq. 2)和IL_9(Seq. 2)的結(jié) 合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 174的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 175的 DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-6R和VEGF的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 176 和SEQ ID N0. 178的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 177和SEQ ID N0. 179的 DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-6R和VEGF的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 176的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 177的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，能夠結(jié)合IL-6R和VEGF的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 178的DVD重 鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 179的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-6R和IL-17A的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 180 和 SEQ ID N0. 182 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 181 禾口 SEQ ID N0. 183 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-6R和IL-17A的結(jié)合蛋白包含 SEQ ID N0. 180的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 181的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-6R和IL-17A的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 182 的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 183的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-6R和RANKL的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 184 和SEQ ID N0. 186的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 185和SEQ ID N0. 187的DVD 輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-6R和RANKL的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 184的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 185的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，能夠結(jié)合IL-6R和RANKL的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 186的DVD重 鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 187的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-17A和IL-I β (seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 188和SEQ ID N0. 190的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 189和SEQ ID N0. 191的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-17A和IL-I β (seq. 1)的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 188的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 189的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-17A和IL-I β (seq. 1)的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID N0. 190的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 191的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I β (seq. 1)和RANKL的結(jié)合蛋白包含選自SEQID NO. 192和SEQ ID NO. 194的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID NO. 193和SEQ ID NO. 195的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I β (seq. 1)和RANKL的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID NO. 192的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 193的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I β (seq. 1)和RANKL的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID NO. 194的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 195的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I β (seq. 1)和VEGF的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO. 196 和 SEQ ID NO. 198 的 DVD 重鏈氨基酸序列；和選自 SEQ ID NO. 197 和 SEQ ID NO. 199 的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I β (seq. 1)和VEGF的結(jié)合蛋白 包含SEQ ID NO. 196的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 197的DVD輕鏈氨基酸序列。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I β (seq. 1)和VEGF的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO. 198的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 199的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合RANKL和⑶-20的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 200 和SEQ ID N0. 202的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 201和SEQ ID N0. 203的DVD 輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合RANKL和⑶-20的結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 200的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 201的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，能夠結(jié)合RANKL和⑶-20的結(jié)合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID N0. 202的DVD重 鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 203的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL_1 β (seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 204和SEQ ID N0. 206的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 205和SEQ ID N0. 207的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-1 β (seq. 1)的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 204的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 205的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 1)的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID N0. 206的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 207的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL_1 β (seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 208和SEQ ID N0. 210的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 209和SEQ ID N0. 211的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-1 β (seq. 1)的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 208的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 209的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 1)的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID N0. 210的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 211的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL_1 β (seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 212和SEQ ID N0. 214的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 213和SEQ ID N0. 215的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-1 β (seq. 1)的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 212的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 213的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 1)的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID N0. 214的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 215的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL_1 β (seq. 1)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 216和SEQ ID N0. 218的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 217和SEQ ID N0. 219的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-1 β (seq. 1)的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 216的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 217的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 1)的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID NO. 218的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 219的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-1 β (seq. 2)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID NO. 220和SEQ ID NO. 222的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID NO. 221和SEQ ID NO. 223的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-1 α和IL-1 β (seq. 2)的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID NO. 220的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 221的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID N0. 222的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 223的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-1 β (seq. 2)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 224和SEQ ID N0. 226的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 225和SEQ ID N0. 227的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 224的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 225的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID N0. 226的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 227的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-1 β (seq. 2)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 228和SEQ ID N0. 230的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 229和SEQ ID N0. 231的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 228的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 229的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID N0. 230的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 231的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-1 β (seq. 2)的結(jié)合蛋白包含選自SEQ ID N0. 232和SEQ ID N0. 234的DVD重鏈氨基酸序列；和選自SEQ ID N0. 233和SEQ ID N0. 235的DVD輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-1 α和IL-1 β (seq. 2)的 結(jié)合蛋白包含SEQ ID N0. 232的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 233的DVD輕鏈氨基酸 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的結(jié)合蛋白具有反向方向， 并包含SEQ ID N0. 234的DVD重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 235的DVD輕鏈氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中所述多肽鏈包含 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè) 重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu) 域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在； 且(Χ2)η是Fc區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)不存在于結(jié)合 蛋白中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中所述多肽鏈包含 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè) 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在； 且(Χ2)η不包含F(xiàn)c區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，(Χ2)η不存在 于結(jié)合蛋白中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白包含第一個(gè)和第二個(gè)多肽鏈，其中所述第一個(gè)多肽鏈包含第一個(gè)VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一個(gè)親本抗體或其抗 原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲 得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中 所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fc區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第 二個(gè)多肽鏈包含第二個(gè)VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一個(gè)親本抗體或其抗原 結(jié)合部分獲得的第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得 的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(XDn是接頭，條件是它不是CHl，其中所 述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n不包含F(xiàn)c區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白包含兩個(gè)第一個(gè)多肽鏈和兩個(gè)第二個(gè)多肽鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中， (X2) η不存在于第二個(gè)多肽中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)如果存在于第一個(gè)多肽中，則其 選自天然序列Fc區(qū)和變體序列Fc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)選自來自IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE 和 IgD 的 Fc 區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白是能夠結(jié)合兩個(gè)抗原、包含四個(gè)多肽鏈 的DVD-Ig，其中，第一個(gè)和第三個(gè)多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一 個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二個(gè)親本抗體或 其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(XDn是接頭，條件 是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fc區(qū)，其中所述(X2)n存在或不 存在；且其中所述第二個(gè)和第四個(gè)多肽鏈包含VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是從第一 個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從第二個(gè)親本抗體或 其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(XDn是接頭，條件 是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n不包含F(xiàn)c區(qū)，其中所述(X2)n存在 或不存在。本發(fā)明提供通過預(yù)選擇親本抗體制備DVD-Ig結(jié)合蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方案 中，制備能夠結(jié)合兩個(gè)抗原的雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白的方法包含步驟a)獲得能夠結(jié) 合第一個(gè)抗原的第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分；b)獲得能夠結(jié)合第二個(gè)抗原的第二 個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分；c)構(gòu)建包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n的第一個(gè)和第三個(gè) 多肽鏈，其中VDl是從所述第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu) 域；VD2是從所述第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重 鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η是Fc區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；d)構(gòu)建包含VDl-(Xl)n-VD2-C_(X2)η的第二個(gè) 和第四個(gè)多肽鏈，其中VDl是從所述第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)輕鏈 可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從所述第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在； 且(Χ2) η不包含F(xiàn)c區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在；e)表達(dá)所述第一個(gè)、第二個(gè)、第三個(gè) 和第四個(gè)多肽鏈；從而生成能夠結(jié)合所述第一個(gè)和所述第二個(gè)抗原的雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫 球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供生成具有所需特性的能夠結(jié)合兩個(gè)抗原的雙重 可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白的方法，包含步驟a)獲得第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分，其能 夠結(jié)合第一個(gè)抗原且具有至少一個(gè)由雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白表現(xiàn)的所需特性；b)獲
23得第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分，其能夠結(jié)合第二個(gè)抗原且具有至少一個(gè)由雙重可變 結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白表現(xiàn)的所需特性；c)構(gòu)建包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n的第一個(gè)和第三 個(gè)多肽鏈，其中VDl是從所述第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)重鏈可變結(jié) 構(gòu)域；VD2是從所述第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是 重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η是Fc區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；d)構(gòu)建包含VDl-(Xl)n-VD2-C_(X2)η的第二個(gè) 和第四個(gè)多肽鏈，其中VDl是從所述第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第一個(gè)輕鏈 可變結(jié)構(gòu)域；VD2是從所述第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的第二個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在； 且(Χ2) η不包含F(xiàn)c區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在；e)表達(dá)所述第一個(gè)、第二個(gè)、第三個(gè) 和第四個(gè)多肽鏈；從而生成具有所需特性的能夠結(jié)合所述第一個(gè)和所述第二個(gè)抗原的雙重 可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，在此公開的第一個(gè)和第二個(gè)多肽鏈的VDl是從相同親本抗體 或其抗原結(jié)合部分獲得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在此公開的第一個(gè)和第二個(gè)多肽鏈的VDl 是從不同親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在此公開的第一個(gè)和 第二個(gè)多肽鏈的VD2是從相同親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 在此公開的第一個(gè)和第二個(gè)多肽鏈的VD2是從不同親本抗體或其抗原結(jié)合部分獲得的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分與第二個(gè)親本抗體或其抗 原結(jié)合部分是相同抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分與第二 個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分是不同抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第一個(gè)抗原，而第二 個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第二個(gè)抗原。在具體實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)抗原 是相同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，親本抗體結(jié)合相同抗原上的不同表位。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，第一個(gè)和第二個(gè)抗原是不同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)親本抗體或其抗原 結(jié)合部分結(jié)合第一個(gè)抗原，其結(jié)合能力不同于第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第二 個(gè)抗原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第一個(gè)抗原， 其結(jié)合親和力不同于第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合第二個(gè)抗原的親和力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分和第二個(gè)親本抗體或其 抗原結(jié)合部分選自人抗體、⑶R嫁接的抗體(⑶R grafted antibody)和人源化抗體。在一 個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分選自Fab片段、F(ab' )2片段、包含由鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的 2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu) 域組成的Fv片段、dAb片段、分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)、單鏈抗體和雙抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白具有至少一個(gè)由第一個(gè)親本抗體或其抗 原結(jié)合部分、或第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分表現(xiàn)的所需特性?？商娲?，第一個(gè)親 本抗體或其抗原結(jié)合部分和第二個(gè)親本抗體或其抗原結(jié)合部分具有至少一個(gè)由雙重可變 結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白表現(xiàn)的所需特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所需特性選自一個(gè)或多個(gè)抗體參 數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體參數(shù)選自抗原特異性、對(duì)抗原的親和力、能力、生物學(xué)功能、 表位識(shí)別、穩(wěn)定性、可溶性、生產(chǎn)效率、免疫原性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、生物利用率、組織交叉反 應(yīng)性、以及直向同源抗原結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白是多價(jià)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白是多特異性的。此處所述的多價(jià)和或多特異性結(jié)合蛋白具有特別從治療觀點(diǎn) 來看需要的特性。例如，多價(jià)和或多特異性結(jié)合蛋白可以(1)經(jīng)由細(xì)胞比二價(jià)抗體更快速 內(nèi)在化(和/或發(fā)生分解代謝)，所述細(xì)胞表達(dá)抗體與之結(jié)合的抗原；(2)是激動(dòng)劑抗體；和 /或(3)誘導(dǎo)表達(dá)多價(jià)抗體能夠與之結(jié)合的抗原的細(xì)胞的細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞凋亡。提供 多價(jià)和或多特異性結(jié)合蛋白的至少一種抗原結(jié)合特異性的“親本抗體”可以是，經(jīng)由表達(dá)抗 體與之結(jié)合的抗原的細(xì)胞內(nèi)在化(和/或發(fā)生分解代謝)的抗體；和/或可以是激動(dòng)劑、細(xì) 胞死亡誘導(dǎo)、和/或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)性抗體，且如本文所述的多價(jià)和或多特異性結(jié)合蛋白可 以展示這些特性中的一種或多種中的改善。此外，親本抗體可以缺乏這些特性中的一種或 多種，但如此處所述構(gòu)建為多價(jià)結(jié)合蛋白時(shí)可以賦予這些特性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如通過表面等離振子共振測(cè)量的，本發(fā)明的結(jié)合蛋白具 有的對(duì)于一種或多種靶的結(jié)合速率(on rate)常數(shù)(Kon)選自至少約IO2M4iT1 ；至少 約ΙΟ、-、—1 ；至少約ΙΟ 1 ；至少約IO5M-1S-1 ；和至少約IO6M"1 S^10在一個(gè)實(shí)施方案中，如 通過表面等離振子共振測(cè)量的，本發(fā)明的結(jié)合蛋白對(duì)于一種或多種靶具有的結(jié)合速率常 數(shù)(Kon)為 ΙΟ 1 至 IO3M-1S-1 ； IO3M"1 s"1 至 lOVs"1 ；lOVs—1 至 IO5M^1s"1 ；或 ΙΟ Υ1 至 IO6M-1S-1 之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如通過表面等離振子共振測(cè)量的，結(jié)合蛋白具有的對(duì)于 一種或多種靶的解離速率(off rate)常數(shù)(Koff)選自至多約ΙΟ、—1 ；至多約ΙΟ、—1 ； 至多約ΙΟ、—1 ；和至多約ΙΟ、—1。在一個(gè)實(shí)施方案中，如通過表面等離振子共振測(cè)量的， 本發(fā)明的結(jié)合蛋白具有的對(duì)于一種或多種靶的解離速率常數(shù)(Koff)為ioAtio^r1 ； IO-4S-LlO-5S-1 ；或 IO-VU。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白具有的對(duì)于一種或多種靶的解離常數(shù)(Kd)選自 至多約ICT7M ；至多約ICT8M ；至多約ICT9M ；至多約IiT10M ；至多約IiT11M ；至多約ICT12M ；和 至多10_13M。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白具有的對(duì)于其靶的解離常數(shù)(Kd)為 1 (T7M-ICT8M ； 1(Γ8Μ-1(Γ9Μ ;1(T9M-1(T1CIM ； KTici-Iir11M ； KT11M-Iir12M ；或 ICT12-M IO-13Mo在另一個(gè)實(shí)施方案中，此處所述的結(jié)合蛋白是進(jìn)一步包含選自下述的試劑的綴合 物免疫粘附分子、顯像劑、治療劑和細(xì)胞毒性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，顯像劑選自放射性標(biāo) 記、酶、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、磁性標(biāo)記、和生物素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，顯 像劑是選自下述的放射性標(biāo)記3H、14C、35S、9°Y、99Tc、mIn、125I、131I、177LU、166H0、和 153Sm0 在另 一個(gè)實(shí)施方案中，治療或細(xì)胞毒性劑選自抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、 抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環(huán)類、毒素、和細(xì)胞凋亡劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此處所述的結(jié)合蛋白是結(jié)晶結(jié)合蛋白且作為晶體存在。在 一個(gè)實(shí)施方案中，晶體是無載體的藥學(xué)控釋晶體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)晶結(jié)合蛋白具有 比所述結(jié)合蛋白的可溶性配對(duì)物更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)晶結(jié)合蛋白 保留生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此處所述的結(jié)合蛋白是糖基化的。例如，糖基化是人糖基化 模式。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及編碼此處公開的任何一種結(jié)合蛋白的分離的核酸。進(jìn) 一步的實(shí)施方案提供包含此處公開的分離的核酸的載體，其中所述載體選自pcDNA; pTT (Durocher 等人，Nucleic Acids Research 2002，第 30 卷，No. 2) ；pTT3(具有另外的多克隆位點(diǎn)的 PTT ；pEFBOS(Mizushima, S.和 Nagata，S.，(1990)Nucleic acids Research 第 18 卷，No. 17) ；pBV ；pJV ；pcDNA3. 1 TOPO, pEF6 TOPO 和 pBJ。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體是 在美國專利申請(qǐng)系列號(hào)61/021，282中公開的載體。在另一個(gè)方面，宿主細(xì)胞用此處公開的載體轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是 原核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)。在相關(guān)實(shí)施方案中，宿 主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，真核細(xì)胞選自原生生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì) 胞和真菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于，CH0, COS ； NSO、SP2、PER. C6或真菌細(xì)胞例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或昆蟲細(xì)胞 例如Sf9 ο在一個(gè)實(shí)施方案中，在單個(gè)重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)例如具有不同特異性的兩個(gè)或更 多個(gè)DVD-Ig。例如，已將抗體混合物的表達(dá)稱為Oligoclonics Merus B. V.，荷蘭)美國 專利號(hào) 7，262，028 ；7，429，486。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了生產(chǎn)此處公開的結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括在足 以生產(chǎn)結(jié)合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)同樣在此處公開的任何一種宿主細(xì)胞。在一個(gè) 實(shí)施方案中，通過這種方法生產(chǎn)的50% -75%的結(jié)合蛋白是雙重特異性四價(jià)結(jié)合蛋白。在 具體實(shí)施方案中，通過這種方法生產(chǎn)的75%-90%的結(jié)合蛋白是雙重特異性四價(jià)結(jié)合蛋 白。在具體實(shí)施方案中，生產(chǎn)的90% -95%的結(jié)合蛋白是雙重特異性四價(jià)結(jié)合蛋白。一個(gè)實(shí)施方案提供了用于釋放結(jié)合蛋白的組合物，其中所述組合物包含制劑， 所述制劑又包含如此處公開的結(jié)晶結(jié)合蛋白和成分，以及至少一種聚合載體。例如，聚 合載體是選自下述的一種或多種的聚合物聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、 聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羥基丁酸酯、聚己內(nèi)酯、聚二氧 雜環(huán)己酮(poly(dioxanone))、聚乙二醇、聚(羥丙基)甲基丙烯酰胺、聚有機(jī)磷腈、聚原 酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、馬來酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清 蛋白、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原、血纖蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、寡糖、糖胺聚糖 (glycaminoglycans)、硫酸化多糖、摻合物及其共聚物。例如，成分選自清蛋白、蔗糖、海藻 糖、乳糖醇(lactitol)、明膠、羥丙基-β-環(huán)糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一個(gè)實(shí) 施方案提供了用于治療哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的此處公開 的組合物的步驟。本發(fā)明還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含如此處公開的結(jié)合蛋白和藥學(xué) 可接受的載體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥物組合物包含用于治療病癥的至少一種另外的 治療劑。例如，另外的試劑選自治療劑，顯像劑，細(xì)胞毒性劑，血管發(fā)生抑制劑(包括但不 限于抗VEGF抗體或VEGF-trap)；激酶抑制劑(包括但不限于KDR和TIE-2抑制劑)；共刺 激分子阻斷劑(包括但不限于抗B7. 1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗⑶20)；粘附分子阻斷劑(包 括但不限于抗LFA-I抗體、抗E/L選擇蛋白抗體、小分子抑制劑)；抗細(xì)胞因子抗體或其功 能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF、和抗IL-6/細(xì)胞因子受體抗體)；氨甲蝶呤；環(huán)孢 菌素；雷帕霉素疋K506 ；可檢測(cè)標(biāo)記或報(bào)道分子；TNF拮抗劑；抗風(fēng)濕劑；肌肉弛緩劑，麻醉 藥，非類固醇消炎藥(NSAID)，止痛劑，麻醉劑，鎮(zhèn)靜劑，局部麻醉劑，神經(jīng)肌肉阻斷劑；抗微 生物劑，抗牛皮癬劑，皮質(zhì)類固醇，促蛋白合成類固醇，促紅細(xì)胞生成素，免疫接種，免疫球 蛋白，免疫抑制劑，生長(zhǎng)激素，激素替代藥物，放射性藥物，抗抑郁藥，抗精神病藥，刺激劑，哮喘藥物治療，β激動(dòng)劑，吸入類固醇，腎上腺素或類似物，細(xì)胞因子，和細(xì)胞因子拮抗劑。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療患有病癥的人受試者的方法，在所述病癥 中能夠由此處公開的結(jié)合蛋白結(jié)合的一種或多種靶是有害的，所述方法包括給人受試者施 用此處公開的結(jié)合蛋白，從而使得人受試者中的一種或多種靶的活性被抑制，并且多種癥 狀之一減輕或達(dá)到治療。例如，病癥選自關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、青少年慢性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān) 節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病、全身性紅斑狼瘡、Crohn氏 病、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、變應(yīng)性疾病、牛皮癬、 皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、與器官移植相關(guān)的急性或慢性免疫性疾病、 肉狀瘤病、動(dòng)脈粥樣硬化、彌散性血管內(nèi)凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、腎病綜合征、慢 性疲乏綜合征、韋格納氏肉芽腫病、過敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、腎顯微血 管炎、慢性活動(dòng)性肝炎、葡萄膜炎、膿毒性休克、中毒性休克綜合征、膿毒病綜合征、惡病質(zhì)、 傳染病、寄生蟲病、獲得性免疫缺陷綜合征、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏 病、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、原發(fā)性膽汁性肝硬變、溶血性貧血、惡性腫瘤、心力衰竭、心肌梗 死、Addison氏病、散發(fā)性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏綜合征、成人(急 性)呼吸窘迫綜合征、禿頭、斑禿(alopecia areata)、血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)病(arthopathy)、 關(guān)節(jié)病、Reiter氏病、牛皮癬性關(guān)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎性關(guān)節(jié)病、腸病性滑膜炎、衣原體、耶 爾森氏菌和沙門氏菌相關(guān)性關(guān)節(jié)病、脊椎關(guān)節(jié)病(spondyloarthopathy)、動(dòng)脈粥樣化疾病 /動(dòng)脈硬化、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性大皰性疾病、尋常天皰瘡、落葉狀天皰瘡、類天皰 瘡、線性IgA疾病、自身免疫性溶血性貧血、Coombs陽性溶血性貧血、獲得性惡性貧血、青 少年性惡性貧血、肌痛腦炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮膚念珠菌病、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、 原發(fā)性硬化性肝炎、隱原性自身免疫性肝炎、獲得性免疫缺陷病綜合征、獲得性免疫缺陷相 關(guān)病、乙型肝炎、丙型肝炎、常見的各種免疫缺陷(常見的可變低丙種球蛋白血癥)、擴(kuò)張型 心肌病、女性不育、卵巢衰竭、過早卵巢衰竭、纖維化肺疾病、隱原性纖維化肺泡炎、炎癥后 間質(zhì)性肺病、間質(zhì)性肺炎、結(jié)締組織病相關(guān)性間質(zhì)性肺病、混合型結(jié)締組織病相關(guān)性肺病、 全身性硬皮病相關(guān)性間質(zhì)性肺病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性間質(zhì)性肺病、全身性紅斑狼瘡相 關(guān)性肺病、皮肌炎/多肌炎相關(guān)性肺病、Sj5gren氏病相關(guān)性肺病、強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)性肺 病、脈管炎性彌散性肺病、含鐵血黃素沉著病相關(guān)性肺病、藥物誘導(dǎo)的間質(zhì)性肺病、纖維化、 放射性纖維化、閉塞性細(xì)支氣管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴細(xì)胞性浸潤(rùn)性肺病、傳染后間質(zhì) 性肺病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(傳統(tǒng)自身免疫性或狼瘡樣 肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自身免疫介導(dǎo)的低血糖、具有黑棘皮癥 的B型胰島素耐受性、甲狀旁腺機(jī)能減退、與器官移植相關(guān)的急性免疫性疾病、與器官移 植相關(guān)的慢性免疫性疾病、骨關(guān)節(jié)病、原發(fā)性硬化性膽管炎、1型牛皮癬、2型牛皮癬、特發(fā) 性白細(xì)胞減少(leucopaenia)、自身免疫性嗜中性白細(xì)胞減少癥、腎臟病N0S、腎小球腎炎 (glomerulon印hritides)、腎顯微血管炎(vasulitis)、萊姆病、盤狀紅斑狼瘡、特發(fā)性男性 不育癥或N0S、精子自身免疫性、多發(fā)性硬化(所有亞型)、交感性眼炎、結(jié)締組織病繼發(fā)的 肺動(dòng)脈高壓、Goodpasture氏綜合征、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎的肺表現(xiàn)、急性風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性脊椎 炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sj0rgren氏綜合征、Takayasu氏病/動(dòng)脈炎、自身免疫性 血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少癥、自身免疫性甲狀腺病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺腫性 (goitrous)自身免疫性甲狀腺功能減退(Hashimoto氏病)、萎縮性自身免疫性甲狀腺功能減退、原發(fā)性粘液性水腫、晶狀體性(phacogenic)葡萄膜炎、原發(fā)性血管炎、白癜風(fēng)急性 肝病、慢性肝病、酒精性肝硬變、酒精誘導(dǎo)的肝損傷、膽汁郁積(choleosatatis)、特應(yīng)性肝 病、藥物誘導(dǎo)的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、變態(tài)反應(yīng)和哮喘、B群鏈球菌(GBS)感染、精神 障礙(例如，抑郁和精神分裂癥)、Th2型和Thl型介導(dǎo)的疾病、急性和慢性痛(不同形式的 疼痛)、以及癌癥例如肺、乳腺、胃、膀胱、結(jié)腸、胰、卵巢、前列腺和直腸癌以及造血惡性腫瘤 (白血病和淋巴瘤)、無β脂蛋白血癥(Abetalipoprotemia)、手足發(fā)紺、急性和慢性寄生 或感染過程、急性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性髓細(xì)胞樣白血病(AML)、急 性或慢性細(xì)菌感染、急性胰腺炎、急性腎功能衰竭、腺癌、心房(aerial)異位搏動(dòng)、AIDS癡 呆復(fù)征、酒精誘導(dǎo)的肝炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、過敏性接觸性皮炎、變應(yīng)性鼻炎、同種異體移植物 排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎縮性側(cè)索硬化、貧血、心絞痛、前角細(xì)胞(horn cell)變 性、抗cd3治療、抗磷脂綜合征、抗受體超敏反應(yīng)、主動(dòng)脈和周圍性動(dòng)脈瘤(aneuryisms)、主 動(dòng)脈壁夾層形成、高動(dòng)脈壓、動(dòng)脈硬化、動(dòng)靜脈瘺、共濟(jì)失調(diào)、心房纖維顫動(dòng)(持續(xù)性或陣發(fā) 性)、心房撲動(dòng)、房室傳導(dǎo)阻滯、B細(xì)胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支傳 導(dǎo)阻滯、Burkitt氏淋巴瘤、燒傷、心律失常、心臟震暈綜合征、心臟腫瘤、心肌病、心肺分流 術(shù)炎癥應(yīng)答、軟骨移植排斥、小腦皮質(zhì)變性、小腦病癥、紊亂性或多源性房性心動(dòng)過速、化學(xué) 療法相關(guān)病癥、慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理學(xué)、慢性淋巴細(xì)胞 性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水楊酸鹽中毒、結(jié)腸直腸癌、充血性心 力衰竭、結(jié)膜炎、接觸性皮炎、肺源性心臟病、冠狀動(dòng)脈疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培養(yǎng)物 陰性膿毒病、囊性纖維化、細(xì)胞因子療法相關(guān)病癥、拳擊員癡呆(Dementia pugilistica)、 脫髓鞘病、登革出血熱、皮炎、皮膚病學(xué)狀況、多尿癥(diabetes)、糖尿病、糖尿病性動(dòng)脈硬 化性(ateriosclerotic)疾病、彌漫性Lewy小體病、擴(kuò)張性充血性心肌病、基底神經(jīng)節(jié)病 癥、中年唐氏綜合征、由阻斷CNS多巴胺受體的藥物誘導(dǎo)的藥物誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)障礙、藥物敏感 性、濕疹、腦脊髓炎、心內(nèi)膜炎、內(nèi)分泌病、會(huì)厭炎、EB病毒感染、紅斑性肢痛病、錐體外束和 小腦病癥、家族性嗜血性(hematophagocytic)淋巴組織細(xì)胞增多癥、胎兒胸腺移植排斥、 Friedreich氏共濟(jì)失調(diào)、功能性外周性動(dòng)脈病癥、真菌性膿毒病、氣性壞疽病、胃潰瘍、腎 小球腎炎、任何器官或組織的移植物排斥、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽性膿毒病、由于細(xì) 胞內(nèi)生物的肉芽腫、毛細(xì)胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲狀腺炎、枯 草熱、心臟移植排斥、血色素沉著癥、血液透析、溶血性尿毒性綜合征/血栓溶解性血小板 減少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常(arrythmias)、HIV感染/HIV神經(jīng)病、何杰 金氏病、運(yùn)動(dòng)過度性運(yùn)動(dòng)障礙、超敏反應(yīng)、超敏感性肺炎、高血壓、運(yùn)動(dòng)機(jī)能減退性運(yùn)動(dòng)障 礙、下丘腦_垂體_腎上腺軸評(píng)價(jià)、特發(fā)性Addison氏病、特發(fā)性肺纖維化、抗體介導(dǎo)的細(xì) 胞毒性、虛弱、嬰兒型脊髓性肌萎縮、主動(dòng)脈炎癥、流行性感冒a、電離輻射照射、虹膜睫狀 體炎/葡萄膜炎/視神經(jīng)炎、缺血性再灌注損傷、缺血性中風(fēng)、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青 少年脊髓性肌萎縮、卡波西氏肉瘤、腎移植排斥、軍團(tuán)桿菌、利什曼病、麻風(fēng)病、皮層脊髓系 統(tǒng)損傷、脂肪水腫、肝移植排斥、淋巴水腫(lymphederma)、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細(xì) 胞增多癥、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血癥、代謝性/特發(fā)性疾病、偏頭痛、線粒體多 系統(tǒng)病癥、混合型結(jié)締組織病、單克隆丙種球蛋白病、多發(fā)性骨髓瘤、多系統(tǒng)變性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Jos印h)、重癥肌無力、鳥胞內(nèi)分支桿菌、結(jié)核分 支桿菌、骨髓異常增生綜合征、心肌梗死、心肌缺血性病癥、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎變病、神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)原性I肌萎縮、嗜中性粒細(xì)胞減少性發(fā)燒、非何杰金淋巴瘤、 腹主動(dòng)脈及其分支閉塞、閉塞性動(dòng)脈病癥、okt3治療、睪丸炎/附睪炎(印idydimitis)、 睪丸炎/輸精管切除術(shù)逆轉(zhuǎn)操作、器官巨大癥、骨質(zhì)疏松癥、胰移植排斥、胰癌、惡性腫瘤 的腫瘤相關(guān)綜合征/高鈣血癥、甲狀旁腺移植排斥、盆腔炎癥性疾病、常年性鼻炎、心包疾 病、外周性動(dòng)脈粥樣硬化(atherlosclerotic)疾病、外周血管病癥、腹膜炎、惡性貧血、卡 氏肺囊蟲性肺炎、肺炎、POEMS綜合征(多發(fā)性神經(jīng)病、器官巨大癥、內(nèi)分泌病、單克隆丙種 球蛋白病、和皮膚變化綜合征)、灌注后綜合征、泵后綜合征、MI心切開術(shù)后綜合征、先兆 子癇、進(jìn)行性核上(supranucleo)麻痹、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、放射治療、Raynaud氏現(xiàn)象和 疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常規(guī)狹窄QRS心動(dòng)過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、 限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小體型老年性癡呆、血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié) 病、中風(fēng)、鐮狀細(xì)胞貧血、皮膚同種異體移植物排斥、皮膚變化綜合征、小腸移植排斥、實(shí)體 瘤、特殊心律失常(arrythmias)、脊髓性共濟(jì)失調(diào)、脊髓小腦變性、鏈球菌肌炎、小腦結(jié)構(gòu) 損傷、亞急性硬化性全腦炎、暈厥、心血管系統(tǒng)梅毒、全身性過敏反應(yīng)(anaphalaxis)、全身 炎癥反應(yīng)綜合征、全身發(fā)作性青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、T細(xì)胞或FAB ALL、毛細(xì)血管擴(kuò)張、血 栓閉塞性脈管炎、血小板減少癥、毒性、移植物、創(chuàng)傷/出血、III型超敏反應(yīng)、IV型超敏反 應(yīng)、不穩(wěn)定心絞痛、尿毒癥、尿膿毒病、蕁麻疹、心臟瓣膜疾病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、 靜脈血栓形成、心室纖維性顫動(dòng)、病毒和真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關(guān) 性噬紅細(xì)胞(hemaphagocytic)綜合征、Wernicke-Korsakoff綜合征、Wilson氏病、任何器 官或組織的異種移植排斥、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、急性特發(fā)性多神經(jīng)炎、急性炎性脫髓鞘性 多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病、急性缺血、成人Still氏病、斑禿、過敏反應(yīng)、抗磷脂抗體綜合征、 再生障礙性貧血、動(dòng)脈硬化、特應(yīng)性濕疹、特應(yīng)性皮炎、自身免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關(guān) 的自身免疫性病癥、自身免疫性腸病、自身免疫性聽力喪失、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合 征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性過早卵巢衰竭、瞼炎、支氣管擴(kuò)張、大皰性類天皰 瘡、心血管病、災(zāi)變性抗磷脂綜合征、乳糜瀉、頸椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬、慢性缺血、疤痕性類天皰瘡、具 有多發(fā)性硬化風(fēng)險(xiǎn)的臨床孤立綜合征(clinically isolated syndrome) (cis)、結(jié)膜炎、 兒童期發(fā)病性精神病(childhood onset psychiatric disorder)、慢性阻塞性肺部疾病 (COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病、椎間盤突出(disk herniation)、盤脫 垂(disk prolaps)、藥物誘導(dǎo)的免疫性溶血性貧血、心內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位、眼內(nèi)炎、鞏膜 外層炎、多形性紅斑、重型多形性紅斑、妊娠期類天皰瘡、Guillain-Barre綜合征(GBS)、枯 草熱、Hughes綜合征、特發(fā)性帕金森氏病、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)、免疫 性溶血性貧血、內(nèi)含體肌炎、傳染性眼炎性疾病、炎性脫髓鞘疾病、炎性心臟病、炎性腎病、 IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜結(jié)膜炎(keratojuntivitis sicca)、Kussmaul病或 Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格漢斯(Langerhan，s)細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、網(wǎng)狀 青斑、黃斑變性、顯微鏡下多脈管炎、morbus bechterev、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病癥、粘膜類天皰瘡、 多器官衰竭、重癥肌無力、脊髓異常增生綜合征、心肌炎、神經(jīng)根障礙、神經(jīng)病、非甲非乙型 肝炎、視神經(jīng)炎、骨質(zhì)溶解、卵巢癌、少關(guān)節(jié)的JRA、周圍動(dòng)脈閉塞性疾病(PAOD)、周圍血管 疾病(PVD)、外周動(dòng)脈疾病(PAD)、靜脈炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(或結(jié)節(jié)性動(dòng)脈外膜炎)、多軟 骨炎、風(fēng)濕性多肌病、白發(fā)癥、多關(guān)節(jié)的JRA、多發(fā)性內(nèi)分泌缺陷綜合征、多肌炎、風(fēng)濕性多肌 病(PMR)、泵后綜合征(post-pump syndrome)、原發(fā)性帕金森綜合征、前列腺和直腸癌以及
29造血惡性腫瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、單純紅細(xì)胞再生障礙、原發(fā)性腎上腺機(jī)能不 足、復(fù)發(fā)型視神經(jīng)脊髓炎、再狹窄、風(fēng)濕性心臟病、sapho(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚和骨 炎)、硬皮病、繼發(fā)性淀粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經(jīng)痛、繼發(fā)性腎上腺機(jī)能不足、聚 硅氧烷相關(guān)的結(jié)締組織病、sneddon-wilkinson皮膚病、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(spondilitis ankylosans)、Stevens-Johnson綜合征(SJS)、全身性炎癥應(yīng)答綜合征、顳動(dòng)脈炎、弓形 體視網(wǎng)膜炎、中毒性表皮壞死松解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體，I型變態(tài) 反應(yīng)，II型糖尿病、蕁麻疹、普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)、脈管炎、春季結(jié)膜炎、病毒性視網(wǎng) 膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada綜合征(VKH綜合征)、濕黃斑變性、傷口愈合、耶爾森氏菌 (yersinia)和沙門氏菌(salmonella)相關(guān)的關(guān)節(jié)病。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明的組合物和方法治療或診斷的疾病包括但不限 于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥，包括乳腺、結(jié)腸、直腸、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、膽囊和膽 管、小腸、尿道(包括腎、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宮頸、子宮和卵巢，以及絨 毛膜癌和妊娠性滋養(yǎng)層細(xì)胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睪丸和生殖細(xì)胞腫瘤)、 內(nèi)分泌腺(包括甲狀腺、腎上腺和腦下垂體)和皮膚的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括 從骨和軟組織產(chǎn)生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，腦、神經(jīng)、眼和腦膜(包括星形細(xì)胞瘤、神經(jīng) 膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤(Schwannomas) 和腦膜瘤)的腫瘤，從造血惡性腫瘤例如白血病和淋巴瘤(何杰金與非何杰金淋巴瘤)產(chǎn) 生的實(shí)體瘤。本發(fā)明的DVD-Igs也可以治療一種或多種下列疾病急性冠狀動(dòng)脈綜合征、急性 特發(fā)性多神經(jīng)炎、急性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病、急性缺血、成人still氏病、 斑禿、過敏反應(yīng)、抗磷脂抗體綜合征、再生障礙性貧血、動(dòng)脈硬化、特應(yīng)性濕疹、特應(yīng)性皮炎、 自身免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關(guān)的自身免疫性病癥、自身免疫性聽力喪失、自身免疫性 淋巴細(xì)胞增生綜合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性血小板減少癥(AITP)、瞼炎、 支氣管擴(kuò)張、大皰性類天皰瘡、心血管病、災(zāi)變性抗磷脂綜合征、乳糜瀉、頸椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬、慢 性缺血、疤痕性類天皰瘡、具有多發(fā)性硬化風(fēng)險(xiǎn)的臨床孤立綜合征(CIS)、結(jié)膜炎、兒童期發(fā) 病性精神病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病、椎 間盤突出、盤脫垂、藥物誘導(dǎo)的免疫性溶血性貧血、心內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位、眼內(nèi)炎、鞏膜 外層炎、多形性紅斑、重型多形性紅斑、妊娠期類天皰瘡、Guillain-Barre綜合征(GBS)、枯 草熱、Hughes綜合征、特發(fā)性帕金森氏病、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)、免疫 性溶血性貧血、內(nèi)含體肌炎、傳染性眼炎性疾病、炎性脫髓鞘疾病、炎性心臟病、炎性腎病、 IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜結(jié)膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏 麻痹、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、網(wǎng)狀青斑、黃斑變性、惡性腫瘤、顯微鏡下多脈管炎、 Morbus Bechterev、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病癥、粘膜類天皰瘡、多器官衰竭、重癥肌無力、脊髓異常增 生綜合征、心肌炎、神經(jīng)根障礙、神經(jīng)病、非甲非乙型肝炎、視神經(jīng)炎、骨質(zhì)溶解、卵巢癌、少 關(guān)節(jié)的JRA、周圍動(dòng)脈閉塞性疾病(PAOD)、周圍血管疾病(PVD)、外周動(dòng)脈疾病(PAD)、靜脈 炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(或結(jié)節(jié)性動(dòng)脈外膜炎)、多軟骨炎、風(fēng)濕性多肌病、白發(fā)癥、多關(guān)節(jié)的 JRA、多發(fā)性內(nèi)分泌缺陷綜合征、多肌炎、風(fēng)濕性多肌病(PMR)、泵后綜合征、原發(fā)性帕金森綜 合征、前列腺和直腸癌以及造血惡性腫瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、單純紅細(xì)胞再生 障礙、原發(fā)性腎上腺機(jī)能不足、復(fù)發(fā)型視神經(jīng)脊髓炎、再狹窄、風(fēng)濕性心臟病、SAPHO(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、繼發(fā)性淀粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經(jīng) 痛、繼發(fā)性腎上腺機(jī)能不足、聚硅氧烷相關(guān)的結(jié)締組織病、Sneddon-Wilkinson皮膚病、關(guān) 節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、Stevens-Johnson綜合征(SJS)、全身性炎癥應(yīng)答綜合征、顳動(dòng)脈炎、弓形 體視網(wǎng)膜炎、中毒性表皮壞死松解、橫貫性脊髓炎、TRAPS (腫瘤壞死因子受體，I型變態(tài)反 應(yīng)，II型糖尿病、蕁麻疹、普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)、脈管炎、春季結(jié)膜炎、病毒性視網(wǎng)膜炎、 Vogt-Koyanagi-Harada綜合征(VKH綜合征)、濕黃斑變性和傷口愈合。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分在單獨(dú)地或與放射治療和 /或其他化療劑組合地使用時(shí)，用于治療癌癥或預(yù)防此處所述腫瘤的轉(zhuǎn)移。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患有病癥的患者的方法，所述方法包括在如此 處討論的第二種試劑施用之前、同時(shí)或之后，施用此處公開的任何一種結(jié)合蛋白的步驟。在 具體實(shí)施方案中，第二種試劑選自布地萘德，表皮生長(zhǎng)因子，皮質(zhì)類固醇，環(huán)孢菌素，柳氮磺 吡啶，氨基水楊酸鹽，6-巰基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制劑，美沙拉秦，奧沙拉 嗪，巴柳氮，抗氧化劑，血栓烷抑制劑，IL-I受體拮抗劑，抗IL-I β mAbs，抗IL-6或IL-6受 體mAbs，生長(zhǎng)因子，彈性蛋白酶抑制劑，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-U IL_2、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II, GM-CSF、FGF 和 PDGF 抗 體或激動(dòng)劑，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90 或其配 體的抗體，氨甲蝶呤，環(huán)孢菌素，Π(506，雷帕霉素，霉酚酸酯，來氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮 質(zhì)類固醇，強(qiáng)的松龍，磷酸二酯酶抑制劑，腺苷激動(dòng)劑，抗凝劑，補(bǔ)體抑制劑，腎上腺素能藥， IRAK, NIK, IKK, p38，MAP激酶抑制劑，IL-I β轉(zhuǎn)換酶抑制劑，TNF α轉(zhuǎn)換酶抑制劑，T細(xì)胞發(fā) 信號(hào)抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，柳氮磺吡唆，硫唑嘌呤，6-巰基嘌呤，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑 制劑，可溶性細(xì)胞因子受體，可溶性P55TNF受體，可溶性p75TNF受體，sIL_lRI、sIL_lRII、 sIL-6R，抗炎細(xì)胞因子，IL-4、IL-10、IL-IU IL-13 和 TGFβ。在具體實(shí)施方案中，此處公開的藥物組合物經(jīng)由選自下述的至少一種模式給患 者施用腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intrarticular)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨 內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、 腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀 胱內(nèi)、快速灌注(bolus)、陰道、直腸、口腔含化、舌下、鼻內(nèi)、和經(jīng)皮。本發(fā)明的一個(gè)方面提供針對(duì)本發(fā)明的至少一種結(jié)合蛋白的至少一種抗獨(dú)特型抗 體?？躬?dú)特型抗體包括包含分子的任何蛋白或肽，所述分子包含至少部分免疫球蛋白分子， 例如但不限于，重或輕鏈的至少一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分，重鏈或輕鏈 可變區(qū)，重鏈或輕鏈恒定區(qū)，構(gòu)架區(qū)，或其可以摻入本發(fā)明的結(jié)合蛋白內(nèi)的任何部分。附圖簡(jiǎn)述圖IA是雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)-Ig構(gòu)建體的示意圖示，且顯示了從2種親本抗體 產(chǎn)生DVD-Ig的策略；

圖18是構(gòu)建體0￥01-18、0￥02-18，以及來自雜交瘤克隆2013丄3(抗-11^-10)和 13F5. G5 (抗-IL-I β )的2種嵌合單特異性抗體的示意圖示。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及能夠結(jié)合2種或更多抗原的多價(jià)和/或多特異性結(jié)合蛋白。具體而 言，本發(fā)明涉及雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白(DVD-Ig)、及其藥物組合物、以及用于制備此種DVD-Igs的核酸、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包含了使用本發(fā)明的DVD-Igs在體外 或體內(nèi)檢測(cè)特異性抗原的方法。除非本文另有定義，連同本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員通常理解的含義。術(shù)語的含義和范圍應(yīng)當(dāng)清晰，然而，在任何潛在不明確性的情況下，本 文提供的定義優(yōu)先于任何字典或外來定義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù) 數(shù)，且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。在本申請(qǐng)中，除非另有說明，“或”的使用意味著“和/或”。此 外，術(shù)語“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同樣，除非另有具體說明，術(shù)語例如“元 件”或“組分”涵蓋包含一個(gè)單位的元件和組分以及包含超過一個(gè)亞單位的元件和組分。一般地，連同本文描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué) 以及蛋白和核酸化學(xué)和雜交使用的命名法和其技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知和通常使用的那些。 除非另有說明，本發(fā)明的方法和技術(shù)一般根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知，且如各種一般和更具體的 參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法來進(jìn)行，所述參考文獻(xiàn)在本說明書自始至終引用和討論。酶促 反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)制造商的說明書、如本領(lǐng)域通常實(shí)現(xiàn)的或如本文所述來進(jìn)行。連同本 文描述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)以及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)使用的命名法、以及其實(shí)驗(yàn)室程序 和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知和通常使用的那些。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物 制備、配制、和遞送、以及患者治療。為了本發(fā)明可以更容易地理解，選擇的術(shù)語在下文定義。 如本文使用的，術(shù)語“多肽”指氨基酸的任何聚合鏈。術(shù)語“肽”和“蛋白，，可與術(shù) 語多肽互換使用，且同樣指氨基酸的聚合鏈。術(shù)語“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段 和蛋白序列的多肽類似物。多肽可以是單體或聚合的。除非另外與上下文矛盾，此處使用 “多肽”意在包含多肽和其片段及變體(包括變體的片段)。對(duì)于抗原多肽，多肽片段任選 含有至少一個(gè)連續(xù)或非線性多肽表位?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普通方法確定至少一個(gè)表位片段的 精確邊界。該片段包含至少約5個(gè)鄰接氨基酸，例如至少約10個(gè)鄰接氨基酸、至少約15個(gè) 鄰接氨基酸、或至少約20個(gè)鄰接氨基酸。多肽變體如此處所述。術(shù)語“分離的蛋白”或“分離的多肽”是這樣的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或來 源不與天然結(jié)合的組分結(jié)合，所述天然結(jié)合的組分在其天然狀態(tài)下與其伴隨；基本上不合 來自相同物種的其他蛋白；由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)；或在自然界中不存在。因此，化學(xué) 合成或在不同于其天然起源的細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽將是與其天然結(jié)合的組分“分 離的”。還可以通過分離，使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白純化技術(shù)，使得蛋白基本上不含天然 結(jié)合的組分。如本文使用的，術(shù)語“回收”指通過分離，例如使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白純化技 術(shù)，使得化學(xué)種類例如多肽基本上不含天然結(jié)合的組分的過程。如本文使用的，“生物學(xué)活性”指分子的任一項(xiàng)或多項(xiàng)固有生物學(xué)特性(無論是如 體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的那樣天然存在的，還是通過重組方法提供或使成為可能的)。生物學(xué)特性包括但 不限于結(jié)合受體；誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，和酶促 活性。生物學(xué)活性也包括Ig分子的活性。如本文使用的，關(guān)于抗體、蛋白、或肽與第二種化學(xué)種類相互作用的術(shù)語“特異性 結(jié)合”或“特異地結(jié)合”，意指相互作用取決于化學(xué)種類上特定結(jié)構(gòu)(例如，抗原決定簇或表 位)的存在；例如，抗體識(shí)別且與特定蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合而不是一般地與蛋白結(jié)合。如果抗體對(duì)表位“A”特異，那么在包含標(biāo)記的“A”和抗體的反應(yīng)中，包含表位A的分子(或游離的，未 標(biāo)記的A)的存在將減少與抗體結(jié)合的標(biāo)記的A的量。如本文使用的，術(shù)語“抗體”廣泛地指包含4條多肽鏈-2條重(H)鏈和2條輕(L) 鏈的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位結(jié)合特征的任何功能片段、突 變體、變體或衍生。此種突變體、變體或衍生抗體形式是本領(lǐng)域已知的。其非限制性實(shí)施方 案在下文討論。在全長(zhǎng)抗體中，每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒 定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中 縮寫為L(zhǎng)CVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含1個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一 步細(xì)分成稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，用稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的較保守區(qū)域點(diǎn)綴。每個(gè) VH和VL由3個(gè)⑶Rs和4個(gè)FRs組成，以下列順序從氨基末端到羧基末端排列FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，I gG、I gE、I gM、I gD、I gA 和 IgY)、種類(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類。術(shù)語“Fe區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)域，它可以通過完整抗體的木瓜 蛋白酶消化來產(chǎn)生。Fc區(qū)可以是天然序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。免疫球蛋白的Fc區(qū)一般包 含2個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域-CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，且任選包含CH4結(jié)構(gòu)域。Fc部分中改變抗 體效應(yīng)子功能的氨基酸殘基替換是本領(lǐng)域已知的(Winter等人，美國專利號(hào)5，648，260和 5，624，821)。抗體的Fc部分介導(dǎo)幾種重要的效應(yīng)子功能，例如細(xì)胞因子誘導(dǎo)、ADCC、吞噬作 用、依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)以及抗體和抗原-抗體復(fù)合物的半衰期/清除率。取決于 治療目的，在一些情況下這些效應(yīng)子功能對(duì)于治療抗體是所需的，但在其他情況下可能是 不必要的或甚至有害的。某些人IgG同種型，特別是IgGl和IgG3，經(jīng)由分別與Fc YRs和 補(bǔ)體Clq結(jié)合介導(dǎo)ADCC和⑶C。新生Fc受體(Fcfoi)是決定抗體循環(huán)半衰期的關(guān)鍵組分。 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸殘基在抗體恒定區(qū)例如抗體Fc區(qū)中進(jìn)行替換，從 而使得抗體的效應(yīng)子功能被改變。免疫球蛋白的2條相同重鏈的二聚化由CH3結(jié)構(gòu)域的二 聚化來介導(dǎo)，且通過鉸鏈區(qū)內(nèi)的二硫鍵來穩(wěn)定(Huber等人，Nature ；264 :415-20 ；Thies等 人，1999 J Mol Biol ；293 :67-79.)。鉸鏈區(qū)內(nèi)的半胱氨酸殘基突變以阻止重鏈-重鏈二硫 鍵將使CH3結(jié)構(gòu)域的二聚化不穩(wěn)定。負(fù)責(zé)CH3 二聚化的殘基已得到鑒定(Dall'Acqua 1998 Biochemistry 37 :擬66_73.)。因此，可能產(chǎn)生單價(jià)半_Ig。有趣的是，已在自然界中發(fā)現(xiàn) 關(guān)于 IgG 和 IgA 亞類的這些單價(jià)半 Ig 分子(Seligman 1978 Ann Immunol 129 :855-70 ； Biewenga等人，1983 Clin Exp Immunol 51 :395-400)。FcRn Ig Fc 區(qū)的化學(xué)計(jì)量已測(cè)定 為 2 1 (West 等人，2000 Biochemistry 39 :9698-708)，且半 Fc 足以介導(dǎo) FcRn 結(jié)合(Kim 等人，1994 Eur J Immunol ；M :542-548.)。破壞CH3結(jié)構(gòu)域二聚化的突變可能對(duì)其Fcfoi 結(jié)合沒有更大的不利作用，因?yàn)閷?duì)于CH3 二聚化重要的殘基位于CH3 b折疊結(jié)構(gòu)的內(nèi)界面 上，而負(fù)責(zé)Fcfoi結(jié)合的區(qū)域位于CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的外界面上。然而，由于其比常規(guī)抗體的 那種更小的尺寸，半Ig分子可以在組織穿透中具有某些優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一 個(gè)氨基酸殘基在本發(fā)明的結(jié)合蛋白的恒定區(qū)例如Fc區(qū)中進(jìn)行替換，從而使得重鏈的二聚 化被破壞，從而產(chǎn)生半DVD Ig分子。IgG的抗炎癥活性完全取決于IgG Fc片段N-聯(lián)聚糖 的唾液酸化作用。已經(jīng)確定了對(duì)抗炎癥活性準(zhǔn)確的聚糖要求，這樣就可以生成合適的IgGl Fc片段，從而生成具有大大增強(qiáng)的能力的完全重組的唾液酸化IgGl Fc (Anthony, R. Μ.，等人(2008)Science 320 :373-376)。如本文使用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)單地“抗體部分”)，指保留與 抗原特異性結(jié)合的能力的一種或多種抗體片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng) 抗體的片段來執(zhí)行。此種抗體實(shí)施方案也可以是雙特異性、雙重特異性、或多特異性形式； 與2種或更多不同抗原特異性結(jié)合。包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)的結(jié)合片段的 例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段， 包含由鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成 的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人， (1989) Nature 341 :544-546, Winter 等人，PCT 公開 WO 90/05144 Al)，它包含單個(gè)可變結(jié) 構(gòu)域；和(vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由分 開的基因編碼，但它們可以使用重組方法通過合成接頭來連接，所述合成接頭使得它們能 夠作為單條蛋白鏈制備，在所述單條蛋白鏈中VL和VH區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱為單鏈 Fv(scFv)；參見，例如，Bird 等人，(1988) Science 242 :423-426 和 Huston 等人,(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。此種單鏈抗體也預(yù)期包含在術(shù)語抗體的“抗原 結(jié)合部分”內(nèi)。也包含其他形式的單鏈抗體例如雙抗體。雙抗體是二價(jià)、雙特異性抗體，其中 VH和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用的接頭太短而不允許相同鏈上的2個(gè)結(jié)構(gòu)域之 間的配對(duì)，從而促使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)且產(chǎn)生2個(gè)抗原結(jié)合部位(參見 例如，Holliger，P.等人，(1993)Proc. Natl. Acad. ki. USA 90 :6444-6448 ；Poljak,R. J.等 人，(1994) Structure 2 :1121-1123) 此種抗體結(jié)合部分是本領(lǐng)域已知的(Kontermann和 Dubel eds. , Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.第 790 頁(ISBN 3440-41354-5)。此外，單鏈抗體還包括包含一對(duì)串聯(lián)Fv區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)的“線 性抗體”，所述串聯(lián)Fv區(qū)段連同互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)域(Zapata等人， Protein Eng. 8(10) :1057-1062(1995)；和美國專利號(hào) 5，641，870)。術(shù)語“多價(jià)結(jié)合蛋白”在本說明書自始至終用于指包含2種或更多抗原結(jié)合部位 的結(jié)合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)結(jié)合蛋白經(jīng)工程改造為具有3個(gè)或更多抗原結(jié)合部 位，且一般不是天然存在的抗體。術(shù)語“多特異性結(jié)合蛋白”指能夠結(jié)合2種或更多相關(guān)或 無關(guān)靶的結(jié)合蛋白。本發(fā)明的雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)結(jié)合蛋白包含2個(gè)或更多抗原結(jié)合部 位，且是四價(jià)或多價(jià)結(jié)合蛋白。DVDs可以是單特異性的，即能夠結(jié)合一種抗原，或多特異性 的，即能夠結(jié)合2種或更多抗原。包含2條重鏈DVD多肽和2條輕鏈DVD多肽的DVD結(jié)合 蛋白稱為DVD-Ig。每一半DVD-Ig包含重鏈DVD多肽，和輕鏈DVD多肽，和2個(gè)抗原結(jié)合部 位。每個(gè)結(jié)合部位包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)抗原結(jié)合部位總共6 個(gè)涉及抗原結(jié)合的CDRs。如本文使用的，術(shù)語“雙特異性抗體”指通過下述產(chǎn)生的全長(zhǎng)抗體，四源雜交瘤技 術(shù)(參見 Milstein，C.和 A. C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934)第 537-40 頁)，2 種不同單 克隆抗體的化學(xué)綴合(參見Staerz, U. D.等人，Nature, 1985. 314(6012)第628-31頁)， 或結(jié)進(jìn)孔或在Fc區(qū)中引入突變的類似方法(參見HolIiger，P.，T. Prospero和G. Winter, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(14)第 6444-8. 18 頁)，從而導(dǎo)致其中只有一種是功 能性雙特異性抗體的多種不同免疫球蛋白種類。通過分子功能，雙特異性抗體結(jié)合其2個(gè) 結(jié)合臂之一(1對(duì)HC/LC)上的一種抗原(或表位)，且結(jié)合其第二個(gè)臂(不同對(duì)的HC/LC)上的不同抗原(或表位)。通過這個(gè)定義，雙特異性抗體具有2個(gè)不同的抗原結(jié)合臂(在特 異性和CDR序列中)，且對(duì)于其結(jié)合的每種抗原是單價(jià)的。如本文使用的，術(shù)語“雙重特異性抗體”指可以在其2個(gè)結(jié)合臂的每一個(gè)中(一對(duì) HC/LC)結(jié)合2種不同抗原(或表位)的全長(zhǎng)抗體(參見PCT公開WO 02/02773)。因此，雙 重特異性結(jié)合蛋白具有2個(gè)相同的抗原結(jié)合臂，具有相同的特異性和相同的CDR序列，且對(duì) 于其結(jié)合的每種抗原是二價(jià)的。結(jié)合蛋白的“功能性抗原結(jié)合部位”是能夠結(jié)合靶抗原的結(jié)合部位?？乖Y(jié)合部 位的抗原結(jié)合親和力不必與抗原結(jié)合部位由其衍生的親本抗體一樣強(qiáng)，但結(jié)合抗原的能力 必須是可使用已知用于評(píng)估與抗原結(jié)合的抗體的多種方法中的任何一種測(cè)量的。此外，本 文的多價(jià)抗體的每個(gè)抗原結(jié)合部位的抗原結(jié)合親和力無需在量上相同。術(shù)語“細(xì)胞因子”是由一種細(xì)胞群體釋放的蛋白的一般術(shù)語，所述蛋白作為細(xì)胞 間介質(zhì)作用于另一種細(xì)胞群體。此種細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子、和傳統(tǒng)的多 肽激素。在細(xì)胞因子中包括的是生長(zhǎng)激素例如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素、和牛 生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例 如促卵胞激素(FSH)，促甲狀腺激素(TSH)，和黃體生成素(LH)；肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子α和β ；米勒抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素 相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng) 因子例如NGF-α ；血小板生長(zhǎng)因子；胎盤生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFs)例如TGF-α和 TGF-β ；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1和-11;促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素例如 干擾素-α、-β和-γ集落刺激因子(CSFs)例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞巨噬細(xì) 胞-CSF(GM-CSF)；和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白細(xì)胞介素(ILs)例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、 IL-23、IL-33 ；腫瘤壞死因子例如TNF- α或TNF- β ；及其他多肽因子包括LIF和kit配體 (KL)。如本文使用的，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)的蛋白，以及天 然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等價(jià)物。術(shù)語“接頭”用于指包含通過肽鍵連接的2個(gè)或更多氨基酸殘基的多肽，且用于連 接一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合部分。此種接頭多肽是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，Holliger, P.等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 巡6444-6448 ;Poljak，R. J.等人，(1994) Structure 2 :1121-1123) 示例性接頭包括但不限于，AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 1) ；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO 2) ；AKTTPKLGG (SEQ ID NO 3) ；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO 4) ；SAKTTP(SEQ ID NO 5) ；RADAAP(SEQ ID NO 6) ；RADAAPTVS(SEQ ID NO 7)； RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO 8) ；RADAAAA(G4S) 4(SEQ ID NO 9) ；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO 10) ；ADAAP(SEQ ID NO 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO 12) ； TVAAP(SEQ ID NO: 13) ；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO :14) ；QPKAAP(SEQ ID NO 15) ；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) ；AKTTPP(SEQ ID NO :17) ；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO 18) ；AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ；AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO 20) ；ASTKGP (SEQ ID NO 21) ；ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO 23) ；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO 24)； GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO 25)；以及 GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO :26)。免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域指重或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。人IgG重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的。如本文使用的，術(shù)語“單克隆抗體”或“mAb”指從基本上均質(zhì)抗體群體中獲得的抗 體，即構(gòu)成群體的個(gè)別抗體是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突變。單克隆抗 體是高度特異性的，針對(duì)單一抗原。此外，與一般包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體 的多克隆抗體制劑形成對(duì)照，每種mAb針對(duì)抗原上的單一決定簇。修飾語“單克隆”不應(yīng)解 釋為需要通過任何具體方法生產(chǎn)抗體。如本文使用的，術(shù)語“人抗體”預(yù)期包括具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變 和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括例如在CDRs且特別是CDR3中，不由人種系免 疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，在體外通過隨機(jī)或位點(diǎn)專一誘變或在體內(nèi)通過體 細(xì)胞突變引入的突變)。然而，如本文使用的，術(shù)語“人抗體”不預(yù)期包括其中來源于另一種 哺乳動(dòng)物物種例如小鼠種系的CDR序列已嫁接到人構(gòu)架序列上的抗體。如本文使用的，術(shù)語“重組人抗體”預(yù)期包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分 離的所有人抗體，例如使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體(在下文部分 II C中進(jìn)一步描述)，從重組、組合人抗體文庫中分離的抗體(Hoogenboom H. R.，(1997) TIB Tech. 15 :62-70 ；Azzazy H.和 Highsmith W. E.，(2002)Clin. Biochem. 35 :425-445 ； Gavilondo J. V.和 Larrick J. W. (2002)Bio Techniques 29 :128-145 ；Hoogenboom H.和 Chames P. (2000) Immunology Today 21 :371-378)，從對(duì)于人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的 動(dòng)物(例如小鼠)中分離的抗體(參見^Taylor，L. D.等人，(1992)Nucl. Acids Res. 20 6287-6295 ；Kellermann S-A.禾口 Green L. L. (2002)Current Opinion in Biotechnology 13 :593-597 ；Little Μ.等人，(2000) Immunology Today 21 :364-370)，或通過包括使人免 疫球蛋白基因序列與其他DNA序列剪接的任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。此 種重組人抗體具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案 中，對(duì)此種重組人抗體實(shí)施體外誘變(或，當(dāng)使用對(duì)于人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì) 胞誘變)，且因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是，盡管來源于人種系VH和VL序列 且與人種系VH和VL序列相關(guān)，但可能在體內(nèi)的人抗體種系譜內(nèi)非天然存在的序列。“親和力成熟的”抗體是在其一個(gè)或多個(gè)CDRs中具有一種或多種改變的抗體， 與沒有這些改變的親本抗體相比較，所述改變導(dǎo)致抗體對(duì)抗原的親和力改善。示例性 的親和力成熟的抗體將對(duì)靶抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗 體通過本領(lǐng)域已知的程序來產(chǎn)生。Marks等人，BidlTechnology 10 :779-783 (1992)描 述了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力成熟。CDR和/或構(gòu)架殘基的隨機(jī)誘變由下述 描述Barbas 等人，Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813(1994) ；Schier 等人，Gene 169 :147-155(1995) ；Yelton 等人，J. Immunol. 155 :1994-2004(1995) Jackson 等人， J. Immunol. 154(7) :3310-9(1995) ；Hawkins 等人，J. Mol. BioL 226 :889-896(1992)以及如 美國專利US6914U8B1中所述的由活性增強(qiáng)氨基酸殘基在選擇性誘變位置、接觸或高變位 置的選擇性突變。 術(shù)語“嵌合抗體，，指包含來自一個(gè)物種的重和輕鏈可變區(qū)序列以及來自另一個(gè)物 種的恒定區(qū)序列的抗體，例如具有與人恒定區(qū)連接的鼠重和輕鏈可變區(qū)的抗體。
術(shù)語“CDR嫁接的抗體”指包含來自一個(gè)物種的重和輕鏈可變區(qū)序列的抗體，但其 中VH和/或VL的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)域的序列用另一個(gè)物種的CDR序列替換，例如具有鼠重和輕鏈可變區(qū)的抗體，其中一個(gè)或多個(gè)鼠⑶Rs (例如，⑶R3)已用人⑶R序列替換。術(shù)語“人源化抗體”指包含來自非人物種(例如，小鼠)的重和輕鏈可變區(qū)序列的 抗體，但其中至少部分VH和/或VL序列已改變成更“人樣”，即更類似于人種系可變序列。 一種類型的人源化抗體是CDR嫁接的抗體，其中將人CDR序列引入非人VH和VL序列以替 換相應(yīng)的非人CDR序列。術(shù)語“人源化抗體”也是抗體或其變體、衍生物、類似物或片段，其 與目的抗原免疫特異性結(jié)合，且包含基本上具有人抗體的氨基酸序列的構(gòu)架(FR)區(qū)、和基 本上具有非人抗體的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。如此處使用的，在CDR上下文中的 術(shù)語“基本上，，指具有的氨基酸序列至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 % 或至少99%等同于非人抗體⑶R的氨基酸序列的⑶R。人源化抗體包含基本上所有至少一 個(gè)、且一般為2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(Fab、Fab'、F(ab' )2、FabC, Fv)，其中所有或基本上所有 CDR區(qū)對(duì)應(yīng)非人免疫球蛋白(即，供體抗體)的那些，且所有或基本上所有構(gòu)架區(qū)是人免疫 球蛋白共有序列的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體也包含至少部分免疫球蛋白恒定 區(qū)(Fe)，一般為人免疫球蛋白的那種。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈以及至少重 鏈的可變結(jié)構(gòu)域?？贵w還可以包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3、和CH4區(qū)。在一些實(shí)施方案 中，人源化抗體只包含人源化輕鏈。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體只包含人源化重鏈。在 具體實(shí)施方案中，人源化抗體只包含輕鏈的人源化可變結(jié)構(gòu)域和/或人源化重鏈。術(shù)語“Kabat編號(hào)”、“Kabat定義”和“Kabat標(biāo)記”在本文中可互換使用。本領(lǐng) 域公認(rèn)的這些術(shù)語指氨基酸殘基編號(hào)系統(tǒng)，所述氨基酸殘基比抗體或其抗原結(jié)合部分的重 和輕鏈可變區(qū)中的其他氨基酸殘基更可變(即高變)(Kabat等人，(1971)Arm.NY Acad, Sci. 190 :382-391 禾口 Kabat, Ε· Α.等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH
發(fā)明者C·A·庫夫, C·吳, H·J·艾倫, L·M·奧爾森, M·胡古寧, P·C·伊薩克森, R·V·卡馬思, T·哈于爾 申請(qǐng)人:雅培制藥有限公司